甘蔗赤腐病菌變異及甘蔗抗病性研究進(jìn)展

李婕，張榮躍，王曉燕，單紅麗，尹炯，羅志明，倉曉燕，黃應(yīng)昆

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南開遠(yuǎn) 661699）

0 引言

甘蔗（Saccharum officinarumL.）是重要的糖料作物之一，而甘蔗赤腐病是甘蔗上最嚴(yán)重的真菌病害之一，主要危害蔗莖（即蔗莖赤腐病）和葉片中脈（即中脈赤腐?。?。嚴(yán)重危害時(shí)可導(dǎo)致甘蔗減產(chǎn)29.1%以及蔗糖分損失30.8%以上[1]，嚴(yán)重影響甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)。甘蔗赤腐病在中國各蔗區(qū)均有發(fā)生，近年來，由于甘蔗連作、氣候多變、高濕多雨及多種病蟲害混合發(fā)生等因素，為甘蔗赤腐病的發(fā)生流行提供了有利條件，部分蔗區(qū)甘蔗赤腐病危害嚴(yán)重，已由次要病害上升為主要病害。目前生產(chǎn)上無高抗品種，加上藥劑防控效果不理想，甘蔗赤腐病菌變異頻繁，以及長(zhǎng)期種植單一感病品種等原因，常造成抗病品種“喪失”抗性而成為感病品種。

甘蔗赤腐病病原菌無性階段為刺盤孢屬的鐮孢炭疽菌（Colletotrichum falcatumWent）[2]，該菌分生孢子的致死溫度較高（60℃、10 min）[3]，因此種苗溫水處理不能有效殺死蔗種中攜帶的赤腐病菌，不過，實(shí)踐證明，在甘蔗種植之前選用合適的藥劑對(duì)種莖進(jìn)行消毒，是減少該病發(fā)生的有效途徑之一[4]。然而明確該病的發(fā)病及抗性機(jī)理，對(duì)病原菌變異及品種抗病性進(jìn)行深入研究才是病害可持續(xù)防控的必由之路，因此本文結(jié)合國內(nèi)外最新研究進(jìn)展，對(duì)甘蔗赤腐病菌變異、分子檢測(cè)方法及甘蔗抗赤腐病研究進(jìn)行了綜述，以期為我國甘蔗赤腐病的研究和防控提供重要理論依據(jù)。

1 甘蔗赤腐病菌變異

甘蔗赤腐病菌極易發(fā)生變異，目前在形態(tài)變異、致病性變異及分子變異方面已有大量研究。研究推斷多數(shù)菌株形態(tài)分類與致病性變異呈正相關(guān)，而分子多樣性無此關(guān)聯(lián)性[5]。

1.1 形態(tài)變異

甘蔗赤腐病存在形態(tài)變異，早期研究工作者根據(jù)培養(yǎng)菌落顏色、菌絲形態(tài)和孢子形成將赤腐病菌分為了淺色小種和深色小種（light type和dark type）[5-7]，而淺色小種產(chǎn)生豐富的分生孢子，毒性也比深色小種要強(qiáng)[6]。Malathi 等通過對(duì)親本品種進(jìn)行致病性差異研究，發(fā)現(xiàn)雖然各菌株能夠侵染所有的參試品種，但是熱帶致病型比亞熱帶致病型毒力更強(qiáng)，認(rèn)為分生孢子盤萌生、孢子形成與致病型毒力相關(guān)[8]。

1.2 致病性變異

雖然菌株在培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征上表現(xiàn)出變異，但是僅用這些性狀進(jìn)行變異分類并不可靠，因此，基于不同寄主進(jìn)行致病性測(cè)定被用來進(jìn)行變異研究。甘蔗赤腐病菌致病力的差異主要表現(xiàn)在同一菌株對(duì)不同寄主的致病力差異或不同菌株對(duì)同一寄主的致病力差異。

