PM2.5通過(guò)NF-κB/NLRP3途徑促進(jìn)金黃色葡萄球菌肺炎的研究

黃佳偉，魯嫻嫻，崔海燕，張斌，陳鵬，楊少萍，楊旭，李睿,*

1.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430079 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院，武漢 430016

近年來(lái)，頻發(fā)的霧霾天氣使空氣污染問(wèn)題成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)，而霧霾空氣中的細(xì)顆粒物(PM2.5)，即直徑≤2.5 μm的顆粒物，因其含有多種重金屬以及多環(huán)芳烴等有害物質(zhì)，且粒徑小，可隨人的呼吸沉積于支氣管和肺泡中，因而可對(duì)呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生巨大危害[1]。

大量流行病學(xué)調(diào)查表明，PM2.5與多種呼吸道疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺癌的發(fā)生發(fā)展具有明顯的相關(guān)性[2-4]。其中PM2.5與肺炎發(fā)生的關(guān)系格外引人關(guān)注。據(jù)報(bào)道，空氣中PM2.5濃度增加可導(dǎo)致肺炎的住院率增加[5]。李玉榮等[6]進(jìn)行了合肥市大氣污染與肺炎門診量的時(shí)間序列研究，得出PM2.5濃度升高可能引起醫(yī)院肺炎日門診量增加。在肺炎中細(xì)菌性肺炎最為常見(jiàn)，而其中金黃色葡萄球菌肺炎的致死率高，治療費(fèi)用昂貴，且近年來(lái)耐甲氧西林金葡菌的出現(xiàn)使得金葡菌感染的治療和控制越來(lái)越難，已給大眾健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)嚴(yán)重危害[7]。因此，進(jìn)行動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)探討PM2.5在細(xì)菌性肺炎發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。

動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)側(cè)重從分子水平揭示環(huán)境污染物誘發(fā)相關(guān)疾病發(fā)病的機(jī)制，已有大量實(shí)驗(yàn)證明，PM2.5能夠引起肺部損傷[8]。核因子κB(NF-κB)是機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子之一[9]，已知包括過(guò)量的活性氧(ROS)、缺氧條件和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種因素都可活化NF-κB通路[10]。研究表明，PM2.5可以通過(guò)增強(qiáng)NF-κB活性使肺部炎癥因子生成增多[11]。然而，關(guān)于NF-κB通路的上下游分子以及在具體肺炎模型中發(fā)揮的作用，仍需要進(jìn)一步探究。作為目前研究最多的一類炎性小體，NLRP3的表達(dá)受到NF-κB的調(diào)控[12]。它由病原識(shí)別受體NLRP3、接頭蛋白ASC和效應(yīng)蛋白procaspase-1組成[13]。NLRP3被活化后可激活caspase-1，進(jìn)而促進(jìn)白細(xì)胞介素1(IL-1)家族細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素18(IL-18)和白細(xì)胞介素33(IL-33)的成熟和分泌，導(dǎo)致組織局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[14]。Rho蛋白A(RhoA)是Rho-GTP酶家族的小分子量G蛋白成員之一，Rho激酶(ROCK)是RhoA的下游目標(biāo)分子之一[15]。已知RhoA/ROCK通路參與前炎性因子產(chǎn)生過(guò)程[16]，在炎癥發(fā)生過(guò)程中，RhoA可能充當(dāng)NF-κB通路上游的調(diào)控分子[17]。近期有研究以人肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)為材料，證明工業(yè)PM2.5可能通過(guò)活化RhoA/ROCK通路，進(jìn)而激活NF-κB引起肺部炎癥[18]，但仍缺乏體內(nèi)水平的證據(jù)。

本研究以Balb/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)不同濃度的PM2.5暴露，同時(shí)建立金黃色葡萄球菌肺炎模型，以探究PM2.5在細(xì)菌性肺炎發(fā)生發(fā)展中的作用以及其中存在的分子機(jī)制，為與PM2.5相關(guān)的肺炎疾病提供防治基礎(chǔ)與依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用約5周齡的SPF級(jí)雄性Balb/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，購(gòu)自湖北省三峽大學(xué)。將小鼠飼養(yǎng)在華中師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心的SPF級(jí)環(huán)境中，條件為12 h:12 h光/暗周期，溫度20～25℃，濕度50%～70%。隨時(shí)供給小鼠充足的飲水和飼料。適應(yīng)環(huán)境一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

