三維培養(yǎng)在婦科惡性腫瘤研究中的應(yīng)用

高英 周君涵 朱雪瓊

婦科惡性腫瘤是嚴重威脅婦女生命健康的一組惡性疾病[1]。目前對于婦科惡性腫瘤多采取手術(shù)為主、放化療為輔的綜合治療手段，但由于部分患者未能早期診斷，部分化療藥物易產(chǎn)生耐藥等多種因素[2]，導(dǎo)致治療效果欠佳。因此迫切需要研發(fā)新的靶向化療藥物，從而抑制腫瘤進展及預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。

在新型抗癌藥物進行臨床試驗之前，需要先進行臨床前研究以確保其安全性和有效性，研究的第一步通常是體外細胞實驗。目前體外腫瘤細胞實驗多采用傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)方法，其具有成本低、操作簡單、培養(yǎng)環(huán)境易控制、觀察指標較直觀等優(yōu)點。然而，二維培養(yǎng)尚存在較多局限，例如結(jié)構(gòu)過于簡單，細胞和細胞外環(huán)境之間相互干擾，導(dǎo)致細胞形態(tài)、極性和分裂方法的變化等[3]。除此之外，在二維培養(yǎng)條件下腫瘤細胞常呈單層貼壁生長，細胞與細胞或細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）接觸很少，缺乏細胞與細胞或ECM間的相互作用，與體內(nèi)腫瘤真實的生長微環(huán)境存在差異，不能準確反映腫瘤在體內(nèi)的真實生長情況。

三維培養(yǎng)技術(shù)能夠很好地彌補二維培養(yǎng)的不足[4]。三維培養(yǎng)是指利用各種方法和材料，使細胞在空間上呈立體方式生長，更接近于體內(nèi)生長狀況，形成類似于體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)，并發(fā)揮其功能。與傳統(tǒng)的二維單層培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)為腫瘤細胞在體外的生長提供類似于體內(nèi)生長環(huán)境的生物支撐或基質(zhì)，使腫瘤細胞呈立體球狀生長[5]。除此之外，在三維培養(yǎng)條件下，細胞與細胞或ECM間充分接觸并建立相互聯(lián)系[6]。研究表明，應(yīng)用三維培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建的體外腫瘤模型與體內(nèi)腫瘤具有相似的形態(tài)學(xué)和細胞生物學(xué)特性[7]。本文擬對三維培養(yǎng)在婦科腫瘤研究中的應(yīng)用作一綜述，并展望其應(yīng)用前景及意義。

1 三維培養(yǎng)在卵巢癌研究中的應(yīng)用

1.1 腫瘤微環(huán)境對卵巢癌細胞影響的研究 Cai等[8]從卵巢囊腫患者的大網(wǎng)膜中和上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）轉(zhuǎn)移的大網(wǎng)膜中分離出原代人成纖維細胞，并分別與EOC細胞在體外建立三維共培養(yǎng)模型，用于研究大網(wǎng)膜成纖維細胞和EOC細胞之間的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未被癌細胞激活的成纖維細胞相比，大網(wǎng)膜中腫瘤細胞激活活化的成纖維細胞，即癌相關(guān)成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）形成一個適宜的環(huán)境，以促進卵巢癌細胞細胞植入大網(wǎng)膜，從而促進卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲，該三維培養(yǎng)模型提示大網(wǎng)膜中CAFs與卵巢癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Touboul等[9]從羊膜中提取間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC），并使用羊膜支架構(gòu)建卵巢癌細胞和MSC的體外三維共培養(yǎng)模型，用以研究卵巢癌細胞和MSC之間的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MSC和卵巢癌細胞共培養(yǎng)的情況下，大多數(shù)腫瘤位于富含MSC的區(qū)域，在富含MSC的區(qū)域內(nèi)腫瘤浸潤更深，且在共培養(yǎng)條件下較高的白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）分泌可以增強卵巢癌細胞的侵襲，在拮抗IL-6受體后，卵巢癌細胞浸潤明顯減少（主要在富含MSC的區(qū)域中），表明MSC通過分泌IL-6促進卵巢癌細胞的浸潤，提示三維共培養(yǎng)模型為研究卵巢癌細胞浸潤微環(huán)境提供較好模型。