上個(gè)世紀(jì)初美國首次報(bào)道了甘蔗赤腐病菌致病性變異[9]，隨后國外許多研究者對(duì)該病害病原菌致病性變異進(jìn)行了大量研究，特別在印度研究較為全面。Sangdit 等根據(jù)致病性將泰國甘蔗赤腐病菌分為兩個(gè)小種（致病的和不致病的）[10]。而印度甘蔗赤腐病菌有11 種致病型（CF01～CF11），其中亞熱帶地區(qū)有7 種而熱帶地區(qū)有4 種[11-12]。早期，Beniwal 等鑒定了亞熱帶地區(qū)品種Co 1148、Co 7717 和CoJ 64 上的3 種致病型，分別為CF 01、CF 02、CF 03[13]。隨后Padmanaban 等從品種Co 419、Co 997 和CoC 671 分離到3 種致病型，分別為Cf 419、Cf 997 和Cf 671，后被命名為CF04、CF05、CF06[14]。20 世紀(jì)80 年代，從熱帶地區(qū)品種Co 419、Co 658、Co 997、Co 6304 上分離的致病菌株被用于甘蔗抗赤腐病品種篩選[15]。然而，Viswanathan 等研究表明，與之前所用的致病型相比，分離自品種CoC 671、CoC 85061、CoC 86062 和CoC 92061 的菌株表現(xiàn)出更強(qiáng)的致病力[16]，致病型Cf 671和Cf 92061具有很強(qiáng)的侵染力并給泰米爾納德邦、安得拉邦的許多地區(qū)及古吉拉特邦、卡納塔克邦的部分地區(qū)甘蔗造成巨大損失[17]，雖然新致病型如Cf 92061、Cf 90063 和Cf 767 毒性比Cf 671 強(qiáng)[18]，但是它們不能長(zhǎng)期維持其毒性，并在幾年后毒性減弱[12]，而新致病型Cf 671 能維持其毒性多年，因此20 多年來印度用Cf 671進(jìn)行抗赤腐病篩選[15]。然而，2004年，Viswanathan從品種Co 94012分離到新致病型Cf 94012，并用32個(gè)甘蔗品種對(duì)致病型Cf 671和新致病型Cf 94012進(jìn)行了連續(xù)7年的致病力試驗(yàn)觀測(cè)，結(jié)果顯示新致病型Cf 94012 比致病型Cf 671 毒性更強(qiáng)[15]。同樣，Prittesh 等分離的cf CHA 菌株毒性較強(qiáng)，可侵染7個(gè)甘蔗品種，并篩選到高抗甘蔗品種Co 94004。國外一系列的致病性研究結(jié)果表明，甘蔗赤腐病菌致病性變異頻繁，常造成許多抗病品種喪失抗性而成為感病品種[19]。病原菌致病性研究是抗病資源挖掘和篩選的基礎(chǔ)與關(guān)鍵，而我國甘蔗赤腐病致病型及其變異情況目前尚未明確，急需開展相關(guān)研究工作。

1.3 分子變異

隨著分子技術(shù)的快速發(fā)展，PCR分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分子變異研究，為植物病原菌的遺傳差異鑒定提供了新的方法和手段，如RAPD、ISSR 等技術(shù)。Madan 等用RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)，用6 對(duì)引物對(duì)分離自哈里亞納邦的5 個(gè)菌株進(jìn)行了多樣性研究，多態(tài)性只有23%，UPGMA 聚類分析將所有菌株分為了2 個(gè)類群[20]。Mohan 等用61 對(duì)RAPD 引物對(duì)赤腐病菌進(jìn)行擴(kuò)增，多態(tài)性為76%[21]。Suman 等用40 對(duì)RAPD 標(biāo)記對(duì)6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行擴(kuò)增，多態(tài)性為78.6%，遺傳差異超過50%，UPGMA 聚類分析將所有菌株分為兩個(gè)類群[22]。Malathi 等用ITS 將印度熱帶和亞熱帶的9 個(gè)致病型分為兩個(gè)類群[8]。Kumar 等對(duì)分離自印度亞熱帶地區(qū)的甘蔗赤腐病菌進(jìn)行了種群遺傳結(jié)構(gòu)研究，用RAPD、URP和ISSR分子標(biāo)記將25個(gè)菌株劃分為6 個(gè)類群，遺傳相似性為34%，表明這些菌株遺傳多樣性豐富[23]。

2 甘蔗赤腐病快速分子檢測(cè)技術(shù)