主要實(shí)驗(yàn)試劑包括：金黃色葡萄球菌MRSA(StaphylococcusaureusMRSA)，購(gòu)自武漢大學(xué)菌種保藏中心；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA-熒光染料，99.9%)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；微量還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；小鼠TNF-α、IL-1β酶連免疫吸附試劑盒，購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；小鼠NF-κB p65、RhoA、ROCK1和NLRP3酶連免疫吸附試劑盒，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；Trizol(99%)，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、液氮、TBA和TCA，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；Mueller-Hinton瓊脂和MH肉湯，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：空氣/智能TSP綜合采樣器(嶗應(yīng)2050型)，細(xì)菌搖床(THZ320，武漢大風(fēng))，恒溫培養(yǎng)箱(HP400S，武漢瑞華)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2D型，蘇州凈化)，熒光定量PCR儀(CFX96 Touch，美國(guó)BioRad)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(MTN-21，上海精密)，熒光酶標(biāo)儀(FLx800型，美國(guó)Bio-Tek)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(DNM-9602型，北京普朗)，低溫冷凍離心機(jī)(Eppendorf-514R)等。

1.3 PM2.5收集和預(yù)處理

PM2.5收集在華中師范大學(xué)某建筑物樓頂(高約10 m)進(jìn)行，采用PM2.5采樣器，石英纖維濾膜收集。采樣后將含有PM2.5的濾膜裁剪后浸入去離子水中，超聲振蕩并過(guò)濾取濾液于-80 ℃冷凍。過(guò)夜后置于冷凍真空干燥機(jī)中凍干至粉末狀，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩M2.5染毒前，用無(wú)菌生理鹽水配制成相應(yīng)濃度的懸液。

1.4 PM2.5暴露濃度設(shè)置

世界衛(wèi)生組織(WHO)確定的人日均PM2.5暴露的限值為25 μg·m-3[19]，小鼠每日潮氣量為0.035 m3，體重按20 g計(jì)算，則25×0.035/0.02 ≈ 50 μg·kg-1，因此，確定暴露低濃度為0.05 mg·kg-1，10倍等比往上確定中、高濃度依次為0.5和5 mg·kg-1，高濃度PM2.5(5 mg·kg-1)與相關(guān)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的所設(shè)置的濃度相當(dāng)[20]。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組與暴露方案

將42只Balb/c小鼠隨機(jī)分成6組，每組7只，分別為：A. 生理鹽水對(duì)照；B. 5 mg·kg-1PM2.5；C. 肺炎模型；D. 肺炎模型+0.05 mg·kg-1PM2.5；E. 肺炎模型+0.5 mg·kg-1PM2.5；F.肺炎模型+5 mg·kg-1PM2.5。PM2.5采用氣道滴注的方式染毒，每天10:00進(jìn)行，持續(xù)7 d。在第7天16:00時(shí)進(jìn)行金黃色葡萄球菌滴鼻，構(gòu)建肺炎模型。

人們往往是先接觸PM2.5再得肺炎，而且考慮到肺炎模型建立后小鼠可能的死亡及傳染性，為更好地模擬現(xiàn)實(shí)情況，本實(shí)驗(yàn)采用先暴露PM2.5再建模的方式進(jìn)行。

1.6 金黃色葡萄球菌培養(yǎng)與肺炎模型建立

取金黃色葡萄球菌菌株凍存管，用MH瓊脂平板復(fù)蘇，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落接種于MH液體培養(yǎng)基，37 ℃、210 r·min-1震蕩過(guò)夜培養(yǎng)約8 h。離心收集菌體，用生理鹽水洗滌并重懸菌體。采用分光光度計(jì)檢測(cè)菌液的OD600，并按照1 OD = 2×109CFU·mL-1計(jì)算細(xì)菌濃度。最終給每只小鼠滴鼻濃度為5×1010CFU·mL-1的菌液50 μL，分2次進(jìn)行，間隔30 min。為保持菌液的活性，菌液收集于PM2.5暴露的最后一天，即給小鼠滴鼻接種的當(dāng)天進(jìn)行。