1.2 卵巢癌細胞生物學(xué)行為研究 體外研究發(fā)現(xiàn)受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1（receptor tyrosine kinase-like orphan receptors 1，ROR1）和受體酪氨酸激酶樣孤兒受體 2（receptor tyrosine kinase-like orphan receptors 2，ROR2）在卵巢癌轉(zhuǎn)移中起重要作用[10]，但是，當使用二維培養(yǎng)模型來研究癌細胞的遷移時，不能研究間質(zhì)細胞參與的癌細胞轉(zhuǎn)移。為了深入研究ROR1和ROR2在腫瘤細胞和間質(zhì)細胞中的作用，Henry等[11]收集來源于女性良性或非轉(zhuǎn)移性婦科惡性腫瘤新鮮大網(wǎng)膜樣品中分離的原代成纖維細胞和間皮細胞，用膠原蛋白培養(yǎng)構(gòu)建器官型三維培養(yǎng)模型，并將ROR1、ROR2和雙ROR1/ROR2的穩(wěn)定短發(fā)夾RNA敲低的卵巢癌細胞接種到三維培養(yǎng)模型上以分析比較各組之間癌細胞黏附和侵襲能力的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時敲低卵巢癌細胞ROR1和ROR2基因強烈抑制癌細胞黏附和侵襲到大網(wǎng)膜模型，表明ROR1和ROR2聯(lián)合可明顯影響卵巢癌細胞向大網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)移。Henry等[12]還在卵巢癌相關(guān)基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了ROR2的上調(diào)，但沒有發(fā)現(xiàn)ROR1的上調(diào)，并且卵巢癌相關(guān)基質(zhì)中過表達的ROR2增加卵巢癌細胞的遷移，表明ROR2可能在間質(zhì)細胞參與的癌細胞轉(zhuǎn)移中起作用。這些結(jié)果強調(diào)了使用復(fù)雜的器官型三維模型能夠更好地研究體外受體對癌細胞生物學(xué)行為的影響。由于傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)模型不能準確再現(xiàn)人體大網(wǎng)膜的微環(huán)境，人們對早期卵巢癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機制知之甚少，Kenny等[13]使用卵巢癌細胞和正常大網(wǎng)膜中分離的原代成纖維細胞、間皮細胞、膠原等開發(fā)了一種模仿人體大網(wǎng)膜的器官型三維共培養(yǎng)模型，用以研究卵巢癌細胞的早期轉(zhuǎn)移，其結(jié)果顯示當卵巢癌細胞黏附于大網(wǎng)膜時，基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）在卵巢癌細胞中被上調(diào)和水解活化，活化的MMP-2將ECM裂解為小片段，裂解的ECM片段隨后通過與其同源整聯(lián)蛋白受體結(jié)合而促進卵巢癌細胞黏附和侵襲，該實驗結(jié)果強調(diào)了三維培養(yǎng)模型對于研究早期卵巢癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機制具有重要意義。

1.3 抗卵巢癌藥物篩選研究 由于用于初級藥物篩選的傳統(tǒng)二維細胞培養(yǎng)方法并不能很準確地反映惡性腫瘤的自然進展。Cha等[14]研究了成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）1/2/3選擇性抑制劑BGJ398對單層培養(yǎng)和球形培養(yǎng)條件下的卵巢癌SKOV3ip1細胞的抗腫瘤活性，采用結(jié)晶紫染色試驗檢測抑制劑處理前后的細胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在BGJ398處理48和72h的單層培養(yǎng)的卵巢癌細胞中，細胞活力降低不明顯；而在球形培養(yǎng)的卵巢癌細胞中，細胞活力明顯降低，且呈時間依賴性，表明腫瘤細胞的三維培養(yǎng)模型對于抗卵巢癌藥物篩選具有重要意義。Hirst等[15]在三維細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)了一組EOC細胞系，以形成多細胞腫瘤球體，并使用二維細胞培養(yǎng)物進行對比篩選，以鑒定先前未鑒定出有抗腫瘤活性的抗癌藥物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)licofelone和glafenine在卵巢癌三維細胞培養(yǎng)物中具有較強的抗腫瘤活性，但是這些藥物僅用傳統(tǒng)的二維藥物篩選并未能鑒定出有抗腫瘤活性，提示使用體外球體三維藥物篩選模型對于抗卵巢癌藥物篩選具有重要作用。

