實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在慢性乙型肝炎患者血清標(biāo)本HBV DNA定量檢測中的應(yīng)用價值

張寧

(南陽市第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 南陽 473000)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是常見傳染性疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，CHB每年致100萬人死亡[1]。因此，臨床需加強(qiáng)CHB早期篩查，并動態(tài)監(jiān)測病情變化，以針對性干預(yù)治療，抑制病情進(jìn)展。肝活檢是臨床診斷和評估肝臟疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但其為介入性操作，存在一定創(chuàng)傷，可重復(fù)性差。HBV DNA能直接、客觀地反映HBV感染、復(fù)制活性，而熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)在密閉環(huán)境內(nèi)進(jìn)行，無需電泳，借助計(jì)算機(jī)自動定量分析，操作簡單，且能避免標(biāo)本污染。研究表明，在血液篩查中，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)能提高HBsAg陰性低濃度HBV感染者的檢出率[2]。本研究旨在探討實(shí)時FQ-PCR技術(shù)在CHB患者血清標(biāo)本HBV DNA定量檢測中的應(yīng)用價值，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年4月至2018年6月南陽市第二人民醫(yī)院收治的109例CHB患者作為研究組，同期81例HBV早期感染者作為對照組。研究組：男71例，女38例，年齡26～57歲，平均(41.48±6.13)歲，體質(zhì)量指數(shù)18.4～26.8 kg·m-2，平均(22.71±1.35)kg·m-2。對照組：男52例，女29例，年齡24～59歲，平均(42.08±5.97)歲，體質(zhì)量指數(shù)18.2～26.7 kg·m-2，平均(22.69±1.29)kg·m-2。兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①初次確診；②入組前6個月內(nèi)未經(jīng)抗HBV治療；③簽署同意書。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①丙型、甲型等其他類型肝炎；②自身免疫性疾病。

1.3 治療方法指導(dǎo)合理飲食、規(guī)律生活、適宜運(yùn)動，拉米夫定(中孚藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20133056)，口服，每次300 mg，每日1次。

1.4 檢測方法

1.4.1HBV DNA 以實(shí)時FQ-PCR技術(shù)測定HBV DNA。所需試劑盒、試劑由深圳匹基生物工程股份有限公司提供，F(xiàn)Q-PCR檢測儀由美國羅氏公司提供。晨空腹以非抗凝管取靜脈血3 mL，采取PEG沉淀法提取血清樣品，加熱裂解，取提取液2 μL做模板，依次以92 ℃、5 s，60 ℃、30 s，37 ℃、60 s，做40個循環(huán)，延伸結(jié)束，測F1通道熒光強(qiáng)度，反應(yīng)結(jié)束，采用FQ-PCR檢測儀自帶軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品檢測結(jié)果。血清HBV DNA陽性：HBV DNA水平≥5×102copies·mL-1。檢測結(jié)果采用絕對值的對數(shù)值進(jìn)行比較分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)臨界值、陰性、強(qiáng)陽性各1孔作為內(nèi)標(biāo)對照，同時采取5×107、5×106、5×105、5×104copies·mL-1陽性標(biāo)準(zhǔn)作為外標(biāo)。

1.4.2HBV DNA變異 向PCR反應(yīng)混合液內(nèi)加熒光標(biāo)記寡核苷酸探針，以熒光循環(huán)技術(shù)記錄熒光雜交探針溶解溫度，測HBV DNA變異情況。操作由相同資深專科醫(yī)生嚴(yán)格按規(guī)范完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，等級資料采用Ridit檢驗(yàn)，計(jì)量資料采取Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)與Bartlett方差齊性檢驗(yàn)，均確認(rèn)近似服從正態(tài)分布且方差齊性，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入院首次兩組HBV DNA表達(dá)水平入院首次檢測，研究組HBV DNA表達(dá)水平為(7.21±1.03)copies·mL-1，對照組HBV DNA表達(dá)水平為(3.49±1.28)copies·mL-1。研究組HBV DNA表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.184，P<0.001)。