1.7 肺組織勻漿制備

在PM2.5暴露周期結(jié)束后，即實(shí)驗(yàn)的第8天，麻醉小鼠后取肺組織，于PBS(pH 7.5)中漂洗，以去除表面血跡。在濾紙上拭干，稱重，加入一定量PBS(pH 7.5)，用玻璃勻漿器在冰上制成10%的組織勻漿，將勻漿液離心(10 000 r·min-1、10 min、4 ℃)，取上清，將上清液分裝后凍存于-80 ℃冰箱，用于指標(biāo)的測(cè)定。

1.8 肺泡灌洗液中菌落計(jì)數(shù)與炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)

采用體全肺灌洗法獲得小鼠肺泡灌洗液。小鼠深度麻醉后，剝離氣管，氣管插管，將生理鹽水注入小鼠肺部，回吸液體即為肺泡灌洗液。離心并重懸于0.5 mL生理鹽水中，取其中0.1 mL加入0.9 mL生理鹽水，即稀釋10倍，均勻涂于MH平板上，12 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)剩余0.4 mL重懸液進(jìn)行各類炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.9 各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

用分裝好的肺組織勻漿進(jìn)行各指標(biāo)的測(cè)定。活性氧簇(ROS)含量用DCFH-DA熒光法檢測(cè)，GSH含量采用GSH試劑盒測(cè)定，丙二醛(MDA)采用TCA法檢測(cè)，TNF-α、IL-1β、NF-κB p65、NLRP3、RhoA和ROCK1均采用ELISA試劑盒檢測(cè)。所有檢測(cè)嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求進(jìn)行。

1.10 肺組織病理學(xué)切片制備

肺組織病理切片的制備流程依次包含取材、固定、洗滌脫水、透明、石蠟包埋、切片粘片、脫蠟、染色、脫水、透明和封片等步驟。進(jìn)行蘇木精伊紅(HE)和Masson染色，評(píng)價(jià)小鼠肺組織病理學(xué)變化[21]。

1.11 熒光定量PCR

采用TRIzol法提取0.1 g肺組織中的RNA，之后用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(Vazyme)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。最后用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)試劑盒并按照其程序進(jìn)行qPCR檢測(cè)，考察NF-κB、NLRP3、RhoA、ROCK和β-actin(內(nèi)參)等基因的表達(dá)，基因的引物設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用Graphpad Prism 5.0軟件作圖。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)組間均值差異，之后用Tukey-檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析?！?”或“#”表示2組之間有顯著性差異(P<0.05)；“**”或“##”表示2組之間有顯著性差異(P<0.01)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 小鼠體重與臟體比變化

各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間體重變化如圖1所示，對(duì)照組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間體重穩(wěn)步增長(zhǎng)，而經(jīng)PM2.5暴露的小鼠體重的增長(zhǎng)均減緩，5 mg·kg-1PM2.5濃度組小鼠體重甚至呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。而在第7天建立肺炎模型后，各模型組的小鼠體重都明顯減小。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間小鼠體重變化注：1～7 d為PM2.5暴露期，第7天建立肺炎模型，第8天處死小鼠。5 PM2.5、0.5 PM2.5和0.05 PM2.5分別表示5、0.05和0.5 mg·kg-1劑量的PM2.5氣道滴注。Fig. 1 Changes in body weight of the mice during the experimentNote: the PM2.5 exposure was from 1 d to 7 d, the pneumonia model was established on the 7th day, and mice were sacrificed on the 8th day. 5 PM2.5, 0.5 PM2.5, and 0.05 PM2.5 represent 5, 0.5 and 0.05 mg·kg-1 doses of PM2.5 airway instillation, respectively.

如圖2所示，肺模組、5PM2.5組同對(duì)照組相比，小鼠肺臟體比都顯著增大(P<0.01)，表明肺部可能出現(xiàn)充血或水腫等情況。同時(shí)，經(jīng)金黃色葡萄球菌建模的各組中，隨著PM2.5濃度的升高，肺臟體比逐漸增大，且肺模+5PM2.5組與肺模組相比出現(xiàn)顯著差異(P<0.01)。這表明高濃度的PM2.5能使肺炎充血現(xiàn)象更加嚴(yán)重，而中低濃度則不明顯。

圖2 小鼠肺臟體比注：** 表示與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.01)，## 表示與肺炎模型組相比具有顯著差異(P<0.01),下同。Fig. 2 The ratio of lung weight to body weight of miceNote: ** means a significant difference compared with the control group (P<0.01); ## means a significant difference compared with the pneumonia model group (P<0.01). The same below.