目前已開發(fā)出甘蔗赤腐病快速分子檢測(cè)技術(shù)，Nithya等用RAPD 引物OPE-01 從赤腐病菌基因組擴(kuò)增出560 bp 片段，并基于此序列設(shè)計(jì)了一對(duì)SCAR標(biāo)記引物，通過特異性驗(yàn)證，SCAR-F/R引物只對(duì)甘蔗赤腐病菌有很高的特異性，而對(duì)其他炭疽菌沒有特異性，引物為SCAR-F 5′-CCTACCCAACCGAGTATCG-3′和SCAR-R 5′-GCGCAGCTTGCTCTCAAGAGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為442 bp[24]。吳偉懷等建立了甘蔗黑穗病和赤腐病雙重PCR 檢測(cè)體系，甘蔗黑穗病引物為CLS 320F/R，甘蔗赤腐病菌的引物為SCAR-F/R[24-26]。Chandra等通過設(shè)計(jì)兩對(duì)外引物及兩對(duì)內(nèi)引物，篩選出3組LAMP特異性引物（RRSC1、RRSC4、RRSC5），建立了一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）檢測(cè)甘蔗赤腐病菌的方法，并對(duì)LAMP 反應(yīng)體系進(jìn)行了特異性和靈敏性檢測(cè)，其靈敏度比普通PCR（SCAR-F/R引物）檢測(cè)技術(shù)要高5～10倍，實(shí)現(xiàn)了該菌檢測(cè)的可視化[27]。

3 甘蔗抗赤腐病研究

目前，甘蔗抗赤腐病研究主要集中在甘蔗品種抗病性研究、抗病分子標(biāo)記及誘導(dǎo)抗病性幾個(gè)方面。

3.1 甘蔗品種抗病性研究

甘蔗品種寄主抗性、蔗糖含量與病原菌毒力具有相關(guān)性。Malathi等用6 個(gè)甘蔗品種的12 個(gè)基因型研究了赤腐病菌變異與寄主抗性的關(guān)系，培養(yǎng)研究表明赤腐病菌毒力相關(guān)因素（生長(zhǎng)、孢子形成和分生孢子萌發(fā)）與寄主抗性呈負(fù)相關(guān)，與不同甘蔗品種蔗汁蔗糖含量呈正相關(guān)；致病性研究表明，通過赤腐病菌致病型鑒別不同品種寄主抗性要有選擇性，尤其是毒力較弱的菌株對(duì)蔗糖含量低的甘蔗品種侵染效果好，因此為了有效篩選，不同品種基因型的選擇取決于致病型毒力，必需選擇侵染好的優(yōu)勢(shì)菌株[28]。

作物受到病原體侵染、紫外輻射、低溫等不良刺激后會(huì)合成各種次生代謝產(chǎn)物、病程相關(guān)蛋白等進(jìn)行防御。早期Viswanathan 等報(bào)道了抗赤腐病甘蔗品種中植保素合成比感病品種多[29]。Malathi 等進(jìn)行了更進(jìn)一步的研究，利用高效液相色譜儀分析了抗病甘蔗品種（Co 93009）和感病甘蔗品種（COC 671）接種赤腐病菌后植保素的合成情況，結(jié)果顯示抗病品種在接種赤腐病菌后合成了兩種植保素木樨黃定（Luteolinidin）和芹菜定（Apigeninidin），接種24 h 后在感抗品種中都檢測(cè)到木樨黃定（Luteolinidin），但是48～72 h 后在抗病品種中增加而在感病品種中不變，在接種赤腐病菌48～72 h 后只在抗病品種中檢測(cè)到芹菜定（Apigeninidin），并非常明確地證明了抗病品種在較高水平上特異性誘導(dǎo)了3-脫氧花色素（3-deoxyanthocyanidins），此外還發(fā)現(xiàn)在抗病品種中這種誘導(dǎo)當(dāng)時(shí)是快速的[30]。Viswanathan等研究表明，在接種赤腐病菌后抗病品種Co 93009較早地積累了幾丁質(zhì)酶（Chitinase）和類甜蛋白（Thaumatin-like protein）等病程相關(guān)（PR）蛋白，而感病品種（CoC 671）此類誘導(dǎo)顯著延遲[31]。

