巨杉健康和感病葉片表面微生物組成和多樣性比較

岳雪華, 范深厚, 杜雪柯， 胡嘉琪， 張 揚, 李媛媛,3

(1.華東師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200241；2.湖北省利川市林業(yè)科學(xué)研究所， 湖北 利川 445400；3.上海市崇明生態(tài)研究院，上海 200062)

人類活動引發(fā)的生境破壞、環(huán)境污染等問題導(dǎo)致了疾病傳播概率增加、感染范圍擴大，成為威脅生物多樣性的主要因素之一[1].由于受到各種病原菌的侵害，植物個體容易死亡、種群衰退、農(nóng)作物減產(chǎn)，進而對植物群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生不利影響[2].例如栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)是栗樹的致病真菌，1904年在美國紐約首次發(fā)現(xiàn)，不到50年里幾乎摧毀了美國全境超過30億株的美洲栗(Castaneaamericana)，最終導(dǎo)致該物種滅絕[3,4].3種兼性厭氧的歐式桿菌Erwiniacarotovorasubsp.carotovora、Erwinia.carotovorasubsp.atroseptica和Erwinia.chrysanthemi會導(dǎo)致土豆軟腐病，該類細菌通過產(chǎn)生大量導(dǎo)致細胞壁降解的酶侵蝕植物，致使軟腐病泛濫[5].半知菌亞門的灰梨孢(Pyriculariagrisea)侵染水稻導(dǎo)致稻瘟病，在我國乃至全世界都廣泛流行，該病菌使水稻減產(chǎn)約10%～15%[6].由細菌、真菌等微生物引起的許多植物病害，不僅對植物生長不利，而且也對社會造成巨大經(jīng)濟損失.

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，環(huán)境微生物群落分析愈加成熟，該技術(shù)通過獲得大量DNA序列以鑒定傳統(tǒng)培養(yǎng)方法難以發(fā)現(xiàn)或低豐度的微生物種類，更加準確、全面地反映環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)，對植物病害的預(yù)防和防治有重要指導(dǎo)意義.應(yīng)用高通量測序真菌ITS區(qū)域，對患葉斑病的枇杷(Eriobotryajaponica)葉片進行真菌群落的組成和多樣性分析，發(fā)現(xiàn)Epicoccumnigrum是枇杷葉斑病的主要致病菌[7].高通量測序細菌16s rRNA區(qū)域發(fā)現(xiàn)感病土豆植株中芽孢桿菌屬(Bacillus)在根際細菌中占優(yōu)勢，相對豐度明顯比健康植株高，而溶桿菌屬(Lysobacter)在健康植株的土壤中則相對較多[8].

巨杉(Sequoiadendrongiganteum)是杉科(Taxodiaceae)巨杉屬(Sequoiadendron)的唯一現(xiàn)存樹種，高大喬木，具有重要的系統(tǒng)發(fā)育地位，野生個體只分布于美國西部的加利福尼亞州，中國部分地區(qū)有引種[9].調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國同時引自美國的杉科樹種中，巨杉成活率較低，引種的巨杉幼樹在生長過程中，多數(shù)植株中上部有葉片和小枝干燥發(fā)黃現(xiàn)象，并最終導(dǎo)致巨杉幼樹死亡.我國對其系統(tǒng)發(fā)育地位[10]和形態(tài)學(xué)等方面的研究較多[11]，未見其病害的相關(guān)研究.本研究探討巨杉葉片表面微生物的組成和多樣性，檢驗巨杉黃葉現(xiàn)象是否與菌群有關(guān)，采用高通量測序技術(shù)比較健康和感病葉片表面的微生物群落的種類和多樣性，比較細菌和真菌組成差異，鑒別出與巨杉感病相關(guān)的可能致病菌，以期對防治病原菌侵染提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 巨杉葉片表面微生物收集

2016年8月于湖北省利川市林業(yè)科學(xué)研究所采集引種的巨杉葉片，共3株幼樹，高度約50 cm，種植于林業(yè)科學(xué)研究所野外試驗樣地內(nèi).每個植株的中上部都有黃色感病葉片，下半部分多為綠色健康葉片，分別采集每株的健康葉片(編號為G)和感病葉片(編號為Y)，及時保存于-72 ℃，以便提取葉片表面微生物總DNA，供后續(xù)試驗分析.

將巨杉鱗狀鉆形葉片與小枝相連處剪開，使葉片分散，將3株幼樹的健康葉片和感病葉片混合，然后分別各稱取40 g，放在滅菌的磷酸鹽緩沖液中置于搖床上振蕩30 min，隨后通過過濾、離心收集葉片表面微生物沉淀[12].

1.2 微生物總DNA提取、檢測

采用細菌DNA試劑盒提取葉片表面微生物總DNA，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.3 高通量測序

細菌16S rRNA基因V4-V5區(qū)測序在Illumina MiSeq平臺進行，采用通用引物515F和907R[13]，測序片段約400 bp.真菌ITS測序在Roche 454 GS FLX+平臺進行，擴增采用引物ITS4和ITS5[14]，片段約500 bp.測序由上海派森諾公司完成.

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 數(shù)據(jù)整理與篩選 根據(jù)index信息提取有效序列，運用Qiime v.1.17[15]過濾，采用uchime_ref[16]去除嵌合體序列，獲得優(yōu)質(zhì)序列.

1.4.2 OTU聚類及注釋 操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)旨在區(qū)分不同細菌DNA序列間的差異大小[17]，按照相似性將序列分歸為不同的分類單元，1個單元為1個OTU，通常以97%相似度計算.采用uclust方法[18]對優(yōu)質(zhì)序列按97%相似度聚類，blast方法比對，選擇置信度最高的結(jié)果，統(tǒng)計樣品OTU數(shù)量和注釋信息，去除豐度值低于測序總量0.001%的OTU.Silva (Release 115 http://www.arb-silva.de)[19]和Unite (Release 5.0 http://unite.ut.ee/index.php)[20]數(shù)據(jù)庫分別為細菌和真菌注釋.分類時，用“No Rank”表示沒有科學(xué)名稱的中間等級；用“Unclassified”表示置信度低于閾值的分類級別.

1.4.3 稀釋曲線 從樣本中隨機抽取序列預(yù)測不同測序深度下物種豐富度，獲得稀釋曲線，使用Origin 2017繪制.

1.4.4 OTU維恩圖 對OTU數(shù)目做樣本間維恩圖，顯示樣本特有和共有的OTU數(shù)量.

1.4.5 Alpha多樣性指數(shù) 使用Chao1/Ace指數(shù)估計群落的物種豐富度，數(shù)值越大表明豐富度越高；使用Simpson′s Index of Diversity(1-D)和Shannon指數(shù)反映群落豐富度和均勻度，數(shù)值越大多樣性越高.采用mothur軟件計算4種生物多樣性指數(shù)[21].

1.4.6 系統(tǒng)發(fā)育樹 用GraPhlAn軟件[22]繪制基于物種和豐富度信息的結(jié)構(gòu)圖，結(jié)果不僅可表示各物種進化關(guān)系，同時各節(jié)點大小反映物種豐富度情況.

1.4.7 群落物種組成及豐富度差異分析 在門和屬分類水平上繪物種分布直方圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 序列篩選和OTU聚類

表1 序列篩選及OTU聚類結(jié)果1)Table 1 Result of trimmed sequences and OTU analysis

1)G：健康葉片；Y：感病葉片.

通過高通量測序得到健康葉片(G樣品)表面的細菌和真菌有效序列分別為37 564和8 295條，篩選后得到的優(yōu)質(zhì)序列為34 586和6 244條，序列應(yīng)用率為92.07%和75.27%(表1).感病葉片(Y樣品)表面的細菌和真菌有效序列分別為58 556和7 141條，篩選后得到的優(yōu)質(zhì)序列為53 018和5 482條，序列應(yīng)用率達到90.54%和87.80%.兩樣品細菌的序列應(yīng)用率都高于90%，真菌的序列應(yīng)用率也達到75%以上.

OTU聚類中G樣品細菌和真菌的OTU數(shù)分別為2 058和318個，Y樣品分別為1 497和167個.G樣品細菌和真菌OTU數(shù)約為Y樣品的1.4倍和1.9倍，表明健康葉片表面細菌和真菌的物種豐富度較高.

2.2 稀釋曲線

在相同的測序深度下，無論是細菌還是真菌，健康葉片包含的OTU數(shù)量都比感病葉片多(圖1)，在一定程度上反映健康葉片表面的微生物多樣性更高.