2.2 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)菌落計(jì)數(shù)與炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)

為檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌模型的建立是否成功，在MH平板上進(jìn)行肺泡灌洗液涂板菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖3所示。各肺炎模型組(肺膜、肺膜+0.05 PM2.5、肺膜+0.5 PM2.5、肺膜+5 PM2.5)在平板上均長(zhǎng)出約1.2×105個(gè)菌落，而對(duì)照組與5 PM2.5組未長(zhǎng)出金黃色葡萄球菌菌落，表明肺炎模型成功建立。

圖3 小鼠肺泡灌洗液(BALF)中菌落計(jì)數(shù)Fig. 3 Colony count in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of mice

各組小鼠BALF中各類炎癥細(xì)胞數(shù)量如圖4所示，白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢(shì)基本一致，即表現(xiàn)為5 PM2.5組與對(duì)照組相比顯著增多(P<0.05)，而肺炎模型建立后炎癥細(xì)胞進(jìn)一步增多。肺模+5 PM2.5較5 PM2.5顯著增多(P<0.05)，而各肺炎模型組之間并無(wú)顯著差異。以上結(jié)果進(jìn)一步證明，肺炎模型成功建立，同時(shí)經(jīng)PM2.5暴露染毒使得小鼠肺部炎癥細(xì)胞增多，發(fā)生炎癥反應(yīng)。

圖4 小鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量注：* 表示與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05)，# 表示與肺炎模型組相比具有顯著差異(P<0.05)；下同。Fig. 4 Number of inflammatory cells in BALF of miceNote: * means a significant difference compared with the control group (P<0.05), # means a significant difference compared with the pneumonia model group (P<0.05). The same below.

2.3 病理學(xué)染色切片

肺組織HE染色結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，5PM2.5組與肺模組均出現(xiàn)了不同程度的氣道重塑現(xiàn)象。而經(jīng)PM2.5暴露的肺模組中，隨著PM2.5濃度的升高，氣道重塑現(xiàn)象愈發(fā)明顯，具體表現(xiàn)為嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)變化，包括氣道平滑肌增厚并出現(xiàn)向內(nèi)突起褶皺，氣道周圍的間質(zhì)組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸增多。結(jié)果表明，PM2.5不但直接造成肺部損傷，而且進(jìn)一步惡化肺炎引起的病理效應(yīng)。

圖5 小鼠肺組織HE染色Fig. 5 HE staining of lung tissue of mice

通過(guò)Masson染色來(lái)檢測(cè)肺組織纖維化程度，結(jié)果如圖6所示，在氣道重塑方面與HE染色結(jié)果呈現(xiàn)類似特征。在各肺炎模型組中伴隨著PM2.5暴露濃度的提升，氣道周圍被染成藍(lán)色的部分逐漸增多，即顯示纖維化程度逐漸升高。結(jié)果表明，PM2.5能夠進(jìn)一步加重肺組織的纖維化。

圖6 小鼠肺組織Masson染色Fig. 6 Masson staining of lung tissue of mice

2.4 氧化應(yīng)激水平檢測(cè)

通過(guò)ROS、MDA和GSH等典型指標(biāo)檢驗(yàn)小鼠肺部氧化應(yīng)激程度。如圖7所示，5 PM2.5組與對(duì)照組相比，ROS和MDA的含量都顯著提高(P<0.05)。同時(shí)肺炎模型建立后，隨著PM2.5濃度的升高，ROS和MDA的含量呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì)，且肺模+5 PM2.5組的ROS含量顯著高于肺模組(P<0.05)。另一方面，還原性物質(zhì)GSH的變化趨勢(shì)正好相反，即PM2.5暴露后GSH含量顯著下降(P<0.05)；而肺炎模型組中隨著PM2.5濃度的提高，GSH含量逐漸減少。以上結(jié)果均表明，PM2.5氣道滴注能使小鼠肺部發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激現(xiàn)象，同時(shí)也會(huì)加劇肺炎過(guò)程中出現(xiàn)的氧化損傷。

圖7 小鼠肺部氧化應(yīng)激水平注：ROS、MDA和GSH表示活性氧、丙二醛和還原型谷胱甘肽。Fig. 7 Oxidative stress level of mice lungNote: ROS, MDA, and GSH represent reactive oxygen species, malondialdehyde, and reduced glutathione, respectively.

2.5 相關(guān)信號(hào)蛋白的檢測(cè)

為探究PM2.5引起肺部損傷并促進(jìn)肺炎發(fā)生的具體機(jī)制，對(duì)NF-κB、NLRP3、RhoA和ROCK等信號(hào)蛋白進(jìn)行qPCR和ELISA檢測(cè)，分別從基因和蛋白層面進(jìn)行探究，結(jié)果如圖8所示。NF-κB的含量在PM2.5暴露和肺炎模型建立后與對(duì)照組相比均顯著上升(P<0.05)。同時(shí)隨著PM2.5濃度的提高，肺炎模型組中的NF-κB含量也逐步提升，而NF-κB的mRNA表達(dá)也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，進(jìn)一步印證這一改變。對(duì)于NLRP3，PM2.5暴露和肺炎模型建立后都呈現(xiàn)一定的上升趨勢(shì)，不過(guò)只有肺炎模型+5 PM2.5組與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)，相比而言，NLRP3在mRNA層面的改變更為明顯。而對(duì)于RhoA蛋白及其調(diào)控的下游分子ROCK，在PM2.5組和各肺炎模型組中，從mRNA和蛋白水平上均未檢測(cè)到明顯的變化趨勢(shì)，各組之間均無(wú)顯著性差異。

圖8 相關(guān)信號(hào)蛋白的檢測(cè)Fig. 8 Detection of related signal proteins

通過(guò)檢測(cè)炎癥因子IL-1β、TNF-α來(lái)反映小鼠肺部炎癥水平，結(jié)果如圖9所示。IL-1β、TNF-α的變化呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，在5 PM2.5染毒后，二者的含量顯著升高(P<0.05)，而肺炎模型組與對(duì)照組相比顯著上升(P<0.05)。另外，在各肺炎模型組中，隨著PM2.5濃度的增大，IL-1β和TNF-α的含量都逐步提升，并且肺模+5 PM2.5組與肺模組相比有顯著性差異(P<0.05)。以上結(jié)果更進(jìn)一步表明，PM2.5對(duì)于肺部炎癥的發(fā)生起到了明顯的促進(jìn)作用。

圖9 炎癥因子檢測(cè)Fig. 9 Detection of inflammatory factors

3 討論(Discussion)

3.1 PM2.5引起肺部損傷與加重肺炎的作用

大量研究已經(jīng)證實(shí)，PM2.5急性暴露能夠引發(fā)機(jī)體肺部損傷。本實(shí)驗(yàn)選用Balb/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，通過(guò)連續(xù)7 d進(jìn)行5 mg·kg-1劑量的PM2.5氣道滴注暴露染毒，發(fā)現(xiàn)小鼠的體重顯著下降，肺臟體比顯著升高，提示PM2.5引起肺部充血或水腫。肺泡灌洗液中淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量較生理鹽水對(duì)照組均顯著增多，且炎癥因子IL-1β、TNF-α的含量也明顯上升，表明PM2.5引起肺部炎癥損傷。另一方面，選用耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株作為病原微生物，采用一次性滴鼻的方式成功構(gòu)建金黃色葡萄球菌肺炎模型[22]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PM2.5暴露的建模組發(fā)生了更為嚴(yán)重的病理反應(yīng)，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，即隨著PM2.5濃度從0.05 mg·kg-1增加到5 mg·kg-1，肺炎程度逐步加重。此外，從病理學(xué)切片中可以看出，小鼠的肺氣道壁逐步增厚并皺縮、氣道重塑和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象愈發(fā)明顯，肺部纖維化程度也逐步加深。

3.2 PM2.5促病的分子機(jī)理——NF-κB信號(hào)通路

NF-κB是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，能與多種細(xì)胞基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列的特定位點(diǎn)結(jié)合的核轉(zhuǎn)錄因子，它與炎癥反應(yīng)過(guò)程的密切相關(guān)性已被廣泛報(bào)道[23]。本研究中，通過(guò)qPCR和ELISA的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在mRNA和蛋白水平上，小鼠NF-κB的含量在PM2.5暴露和肺炎模型建立后與對(duì)照組相比均顯著上升，同時(shí)隨著PM2.5暴露濃度的加大，肺炎模型組中NF-κB含量也逐步提升。這表明，在PM2.5導(dǎo)致肺損傷以及加重肺炎的過(guò)程中NF-κB被活化，NF-κB信號(hào)通路在該過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

3.3 NF-κB被激活的原因

氧化應(yīng)激是由機(jī)體氧化和抗氧化水平失衡引起的[24]。氧化系統(tǒng)中的主要成分ROS會(huì)攻擊生物膜和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的不飽和脂肪酸等易被氧化的位置，脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中產(chǎn)生的MDA會(huì)對(duì)機(jī)體造成巨大損傷[25]，而GSH的減少則意味著機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的減弱，無(wú)法發(fā)揮清除氧自由基的作用[26]。本研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠在PM2.5暴露后肺部的ROS、MDA含量顯著下降，同時(shí)GSH含量顯著上升，這表明小鼠肺部出現(xiàn)顯著的氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激刺激可以直接激活NF-κB信號(hào)分子，進(jìn)而誘導(dǎo)下游的炎癥反應(yīng)[27]。

RhoA/ROCK信號(hào)通路是體內(nèi)普遍存在的一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子包括Rho-GTP酶、ROCK和肌球蛋白磷酸酶。其中RhoA是Rho家族的Rho亞族中的一個(gè)重要的成員，活化的RhoA可激活其靶蛋白R(shí)ho激酶，即ROCK(Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶)。ROCK接受RhoA傳遞的活化信號(hào)后可介導(dǎo)其下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應(yīng)，進(jìn)而影響多種細(xì)胞效應(yīng)[28]。研究表明，RhoA/ROCK途徑可調(diào)節(jié)NF-κB從而加劇炎癥反應(yīng)[29]。最近Yan等[18]對(duì)人肺上皮細(xì)胞進(jìn)行PM2.5染毒，發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK通路被活化，進(jìn)而激活NF-κB引起肺部炎癥。然而在本研究中，發(fā)現(xiàn)小鼠在PM2.5暴露和金黃色葡萄球菌肺炎模型建立后RhoA、ROCK的表達(dá)水平在mRNA和蛋白層面較對(duì)照組均無(wú)顯著改變。因此，筆者認(rèn)為在PM2.5加重肺炎的過(guò)程中NF-κB的激活主要是由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的，而關(guān)于RhoA/ROCK通路在其中發(fā)揮的作用則有待進(jìn)一步探究。

3.4 NF-κB下游分子事件NLRP3

炎癥小體是由胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體參與組裝的多蛋白復(fù)合物，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，NLRP3炎癥小體在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過(guò)程中具有重要作用，而NF-κB信號(hào)是NLRP3被激活的必要前提[30]。本研究結(jié)果表明，在PM2.5加重肺炎過(guò)程中，隨著NF-κB的激活，NLRP3也隨之被活化。而在NLRP3被活化后，又會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白Caspase-1和炎癥因子IL-1β的表達(dá)，從而加劇機(jī)體炎癥反應(yīng)[31]。本研究中發(fā)現(xiàn)IL-1β的水平在PM2.5暴露后顯著提高，進(jìn)一步證明了NLRP3在此過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

本研究結(jié)果表明，Balb/c小鼠經(jīng)5 mg·kg-1PM2.5暴露7 d后小鼠體重明顯下降，肺部出現(xiàn)顯著病理?yè)p傷；更為重要的是，PM2.5暴露對(duì)于金黃色葡萄球菌肺炎起到了明顯的促進(jìn)作用，在0.05～5 mg·kg-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，加劇氣道重塑、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及肺纖維化。PM2.5暴露使肺部出現(xiàn)了氧化應(yīng)激效應(yīng)，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路，活化炎癥小體NLRP3，導(dǎo)致炎癥因子TNF-α、IL-1β表達(dá)升高，最終惡化了金黃色葡萄球菌肺炎。