3.2 抗病分子標(biāo)記

開發(fā)抗病分子標(biāo)記技術(shù)，可加快抗病育種進(jìn)程。Alvi 等利用RAPD 分子技術(shù)研究了12 個(gè)抗赤腐病甘蔗品種和5個(gè)感病品種基因型的遺傳差異，感病和抗病甘蔗基因型間的平均遺傳相似性為74.37%，這表明大部分基因組是相似的，甘蔗基因型多態(tài)性程度與抗或感赤腐病無關(guān)聯(lián)[32]。Virupakshi 等用ISSR 標(biāo)記分析了7個(gè)抗/中抗赤腐病和5 個(gè)感赤腐病甘蔗葉綠體和線粒體基因組，UPGMA 聚類分析將甘蔗品種分為抗/中抗和感病兩個(gè)聚類，該結(jié)果表明該標(biāo)記是抗病品種鑒定、遺傳關(guān)系分析和多樣性評(píng)價(jià)的一個(gè)新的有力工具[33]。Jayashree等用抗病基因同源序列（RGA）策略，從抗性蛋白的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)了29個(gè)RGA引物，對(duì)赤腐病抗性不同的40 個(gè)甘蔗品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示品種間遺傳相似性范圍為58.4%～90%，平均遺傳相似性為74.2%，聚類分析將感病和抗病品種明顯地區(qū)分開，共鑒定出14 對(duì)引物擴(kuò)增出的25 個(gè)特異片段與抗性相關(guān)，8對(duì)引物擴(kuò)增出的8 個(gè)特異片段與感病性相關(guān)，這些被發(fā)現(xiàn)與品種抗/感赤腐病相關(guān)聯(lián)的抗病基因同源序列是一種有價(jià)值的標(biāo)記來源，可在育種中用于篩選抗赤腐病材料[34]。同樣，Sharma 等用抗病基因同源序列策略鑒定了18 個(gè)片段與抗赤腐病關(guān)聯(lián)，可作為抗病特異性標(biāo)記，7 個(gè)片段與感赤腐病關(guān)聯(lián)，可作為感病特異性標(biāo)記[35]。Singh 等利用SSR 標(biāo)記對(duì)赤腐病抗性不同的30 個(gè)甘蔗基因型進(jìn)行了遺傳多樣性研究，聚類分析清楚地區(qū)分了所有的基因型，抗病基因型（ISH150和SES594）明顯地處于一個(gè)聚類，而其余的基因型分成兩個(gè)明顯的聚類，將中抗和易感甘蔗基因型分開[36]。Singh 等發(fā)現(xiàn)SSR 標(biāo)記中UGSM316850和UGSM31660與中抗品種緊密關(guān)聯(lián)，而UGSM316400與高感品種密切關(guān)聯(lián)[37]。

3.3 誘導(dǎo)抗病性研究

誘導(dǎo)抗病性主要是通過外來因子對(duì)植物的刺激來激活和調(diào)控植物自身免疫反應(yīng)以抵御外來病原菌侵染。目前研究較為深入的有系統(tǒng)獲得抗性(system acquired resistance,SAR)和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(Induced system resistance,ISR)。

植物誘導(dǎo)抗病劑苯并噻二唑[Acibenzolar-S-methyl，benzo（1，2，3-thiadiazole-7-carbothioic acid-S-methyl，BTH）]是一種人工合成的SA 類似物，BTH 本身不具有直接的抑菌作用，但能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性從而有效抵御病原菌的侵染。Sundar等分別用100μg/mL的苯并噻二唑（Acibenzolar-S-methyl）、水楊酸（Salicylic acid）、異煙酸（Isonicotinic acid）和丁二酸（Succinic acid）對(duì)高感赤腐病品種CoC 671 和CoC 92061系統(tǒng)獲得抗性誘導(dǎo)（SAR）進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果顯示所有誘導(dǎo)抗病劑處理后的甘蔗由高感變?yōu)橹锌?，其中苯并噻二唑誘導(dǎo)了較高水平組織抗性，有效限制了病原菌的定植，并伴隨著過氧化物酶（POX）和多酚氧化酶（PPO）的顯著提高，證明了氧化酶的誘導(dǎo)是系統(tǒng)獲得抗性的機(jī)制之一[38]。同樣Ashwin 等試驗(yàn)結(jié)果也證明了誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得抗性抵御甘蔗赤腐病的幾個(gè)誘導(dǎo)抗病劑中苯并噻二唑是最有效的[39]。

