生物制劑和生物技術(shù)治療天皰瘡進(jìn)展

孫菲菲 楊寶琦

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院)，山東省皮膚病性病防治研究所，山東濟(jì)南，250022

天皰瘡(pemphigus)是一種抗原抗體結(jié)合導(dǎo)致的大皰性皮膚病。根據(jù)臨床及病理特征分為四型，即尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris, PV)，落葉型天皰瘡(pemphigus foliaceus, PF)，紅斑型天皰瘡(pemphigus erythematosus, PE)和增殖型天皰瘡(pemphigus vegenate)。天皰瘡治療包括局部治療和系統(tǒng)性治療。對(duì)于輕度且穩(wěn)定的天皰瘡，外用糖皮質(zhì)激素治療局限性皮損可減少系統(tǒng)性治療的不良反應(yīng)，表現(xiàn)出一定的療效。為了控制中重度天皰瘡患者病情進(jìn)展，根據(jù)個(gè)體化情況，及時(shí)開始系統(tǒng)性治療。目前系統(tǒng)性治療首選藥物是糖皮質(zhì)激素，常聯(lián)合應(yīng)用免疫抑制劑(如嗎替麥考酚酯、甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、氨苯砜、硫唑嘌呤等)。除此之外，對(duì)于難治性重癥患者，常加用輔助免疫療法，以挽救患者生命，主要包括：靜脈免疫球蛋白輸注(intravenous immunoglobulin, IVIG)、免疫吸附、血漿置換等。生物技術(shù)是利用生物體或其組成部分來產(chǎn)生有用物質(zhì)從而提供服務(wù)的技術(shù)，醫(yī)學(xué)應(yīng)用主要包括基因工程、細(xì)胞工程等。目前各種醫(yī)學(xué)生物技術(shù)治療方案不斷涌現(xiàn)，為治療甚至治愈天皰瘡帶來希望。本文綜述天皰瘡生物制劑及生物技術(shù)治療進(jìn)展。

1 利妥昔單抗(Rituximab, RTX)

RTX是一代抗CD20單抗，是應(yīng)用基因工程技術(shù)研制的人鼠嵌合抗體，以B淋巴細(xì)胞表面的CD20抗原為靶點(diǎn)，從而導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞的清除[1]。RTX在天皰瘡的治療中已有一定規(guī)模的實(shí)踐并且取得了良好的療效。從難治性天皰瘡的輔助治療到一線治療，RTX的效果得到了充分認(rèn)可。RTX 治療天皰瘡目前以淋巴瘤方案和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方案為主。淋巴瘤方案為每周靜脈滴注 RTX 375 mg/m2，連用4周；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎方案為每周靜脈滴注RTX 1000 mg，連用2周[2]。根據(jù)患者病情，第12、18個(gè)月可以再次使用500 mg。一項(xiàng)RTX聯(lián)合短期潑尼松與單獨(dú)潑尼松治療天皰瘡的前瞻性、多中心、開放的隨機(jī)試驗(yàn)結(jié)果顯示一線聯(lián)合RTX治療緩解率更高，不良事件更少[1]。應(yīng)用RTX后半年內(nèi)患者可停用潑尼松治療并且緩解維持時(shí)間明顯延長[1]。RTX一線治療天皰瘡的臨床研究發(fā)現(xiàn)臨床緩解情況與RTX劑量以及患者年齡等因素相關(guān)[3]。一項(xiàng)系統(tǒng)性回顧性研究分析了1085例RTX治療天皰瘡療效，結(jié)果顯示RTX具有良好的安全性和有效性，可以使天皰瘡患者獲得長期緩解，并且聯(lián)合IVIG或者免疫吸附等治療效果良好[4]。由于RTX對(duì)B淋巴細(xì)胞的作用無選擇性，且RTX為人鼠嵌合抗體，可能出現(xiàn)一定的不良反應(yīng)，主要包括過敏反應(yīng)，輸注反應(yīng)(如頭痛、血管性水腫、惡心、嘔吐、發(fā)熱、寒戰(zhàn))，感染風(fēng)險(xiǎn)等，進(jìn)行輸注時(shí)需進(jìn)行監(jiān)測(cè)。RTX臨床應(yīng)用廣泛，國際專家共識(shí)已推薦RTX為中重度天皰瘡患者一線治療方案[5]。

2 造血干細(xì)胞移植

造血干細(xì)胞移植是指應(yīng)用健康的造血干細(xì)胞，重建患者血液及免疫系統(tǒng)的治療方法[6]。根據(jù)造血干細(xì)胞來源，可分為自體和異基因造血干細(xì)胞移植。由于配型困難并且存在發(fā)生移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)風(fēng)險(xiǎn)，異基因造血干細(xì)胞移植在天皰瘡治療應(yīng)用較為受限。自體造血干細(xì)胞移植主要步驟包括造血干細(xì)胞動(dòng)員，造血干細(xì)胞采集，預(yù)處理和干細(xì)胞回輸[7-9]。常見的動(dòng)員方案包括環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)、利妥昔單抗、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)，ATG也常聯(lián)合應(yīng)用從而去除T細(xì)胞和B細(xì)胞[9]。移植前預(yù)處理方案常聯(lián)合應(yīng)用CTX、ATG和利妥昔單抗等，從而清除患者體內(nèi)異常免疫細(xì)胞，達(dá)到高度免疫抑制或免疫清除的目的[7，10]?；颊咦陨砻庖咔宄?，重新輸注的造血干細(xì)胞產(chǎn)生新的淋巴系和髓系的祖細(xì)胞，并在胸腺重新經(jīng)歷陽性和陰性選擇，產(chǎn)生自身免疫耐受的原始T淋巴細(xì)胞和Treg細(xì)胞，從而穩(wěn)定天皰瘡病情[11]。造血干細(xì)胞移植治療天皰瘡已有臨床實(shí)踐證實(shí)其可行性，并取得了滿意療效。2004年，國內(nèi)學(xué)者實(shí)現(xiàn)了國內(nèi)首次自體外周血純化CD34+造血干細(xì)胞移植治療難治性天皰瘡。移植后患者恢復(fù)良好，停用激素等其他治療，天皰瘡抗體轉(zhuǎn)陰，皮膚病理免疫熒光轉(zhuǎn)陰，效果佳。隨后進(jìn)行了更大規(guī)模的自體造血干細(xì)胞移植治療難治性天皰瘡試驗(yàn)，共納入12例天皰瘡患者，總生存率為91.6%，僅一例患者因胃腸功能障礙死亡，臨床完全緩解率(75%)較傳統(tǒng)治療高，且可停用糖皮質(zhì)激素治療[7]。國外研究發(fā)現(xiàn)在難治性PF患者，自體造血干細(xì)胞移植治療也取得了良好的療效，患者停用系統(tǒng)性糖皮質(zhì)激素治療且未復(fù)發(fā)[12]。其主要不良反應(yīng)是發(fā)熱和感染(細(xì)菌、敗血癥、病毒、真菌等)[7]。此外還可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高、過敏反應(yīng)和自身免疫性溶血等不良反應(yīng)，大多經(jīng)治療后可恢復(fù)。

造血干細(xì)胞移植作為一種新興的有效治療天皰瘡的生物技術(shù)，為復(fù)發(fā)難治的患者提供了希望，然而由于費(fèi)用昂貴、存在一定風(fēng)險(xiǎn)等因素，目前臨床病例數(shù)量仍相對(duì)較少，阻礙了對(duì)該方法進(jìn)一步的探究和推廣運(yùn)用。治療天皰瘡雖已臨床證實(shí)可行，但相關(guān)的基礎(chǔ)研究仍相對(duì)匱乏，并且目前尚無統(tǒng)一的納入標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化的治療方案，仍是存在的問題。因此需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證，建立一套完整的臨床指南，積極預(yù)防其可能發(fā)生的不良反應(yīng)，形成治療體系，有利于其進(jìn)一步發(fā)展。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞治療

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)可以自我更新，并向非間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，還可產(chǎn)生營養(yǎng)因子和生長因子等[13]。MSC來源廣泛，除骨髓外，亦可從幾乎所有的成體組織中分離培養(yǎng)，如胎盤、 臍帶、臍血及脂肪組織等[14]。間充質(zhì)干細(xì)胞具有低免疫原性，使其擁有免疫豁免權(quán)，能夠逃避免疫識(shí)別和清除，誘導(dǎo)免疫耐受[15，16]。MSC可抑制包括T、B淋巴細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞的增殖反應(yīng)，并影響免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用[17，18]。這些免疫特性對(duì)于治療自身免疫性疾病具有誘人的治療潛力。間充質(zhì)干細(xì)胞藥物如Prochymal，Remestemcel-L等已被批準(zhǔn)應(yīng)用于GVHD的治療[19，20]。2010年一例難治性天皰瘡患者進(jìn)行了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞輸注輔助治療，短期隨訪顯示效果可觀，患者皮損減輕，Dsg抗體減少，糖皮質(zhì)激素減量后皮損也未加重，長期隨訪尚未知[21]。

間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，具有免疫豁免，對(duì)移植前的免疫清除沒有嚴(yán)格要求，安全有效，臨床更易推廣。其最常見的并發(fā)癥為發(fā)熱及胃腸道癥狀，對(duì)癥處理后均可好轉(zhuǎn)[13]。但間充質(zhì)干細(xì)胞治療主要機(jī)制是免疫調(diào)節(jié)作用，不能從根源重建患者免疫，不能完全根治疾病。尚需對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行修飾進(jìn)一步強(qiáng)化其免疫調(diào)節(jié)作用，從而達(dá)到穩(wěn)定疾病的目的。

4 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過繼治療

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs)是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)的T細(xì)胞亞群，占外周血淋巴細(xì)胞的1%～2%[22]。Tregs主要包括以下三類細(xì)胞：自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞-CD4+CD25+T細(xì)胞、適應(yīng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞[23]。Tregs是機(jī)體以“主動(dòng)”方式來維持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的主要途徑，可抑制效應(yīng)T細(xì)胞活化增殖，影響體液免疫，對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞也有抑制作用[24-26]。天皰瘡的發(fā)病與Tregs具有顯著相關(guān)性，PV患者Tregs顯著減低，Th17(T helper cell 17)細(xì)胞增多，導(dǎo)致免疫失調(diào)[27]。PV患者Tr1(type 1 regulatory T cell)細(xì)胞缺乏，研究發(fā)現(xiàn)Tr1細(xì)胞可能在維持和恢復(fù)對(duì)Dsg3自身抗體的耐受性中起關(guān)鍵作用[28]。HLA轉(zhuǎn)基因PV小鼠模型中，CD28誘導(dǎo)單克隆Tregs可降低Dsg3抗體滴度[29]。Tregs在誘導(dǎo)和維持自身抗原耐受及防止自身免疫發(fā)生中起重要作用，有望成為天皰瘡的治療手段。

Tregs過繼治療(adoptive cell therapie, ACT)是利用自身Tregs進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)(修飾/不修飾)，然后回輸?shù)襟w內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)及耐受。其分為自體Tregs過繼治療和工程抗原特異性受體Tregs過繼治療。自體Tregs過繼治療根據(jù)特異性與否分為多克隆和單克隆自體Tregs治療。動(dòng)物試驗(yàn)已證實(shí)過繼轉(zhuǎn)移CD4+CD25+Tregs以劑量依賴的方式抑制PV模型小鼠Dsg3自身抗體的產(chǎn)生[30]。目前關(guān)于多克隆自體Tregs過繼治療天皰瘡的開放性多中心一期臨床試驗(yàn)已經(jīng)開展(NCT03239470)。但有研究提示多克隆自體Tregs過繼治療存在抑制腫瘤和感染性疾病的保護(hù)性免疫的風(fēng)險(xiǎn)[31]。單克隆自體Tregs過繼療法是通過體外表面抗原或抗原提呈細(xì)胞刺激誘導(dǎo)Tregs特異性單克隆分化，但是反復(fù)刺激Tregs可能導(dǎo)致細(xì)胞不穩(wěn)定增殖，產(chǎn)生非Tregs，并且單克隆分化Tregs數(shù)量有限。目前更精確的靶向治療是工程抗原特異性受體Tregs過繼治療，其利用基因工程技術(shù)，將調(diào)節(jié)性T細(xì)胞激活，并且表面嵌合特異性受體進(jìn)行修飾，從而靶向損害效應(yīng)T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)免疫抑制的靶向調(diào)節(jié)，促進(jìn)免疫耐受。主要包括三種：嵌合抗原受體Tregs(CAR-Tregs)、T細(xì)胞(抗原)受體(T cell receptors, TCR)-Tregs以及B細(xì)胞抗體受體(B-cell antibody receptors, BAR)-Tregs。CAR-Tregs是指通過基因工程技術(shù)構(gòu)建載體轉(zhuǎn)移到Tregs，使Tregs表面表達(dá)特定的抗原受體，以此來識(shí)別靶細(xì)胞上特異性抗原并激活Tregs，并通過MHC不受限制的方式殺死抗原承載細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)靶向精準(zhǔn)治療[32，33]。TCR-Tregs是將抗原特異性TCR基因?qū)牖颊逿regs，體外擴(kuò)增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。TCR-Tregs靶向殺傷細(xì)胞是一種MHC依賴性方式，并且需要大劑量IL-2等細(xì)胞因子刺激，因此沒有CAR-Tregs應(yīng)用廣泛[34，35]。BAR-Tregs可被致病組織B淋巴細(xì)胞表面的B細(xì)胞受體(B cell receptor, BCR)所識(shí)別結(jié)合，從而減少抗體分泌，是一種MHC非限制性作用方式[36]。作為一種新興技術(shù)，BAR-Tregs仍研究較少。下面以CAR-Tregs為例來說明工程抗原特異性受體Tregs過繼治療的步驟：①分離純化患者Tregs：從外周血中分離得到外周單核細(xì)胞，再通過磁珠分選得到Tregs；②改造Tregs：用基因工程技術(shù)，把一個(gè)含有能特異性識(shí)別且激活Tregs的嵌合抗原受體的病毒載體轉(zhuǎn)入Tregs，即把Tregs改造成CAR-Tregs；③體外擴(kuò)增CAR-Tregs；④CAR-Tregs回輸至患者體內(nèi)。

多克隆自體Tregs過繼治療存在廣泛抑制而誘發(fā)腫瘤和感染的風(fēng)險(xiǎn)，單克隆自體Tregs過繼治療穩(wěn)定性及數(shù)量不足問題尚待解決。工程抗原特異性受體Tregs通過對(duì)Tregs進(jìn)行修飾，解決了上述問題，是天皰瘡的理想治療方法。但工程抗原特異性受體Tregs過繼治療天皰瘡目前僅在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)階段，不良反應(yīng)嚴(yán)重程度尚需進(jìn)一步研究。構(gòu)建高效特異的工程抗原特異性受體Tregs至關(guān)重要，需要深入開展研究。回輸至患者體內(nèi)的Tregs需是激活狀態(tài)，因此回輸前需確認(rèn)修飾的Tregs的激活。工程抗原特異性受體Tregs療效的持久性問題也需要解決，是否可以通過結(jié)合端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶共轉(zhuǎn)導(dǎo)，聯(lián)合應(yīng)用PI3K抑制劑等實(shí)現(xiàn)尚在研究中[37，38]。目前工程抗原特異性受體Tregs過繼治療諸多問題尚待解決，其治療天皰瘡尚無臨床試驗(yàn)開展，需要積極進(jìn)行機(jī)制研究及動(dòng)物試驗(yàn)，并逐漸推廣至臨床。

5 調(diào)節(jié)性B細(xì)胞過繼治療

調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cells, Bregs)作為免疫抑制細(xì)胞，同樣有一定的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用，并且研究表明T-B細(xì)胞間相互作用在天皰瘡發(fā)病中具有不可替代的作用[39]。有研究表明，向致病小鼠過繼轉(zhuǎn)移野生型小鼠的Bregs后原本被抑制的Tregs水平可恢復(fù)，因此認(rèn)為Bregs過繼治療可通過影響Tregs從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[40]。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)Bregs主要依賴于其分泌的IL-10的作用，從而抑制了前體細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，使其轉(zhuǎn)化為Tregs[40，41]。目前Bregs過繼治療僅在體外試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，尚無臨床試驗(yàn)開展，治療效果仍未確定。

6 小結(jié)

天皰瘡作為一種自身免疫性疾病，臨床易反復(fù)，目前尚無特異性治療。糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑等傳統(tǒng)治療方法不良反應(yīng)明顯，利妥昔單抗作為一種生物制劑，從難治性天皰瘡輔助治療到推薦一線治療，展示出良好的治療價(jià)值。造血干細(xì)胞移植已成功應(yīng)用于天皰瘡治療，并且取得了突出成就，臨床療效可觀，但其治療費(fèi)用較高，風(fēng)險(xiǎn)較大，步驟繁瑣，限制了其臨床推廣。Tregs是一類誘導(dǎo)免疫耐受，抑制免疫功能的T細(xì)胞，已證實(shí)在天皰瘡發(fā)病中發(fā)揮了不可或缺的作用。臨床前研究證實(shí)Tregs過繼療法在天皰瘡動(dòng)物模型中療效良好，并且多克隆自體Tregs過繼療法治療天皰瘡已進(jìn)入I期多中心臨床試驗(yàn)。工程抗原特異性受體Tregs可靶向調(diào)節(jié)免疫，成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。但是這些前沿治療給予希望的同時(shí)也充滿了挑戰(zhàn)。Tregs純化、Tregs譜系穩(wěn)定性、基因工程修飾技術(shù)和不良反應(yīng)防治等一系列問題需要解決，從臨床前研究到臨床試驗(yàn)，逐漸推廣到臨床，再到國際化指南的建立還有很長的路要走。