2.3 OTU維恩圖

兩樣品的細菌和真菌共有OTU分別為642個(占總發(fā)現(xiàn)OTU的22.04%)和100個(占總發(fā)現(xiàn)OTU的25.97%)，表明健康和感病葉片表面的細菌、真菌共有OUT較少(圖2).G樣品的細菌特有OTU為1 416個(68.80%)，真菌特有OTU為218個(68.55%).Y樣品的細菌特有OTU為855個(57.11%)，真菌特有OTU為67個(40.12%)，健康葉片表面細菌和真菌的特有OTU數(shù)量均多于感病葉片.

2.4 Alpha多樣性指數(shù)

Chao1和Ace指數(shù)預(yù)計G樣品真菌豐富度幾乎為Y樣品2倍，Simpson(1-D)和Shannon指數(shù)都表明G樣品相較Y樣品細菌和真菌多樣性都略高(表2).

2.5 系統(tǒng)發(fā)育進化樹

表2 Alpha多樣性指數(shù)1)Table 2 The Alpha diversity index

1)G：健康葉片；Y：感病葉片.

葉片表面細菌主要為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes).變形菌門細菌種類最多，主要分布在α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria).豐富度≥1%的主要分布在5個目中，分別為根瘤菌目(Rhizobiales)、鞘氨醇單胞菌目(Sphingomonadales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、Streptophyta目，4個科包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、甲基桿菌科(Methylobacteriaceae)，以及3個屬為腸桿菌屬(Enterobacter)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas).

真菌主要為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)，豐富度≥1%的物種主要有4個目分別為Capnodiales目、格孢腔目(Pleosporales)、柔膜菌目(Helotiales)、Sporidiobolales目，2個科包括小球殼科(Mycosphaerellaceae)和核盤菌科(Sclerotiniaceae).圖中還可以看出真菌中豐富度較高的主要是子囊菌門中的Uwebraunia屬、葡萄孢屬(Botrytis)，擔子菌門中的Tilletiopsis屬、擲孢酵母屬(Sporobolomyces).

2.6 群落物種組成及豐富度差異分析

2.6.1 門分類水平 G樣品細菌類群的優(yōu)勢菌群是變形菌門，數(shù)量占比高達68.90%，隨后依次為藍細菌/葉綠體(Cyanobacteria/Chloroplast，14.30%)、擬桿菌門(9.90%)和放線菌門(2.20%)(圖5).Y樣品細菌變形菌門也是優(yōu)勢門，占79.90%，此外數(shù)量較高的還有放線菌門(10.30%)、擬桿菌門(6.80%)和藍細菌/葉綠體(Cyanobacteria/Chloroplast，1.40%).感病葉片表面細菌在門水平上的組成與健康葉片相似，然而感病葉片表面放線菌門細菌占細菌總數(shù)量的比例比健康葉片高，健康葉片表面的藍細菌/葉綠體所占比例比感病葉片高.

G樣品真菌主要為子囊菌門(71.40%)和擔子菌門(27.90%)，這兩個門的真菌占總數(shù)量的99.30%，其余門的真菌及未知真菌共占總數(shù)量的0.70%.與G樣品類似，Y樣品真菌優(yōu)勢門也是子囊菌門(74.40%)和擔子菌門(25.50%)，兩個門占總數(shù)量的99.90%.

2.6.2 屬分類水平 G和Y樣品比例>1%且可分類的細菌主要是變形菌門的腸桿菌屬、假單胞菌屬和甲基桿菌屬，其中腸桿菌屬在Y樣品表面細菌總數(shù)量中所占比例(20.00%)明顯比G樣品高(6.80%)(圖6).放線菌門的短小桿菌屬(Curtobacterium)和擬桿菌門的金黃桿菌屬(Chryseobacterium)在Y樣品表面細菌總數(shù)量中所占比例(分別為7.60%和3.10%)比G樣品高(分別為0.80%和0.10%)，而Hymenobacter屬在G樣品表面細菌總數(shù)量中所占比例(5.70%)比Y樣品高(0.90%).其余各屬如鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、無毛螺旋體屬(Spirosoma)和新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)所占比例差異不明顯.

從圖6可以看出，G樣品表面真菌的優(yōu)勢屬是Uwebraunia屬(32.30%)，占表面真菌總數(shù)量的比例明顯比Y樣品(9.50%)高，Y樣品表面真菌的優(yōu)勢屬是葡萄孢屬(49.60%)，該屬數(shù)量幾乎占了感病葉片表面真菌的一半，比例明顯比G樣品(16.10%)高.其余各屬如莖點霉屬(Phoma)、Dissoconium屬、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)、擲孢酵母屬、Tilletiopsis屬、Auriculibuller屬、葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)所占比例差異不明顯.

3 討論

通過對比健康和感病葉片表面真菌情況表明，群落多樣性上，OTU總數(shù)在健康葉片上是感病葉片的1.9倍，健康葉片的多樣性指數(shù)約是感病葉片的2倍，健康葉片能維持較高的真菌多樣性.真菌群落組成上，健康葉片表面優(yōu)勢屬是Uwebraunia屬，含有比例約占總體的三分之一；但感病葉片子囊菌門葡萄孢屬(Botrytis)含量很高，占總數(shù)量的幾乎一半(49.60%)，遠遠多于健康葉片的16.10%.已知葡萄孢屬真菌包含20多個菌種，多數(shù)可以導(dǎo)致灰霉病，其中灰葡萄孢菌(Botrytis.cinerea)分布廣泛，影響最嚴重[23]，可侵染200多種雙子葉植物[24]，是多種作物如番茄(Lycopersiconesculentum)、草莓(Fragaria×ananassa)病害的常見真菌[25].但之前鑒別葡萄孢屬主要依靠寄主范圍和形態(tài)特征等，在2005年獲得該菌株全基因組序列后，認識到灰葡萄孢是復(fù)合種，此后又陸續(xù)報道了9個該屬的新種[26].其中新種卡羅來納葡萄孢(Bacopa.caroliniana)于2012年在美國南卡羅來納州黑莓(Rubusfruticosus)的灰霉病中發(fā)現(xiàn)，同時也在美國北卡羅來納州感染灰霉病的草莓果實上發(fā)現(xiàn)[27].在本研究中，高通量測序鑒定出感病巨杉葉片表面的該屬真菌均為卡羅來納葡萄孢一種，豐度占測得真菌總量的49.60%，而健康葉片該菌種只占16.10%，推測感病葉片表面高含量的卡羅來納葡萄孢與巨杉感病密切相關(guān)，導(dǎo)致葉片發(fā)黃進而整株枯死.

目前防治灰霉病多以化學(xué)方法，使用多菌靈(Carbendazim)、環(huán)酰菌胺(Fenhexamid)等殺菌劑.生物手段也廣泛使用，木霉菌屬(Trichoderma)和鏈霉菌屬(Streptomyces)對防治灰霉病具有較好的效果[28]，如使用哈茨木霉T39菌株和灰綠鏈霉菌(Streptomyces.griseovirides)取得了較好效果[29-30].鏈霉菌由于產(chǎn)生變構(gòu)霉素(tautomycin)和白肽霉素(albopeptin)等抗真菌物質(zhì)，能抑制灰霉病.此外，致力于篩選出能抵抗灰霉病菌的拮抗菌研究也越來越多[31-32].

通常認為，變形菌門是不同植物葉際細菌群落的主導(dǎo)類群[33]，本研究對于細菌類群的分析表明，變形菌門是優(yōu)勢門，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示主要包括α-變形菌綱和γ-變形菌綱.從細菌多樣性方面看，與真菌類似，健康葉片表面的細菌多樣性比感病葉片高，健康葉片表面能夠維持較高的細菌群落多樣性.從細菌組成上來看，變形菌門的腸桿菌屬、擬桿菌門的金黃桿菌屬以及放線菌門的短小桿菌屬細菌在感病葉片表面所占比例比健康葉片高.一般腸桿菌屬和金黃桿菌屬細菌不導(dǎo)致植物病害，但短小桿菌屬的萎蔫短小桿菌(Curtobacteriumflaccumfaciens)常常是植物致病菌，陳永芳等[34]研究表明，萎蔫短小桿菌的變種導(dǎo)致落葵(Malabarspinach)和糖甜菜(Betavulgaris)的細菌性葉斑病，但該屬是否為本研究巨杉的致病菌需進一步驗證.

本研究通過對比分析巨杉健康和感病葉片表面微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)健康葉片表面能夠維持更高的細菌和真菌群落多樣性，其中葡萄孢屬真菌B.caroliniana在感病巨杉葉片中的比例遠高于健康葉片.但試驗樣品測序時未分開建庫，可能致結(jié)果存有一定片面性.后續(xù)若要確定B.caroliniana是否與巨杉感病密切相關(guān)，還需要分離菌株進行侵染試驗.

致謝：感謝武漢大學(xué)李家儒教授在樣品采集上提供的幫助.