Viswanathan 等早期研究表明，熒光假單胞菌可誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR），從而顯著減少赤腐病菌定植，減少糖分損失；隨后對(duì)不同抗性甘蔗品種進(jìn)行了熒光假單胞菌誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性研究，結(jié)果顯示高感品種誘導(dǎo)抗病性比中抗和中感品種更顯著，該結(jié)果表明對(duì)于抵御赤腐病，與甘蔗固有的寄主防御機(jī)制相比，誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性不顯著；此外，熒光假單胞菌的使用還減少了轉(zhuǎn)化酶，提高了蔗汁質(zhì)量[40-42]。

4 展望

4.1 甘蔗赤腐病防控

甘蔗赤腐病可對(duì)甘蔗造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，初侵染源為帶病蔗種和田間的病株殘葉，可隨風(fēng)雨、露水傳播進(jìn)行再侵染，有效防治難度較大。而長(zhǎng)期以來甘蔗赤腐病是我國蔗區(qū)一種次要病害，對(duì)其研究較少，但近年蔗莖赤腐病局部發(fā)生嚴(yán)重，缺少準(zhǔn)確的診斷與有效的防治技術(shù)，經(jīng)濟(jì)損失較重[43]，現(xiàn)已上升為甘蔗主要病害。甘蔗赤腐病菌容易發(fā)生變異，新致病性小種的產(chǎn)生導(dǎo)致甘蔗品種抗病性“喪失”，即使種植抗病品種，在8～10年內(nèi)該品種也會(huì)因新的更具致病性小種的出現(xiàn)而感病[44]，單一的防治方法并不能有效減輕甘蔗赤腐病造成的損失。應(yīng)避免長(zhǎng)期種植單一高感品種ROC 1、ROC 22、ROC 16、臺(tái)糖89-1626、粵糖93-159、粵糖00-236[2,45]；蔗種可用木霉菌（Tichodermaspp.）、假單胞菌（Pseudomonasspp.）、芽孢桿菌（Bacillusspp.）等生物防治劑進(jìn)行蔗種及土壤處理進(jìn)行防控[45]；蔗莖上的螟蟲蛀孔是赤腐病菌孢子主要的侵入通道[2]，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)螟蟲的監(jiān)控，采用頻振式殺蟲燈或性誘劑誘殺成蟲，或釋放赤眼蜂等進(jìn)行螟蟲防控[46]；同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)田間管理，減少殺菌劑的使用，結(jié)合多種綠色防治手段進(jìn)行綜合綠色防控，有效控制病害大面積發(fā)生流行，減輕危害損失，實(shí)現(xiàn)甘蔗赤腐病的可持續(xù)控制[45]。

4.2 甘蔗赤腐病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)研究

與國外相比我國對(duì)該病害研究相對(duì)薄弱，目前主要集中在殺菌劑和生防菌室內(nèi)篩選階段，缺乏深入系統(tǒng)的研究，甘蔗赤腐病病原菌群體遺傳結(jié)構(gòu)及甘蔗品種抗性情況尚未明確，阻礙了抗病品種的利用及精準(zhǔn)防控的實(shí)施。今后，科研工作者應(yīng)積極開展甘蔗赤腐病不同地理環(huán)境病原菌群體的鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化及多樣性研究，掌握不同生態(tài)區(qū)甘蔗赤腐病主要致病菌類群，深入研究赤腐病菌致病機(jī)理、成災(zāi)規(guī)律，這對(duì)開展相應(yīng)的抗性研究及利用具有重要意義；并對(duì)赤腐病菌抗藥性進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，利用已開發(fā)的簡(jiǎn)便、快速、高效且不需昂貴儀器及實(shí)驗(yàn)條件的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）進(jìn)行檢測(cè)[47]，該方法有利于在基層推廣使用。

4.3 甘蔗赤腐病抗病基因挖掘

中國國家甘蔗種質(zhì)資源圃保存有6 個(gè)屬16個(gè)種的2 800余份各類甘蔗種質(zhì)資源材料，是中國乃至世界甘蔗遺傳改良的巨大珍貴基因庫，是抗病基因的重要來源，穩(wěn)定多抗的甘蔗品種種質(zhì)資源是進(jìn)行赤腐病抗性育種的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，在未來的研究工作中，利用分子標(biāo)記育種技術(shù)提高育種效率，從巨大種植資源庫充分挖掘甘蔗品種抗病基因，篩選優(yōu)良種質(zhì)資源，全面解析甘蔗赤腐病的抗病遺傳規(guī)律和抗性機(jī)制，發(fā)掘和定位在不同環(huán)境中能穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL。