細(xì)胞外囊泡在缺血再灌注損傷治療中作用的研究進(jìn)展*

王 姝 韓正學(xué)

臨床上我們經(jīng)常見到因腫瘤切除及外傷造成的大面積組織缺損需要游離皮瓣修復(fù)的患者，游離皮瓣可以很好地恢復(fù)患者的容貌及功能。血管化的游離皮瓣移植術(shù)后皮瓣組織血運(yùn)障礙、水腫及壞死等并發(fā)癥時(shí)常發(fā)生，其主要原因是缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion Injury,IRI)指在血流灌注不足到再灌注早期重新獲取氧供應(yīng)的過程中，組織或器官的組織損傷和病理變化的總稱。研究證實(shí)缺血再灌注會(huì)導(dǎo)致組織產(chǎn)生大量的氧自由基和炎性因子等，使細(xì)胞發(fā)生凋亡或者壞死，進(jìn)而造成組織損傷，引起功能障礙甚至喪失生理功能[1-3]。目前治療此類損傷的主要方法是以減少氧自由基和炎性因子的產(chǎn)生為出發(fā)點(diǎn)，但治療效果不明顯。因此，進(jìn)一步探索新的治療方法對(duì)臨床工作具有重要意義。

細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞分泌的雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的顆粒，最初被認(rèn)為是細(xì)胞排出的多余物質(zhì)。直到20世紀(jì)90 年代，學(xué)者們才意識(shí)到這些細(xì)胞外囊泡攜帶膽固醇等脂類物質(zhì)，富含多種生物活性物質(zhì)，參與細(xì)胞存活與凋亡、血管新生、血栓形成、炎癥免疫反應(yīng)等生理和病理過程[4]。細(xì)胞外囊泡主要存在于血液、淋巴液、唾液、尿液、乳汁等各種體液[5]。幾乎所有的細(xì)胞都可自發(fā)產(chǎn)生或在一定刺激下釋放細(xì)胞外囊泡[6]。因此，了解細(xì)胞外囊泡對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制十分重要。本文就細(xì)胞外囊泡對(duì)缺血再灌注損傷保護(hù)作用方面的研究進(jìn)行綜述，以期為治療游離皮瓣移植術(shù)后血管危象提供新思路。

1.細(xì)胞外囊泡

細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞分泌的雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡，實(shí)質(zhì)上是一組納米級(jí)顆粒。細(xì)胞外囊泡可分為外泌體、微囊泡、凋亡小體[7]。外泌體分子直徑30～100nm，在細(xì)胞內(nèi)部形成，分泌方式特殊[8]。微囊泡也稱脫落囊泡或Ectosomes，分子直徑100～1000nm，是直接通過出芽方式從母細(xì)胞膜表面脫落產(chǎn)生。凋亡小體分子直徑為500～4000nm，是細(xì)胞程序性死亡或凋亡晚期釋放的微粒。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等多種細(xì)胞可以分泌細(xì)胞外囊泡，而細(xì)胞外囊泡在干細(xì)胞發(fā)揮促修復(fù)功能中起到重要作用[9,10]。細(xì)胞外囊泡中的外泌體和微囊泡在缺血再灌注損傷治療中的保護(hù)作用被大量研究證實(shí)。

2.MSCs 來源細(xì)胞外囊泡在缺血再灌注損傷治療中的作用

2.1 MSCs 來源細(xì)胞外囊泡對(duì)心臟損傷的保護(hù)作用 間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是成體干細(xì)胞的一種,由于其自我更新、多向分化、靶向遷移、免疫調(diào)控、抗瘢痕以及抗凋亡等諸多重要的生理功能，使其在組織修復(fù)和再生方面被寄予厚望[11]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)低氧或低營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)后會(huì)分泌釋放細(xì)胞外囊泡[12]。Yoshihiro 和他的團(tuán)隊(duì)[13]研究發(fā)現(xiàn)MSC 分泌的外泌體通過增強(qiáng)肌肉發(fā)生和血管生成促進(jìn)肌肉再生，由miR-494等miRNAs 介導(dǎo)。有研究報(bào)道人來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能分泌外泌體，作用于缺血心肌后能夠改善心室的收縮及舒張功能，其對(duì)缺血再灌注心肌的保護(hù)作用可能通過減少氧化應(yīng)激以及抑制TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)[14]。Jose M 等[15]研究發(fā)現(xiàn)在所有測(cè)試的心臟缺血再灌注模型中，富含外泌體的部分具有強(qiáng)大的心臟保護(hù)作用，HSP70/TLR4 通路是外泌體介導(dǎo)心臟保護(hù)作用的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)MSCs來源的外泌體可減少心肌纖維化，并且促進(jìn)細(xì)胞增殖及血管新生，從而提升心肌干細(xì)胞的生存能力，改善心肌梗死后的心功能；該研究提出該保護(hù)機(jī)制可能和miRNA 相關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)缺血再灌注發(fā)生時(shí)，具有保護(hù)作用的Nanog 蛋白和缺氧誘導(dǎo)因子1α 水平升高，進(jìn)而上調(diào)miR-21 和miR-210，減少心肌細(xì)胞凋亡[16]。而誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分泌的外泌體可保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷；進(jìn)一步研究顯示，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的外泌體中包含miR-21 和miR-210，因此推測(cè)其保護(hù)作用可能是由miR-21 和miR-210 產(chǎn)生[10]。

2.2 MSCs 來源細(xì)胞外囊泡對(duì)腦損傷的保護(hù)作用 Daan R 等研究間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡(MSC-EV)在早產(chǎn)兒缺氧缺血性腦損傷的臨床前模型中的保護(hù)作用。他們通過閉塞臍帶使胎兒受到短暫的全面缺氧缺血后在子宮內(nèi)靜脈注射MSC-EVs治療，采用大腦電生理參數(shù)分析評(píng)估MSC-EV 的治療效果。發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡通過減少總發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時(shí)間，以及保持壓力感受器反射敏感性來改善腦功能。與此同時(shí)防止髓鞘降解的傾向[17]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)MSCs 等來源的外泌體對(duì)神經(jīng)損傷有保護(hù)作用。缺血再灌注腦組織損傷主要通過氧化應(yīng)激和炎性因子等造成，外泌體中含有抑制活性氧和炎癥的物質(zhì)，而且可以透過血腦屏障，可能能作為治療腦損傷的一種新途徑[18]。除了神經(jīng)元細(xì)胞，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他細(xì)胞也分泌外泌體。Guitart 等[19]發(fā)現(xiàn)星型膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體可以改善缺血條件下神經(jīng)元的存活能力，這種保護(hù)作用可能是通過減少氧化應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)的。Song等[20]研究發(fā)現(xiàn)M2 小膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體在體外和體內(nèi)被神經(jīng)元所占用。M2 小膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體治療減弱了缺氧-葡萄糖剝奪后神經(jīng)元的凋亡。體內(nèi)結(jié)果顯示，M2 小膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體治療可顯著減少短暫腦缺血3 天后的梗死體積和減輕行為缺陷。Xiao 等[21]研究證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體部分抑制了缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和凋亡，抑制了SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體直接保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受缺血再灌注損傷。

2.3 MSCs 來源細(xì)胞外囊泡對(duì)腎臟損傷的保護(hù)作用 Federica 等[22]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào)人MSCs 中的miRNA 后MSCs 及其分泌的細(xì)胞外囊泡的再生能力在腎臟中降低。這種效應(yīng)與細(xì)胞和細(xì)胞外囊泡的miRNA 組成發(fā)生變化有關(guān)。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)MSC 分泌的細(xì)胞外囊泡調(diào)節(jié)腎臟的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。NADPH 氧化酶(NOX)-2在缺氧再灌注損傷的大鼠腎臟中表達(dá)上調(diào)，但在靜脈給予MSC 分泌的細(xì)胞外囊泡的缺氧再灌注損傷的大鼠腎臟中表達(dá)未上調(diào)。這種干預(yù)不僅減輕氧化應(yīng)激，而且還減少細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)腎細(xì)胞增殖，表明腎受體細(xì)胞中的NOX2 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)可能涉及MSC 分泌的細(xì)胞外囊泡誘導(dǎo)的腎修復(fù)。Zhou 等[24]研究順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)分泌的細(xì)胞外囊泡減弱了腎小管細(xì)胞的氧化應(yīng)激、凋亡、壞死，減輕了腎功能障礙。腎修復(fù)效力的恢復(fù)主要依賴于富含間充質(zhì)干細(xì)分泌的細(xì)胞外囊泡中的蛋白質(zhì)。Faisal 研究證實(shí)MSCs 來源的外泌體對(duì)腎缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[25]。此外，ZOU 等[26]發(fā)現(xiàn)來源于人間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡通過抑制CX3CL1 改善大鼠腎臟缺血再灌注損傷。

3.MSCs 來源細(xì)胞外囊泡在游離皮瓣缺血再灌注損傷治療中的保護(hù)作用

近年,隨著顯微外科的發(fā)展，血管吻合技術(shù)應(yīng)用于游離皮瓣移植術(shù)，游離皮瓣在修復(fù)重建領(lǐng)域的作用越來越重要。血運(yùn)障礙即血管危象是游離皮瓣移植術(shù)后最常見的并發(fā)癥。延遲發(fā)現(xiàn)血管危象或出現(xiàn)更嚴(yán)重的血管危象，可導(dǎo)致游離移植組織瓣完全壞死，組織修復(fù)失敗。研究發(fā)現(xiàn)皮瓣在移植過程中處于缺血狀態(tài)，進(jìn)而氧自由基釋放，導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。受傷的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步釋放多種細(xì)胞因子，發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，誘發(fā)血小板凝集。炎癥反應(yīng)加重，毛細(xì)血管床堵塞，持續(xù)缺氧和能量化合物耗竭使內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，血管腔閉塞。血液淤積，內(nèi)皮細(xì)胞的纖溶活性喪失，因而凝血鏈被激活，皮瓣的微循環(huán)完全栓塞。

Bai 等[27]為了評(píng)估脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)的外泌體是否能在缺血再灌注損傷時(shí)保護(hù)皮瓣并誘導(dǎo)新生血管。通過結(jié)扎鼠左上腹下淺血管后再灌注血液，將來自正常的ADSC 外泌體和來自H2O2預(yù)處理的ADSC 外泌體注射到皮瓣中，觀察外泌體在皮瓣移植體內(nèi)缺血再灌注損傷中的作用。與缺血再灌注相比，外泌體在體內(nèi)顯著提高了皮瓣術(shù)后第5 天的存活率和毛細(xì)血管密度，降低了皮瓣的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。此外，與正常外泌體相比，H2O2預(yù)處理的ADSC 外泌體的療效更好。來自低氧處理的人ADSCs 的外泌體具有增強(qiáng)脂肪移植血管生成的能力，部分是通過調(diào)節(jié)VEGF/VEGF-r 信號(hào)實(shí)現(xiàn)的[28]。

4.小結(jié)

囊泡分泌是細(xì)胞的基本生命過程，這些囊泡包裹了小RNA、質(zhì)粒DNA、酶和神經(jīng)遞質(zhì)等。MSCs來源的外泌體和微囊泡在缺血再灌注損傷治療中的保護(hù)作用被學(xué)者關(guān)注。研究缺血再灌注損傷的機(jī)制，可以為治療游離皮瓣移植術(shù)后血管危象提供新思路。隨著近年來研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡還在纖維化、自噬、免疫抑制及免疫激活等多方面發(fā)揮作用[29-31]。細(xì)胞外囊泡雖存在廣泛，但獲取細(xì)胞外囊泡的量少、純度低，目前研究對(duì)細(xì)胞外囊泡發(fā)揮作用的具體成分及其分子機(jī)制尚不清楚，仍需要投入更多的時(shí)間和精力深入研究。