2.2 研究組HBV DNA表達(dá)水平治療前HBV DNA表達(dá)水平為(7.21±1.03)copies·mL-1，治療后3個月HBV DNA表達(dá)水平為(3.49±0.98)copies·mL-1，治療后6個月HBV DNA表達(dá)水平為(2.81±0.76)copies·mL-1，治療后9個月HBV DNA表達(dá)水平為(2.79±0.80)copies·mL-1。經(jīng)單因素方差分析，治療后3、6、9個月HBV DNA表達(dá)水平對比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=602.257，P<0.001)；兩兩對比，治療后6、9個月HBV DNA表達(dá)水平低于治療后3個月，治療后3個月低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 研究組HBV DNA變異率治療前研究組HBV DNA變異率為0，治療后3個月研究組HBV DNA變異率為0，治療后6個月為11.93%(13/109)，治療后9個月為20.18%(22/109)，不同時間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.087，P<0.001)。治療后 9個月HBV DNA變異率高于治療后6個月，治療后6個月高于治療后3個月、治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

我國屬于CHB高發(fā)地區(qū)，全國約1.3億HBV攜帶者，其中3 000萬以上為需積極治療現(xiàn)癥感染者。HBV感染后表現(xiàn)復(fù)雜，單純血清標(biāo)志物檢測難以準(zhǔn)確評估病毒復(fù)制活性，而外周血HBV DNA是病毒感染后復(fù)制最可靠、最直接的指標(biāo)，但常規(guī)PCR法操作復(fù)雜，污染物多，假陽性率較高，致使HBV DNA檢測臨床應(yīng)用受限[3-4]。

FQ-PCR是近年發(fā)展起來的一種新型PCR技術(shù)，其融合分子雜交、基因擴(kuò)增、熒光物理技術(shù)于一個整體，在封閉條件下實(shí)施基因擴(kuò)增、產(chǎn)物分析，同時借助微機(jī)控制實(shí)現(xiàn)自動分析及實(shí)時監(jiān)測，可補(bǔ)充常規(guī)PCR技術(shù)無法定量、易污染等弊端[5]。研究顯示，F(xiàn)Q-PCR法檢測HBV DNA能真實(shí)反映HBV感染及復(fù)制狀態(tài)，對CHB臨床診斷、治療方案制定、預(yù)后評估具有重要指導(dǎo)意義[6]。本研究顯示，入院首次檢測研究組HBV DNA表達(dá)水平高于對照組，與上述研究結(jié)論近似。此外，本研究采取FQ-PCR技術(shù)動態(tài)監(jiān)測CHB患者治療前、治療中HBV DNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，治療后6、9個月HBV DNA表達(dá)水平低于治療后3個月，治療后3個月低于治療前，提示系統(tǒng)性治療中FQ-PCR技術(shù)可實(shí)時反映病毒復(fù)制活性，可為臨床預(yù)后評估提供參考依據(jù)。有研究報(bào)道，CHB患者經(jīng)系統(tǒng)治療6個月以后，外周血HBV DNA表達(dá)水平未繼續(xù)降低，甚至有再次升高情況[7-8]。這與本研究拉米夫定治療6、9個月后血清HBV DNA水平無變化的結(jié)果一致。拉米夫定是一種新型強(qiáng)效抑制HBV復(fù)制核苷類藥物，具有服用方便、耐受性好等特點(diǎn)，相關(guān)研究表明，抗病毒治療中HBV會激活自身免疫逃逸機(jī)制，酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天門冬氨酸基因序列出現(xiàn)突變，對抗機(jī)體免疫攻擊行為，出現(xiàn)耐藥性，一旦出現(xiàn)耐藥性，拉米夫定不再敏感，可能會伴肝功能異常、HBV DNA定量反跳等情況[9-11]。因此，臨床在準(zhǔn)確評估HBV DNA復(fù)制活性的同時還需積極了解HBV變異性。本研究進(jìn)一步對比發(fā)現(xiàn)，治療后9個月HBV DNA變異率高于治療后6個月，治療后6個月高于治療后3個月、治療前，由此可知，隨著治療周期的延長，HBV DNA變異率呈升高趨勢，實(shí)時FQ-PCR技術(shù)能同時了解HBV DNA變異性，對臨床合理用藥，調(diào)整治療方案和進(jìn)一步提高治療效果具有積極意義。

綜上可知，實(shí)時FQ-PCR技術(shù)檢測血清標(biāo)本HBV DNA水平可客觀反映HBV感染、復(fù)制活性，可為臨床診斷、療效評估提供數(shù)據(jù)支持。