2 三維培養(yǎng)在乳腺癌研究中的應(yīng)用

2.1 腫瘤微環(huán)境對乳腺癌細胞的影響研究 ECM相關(guān)黏附蛋白以及腫瘤基質(zhì)硬度是轉(zhuǎn)移的重要決定因素。由于傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)不能考慮腫瘤微環(huán)境中的ECM硬度，因此當研究ECM相關(guān)黏附蛋白（包括Ras抑制因子-1）在細胞侵襲方面與基質(zhì)硬度的關(guān)系時，不能使用傳統(tǒng)的二維單層培養(yǎng)物。Gkretsi等[16]采用增加濃度和硬度的三維膠原蛋白Ⅰ凝膠來嵌入不同侵襲性的乳腺癌細胞和腫瘤球狀體來研究ECM相關(guān)黏附蛋白與基質(zhì)硬度的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ras抑制因子-1在基質(zhì)硬度增加的條件下顯著上調(diào)；而由Ras抑制因子-1敲除的細胞形成的腫瘤球體在所有乳腺癌細胞系中以及不同基質(zhì)硬度條件下均喪失其侵襲能力，表明Ras抑制因子-1在乳腺癌轉(zhuǎn)移中起重要作用。Daubriac等[17]開發(fā)了一種由乳腺癌MDA-MB-231細胞、CAFs和膠原凝膠組成的三維共培養(yǎng)模型，用以研究CAFs和癌細胞之間的相互作用如何調(diào)節(jié)癌細胞的侵襲性，結(jié)果顯示CAFs和乳腺癌細胞之間的相互作用增加了CAFs中胰島素樣生長因子-1的分泌和癌細胞中纖溶酶原激活物抑制劑-1的活性，而胰島素樣生長因子-1和纖溶酶原激活物抑制劑-1均可激活癌細胞中的RhoA/ROCK信號傳導(dǎo)，進而增加癌細胞的擴散和侵襲性。因此，三維共培養(yǎng)模型可明確CAFs調(diào)節(jié)乳腺癌細胞侵襲性的相關(guān)通路。

2.2 乳腺癌細胞生物學(xué)行為研究 為了研究不同培養(yǎng)條件下DNA甲基化與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，Wang等[18]分別在二維和三維培養(yǎng)條件下培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細胞，并分析檢查乳腺癌細胞CpG位點的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)條件下乳腺癌細胞的DNA甲基化狀態(tài)無明顯差異，但是DNA甲基化異常與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。Toh等[19]開發(fā)了一種基于微流體的培養(yǎng)芯片，在該微流體芯片中，三維微環(huán)境被設(shè)計成在三維腫瘤模型中培養(yǎng)轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞（MX-1），同時摻入化學(xué)引誘劑以刺激乳腺癌細胞穿過膜的運動性，并通過跟蹤系統(tǒng)中癌細胞的運動性來驗證芯片的有效性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在微流體癌細胞遷移模型中，MX-1細胞能夠在45h內(nèi)穿過膠原屏障侵入側(cè)灌注通道，并能保持其細胞-細胞接觸做集體侵入運動，表明與傳統(tǒng)的監(jiān)測癌細胞遷移的Boyden室相比，該系統(tǒng)可以實時監(jiān)測癌細胞遷移，提示三維微流體培養(yǎng)芯片對于監(jiān)測乳腺癌細胞運動具有重要意義。

2.3 抗乳腺癌藥物篩選研究 由于浸潤性乳腺癌患者易對常規(guī)的化療藥物產(chǎn)生耐藥，Borges等[20]提出了一種新的治療策略，即將DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱與蘇拉明相結(jié)合，在三維細胞培養(yǎng)中測定蘇拉明、地西他濱和兩者的聯(lián)合治療對乳腺癌細胞的毒性反應(yīng)以及對細胞侵襲性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在三維培養(yǎng)條件下，單獨蘇拉明或地西他濱對腫瘤細胞生長沒有明顯的抑制和毒性反應(yīng)，對細胞侵襲也沒有明顯的抑制作用，即使兩種藥物的聯(lián)合應(yīng)用，對乳腺癌細胞的生長亦無明顯的抑制作用，但能夠有效地阻止癌細胞侵入周圍的ECM，表明使用地西他濱和蘇拉明的聯(lián)合治療雖然無抑制癌細胞生長作用，但明顯降低乳腺癌細胞的侵襲潛力，提示蘇拉明和地西他濱聯(lián)合可用于治療侵襲性、多藥耐藥性乳腺癌。Hashemzehi等[21]在三維培養(yǎng)模型中評估了植物體包裹的姜黃素抗乳腺癌MCF-7細胞的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在三維培養(yǎng)模型中，隨著植物體姜黃素濃度增加，乳腺癌細胞的存活率和侵襲能力逐漸下降，尤其是乳腺癌細胞的侵襲力，提示植物體姜黃素以劑量依賴性方式抑制乳腺癌MCF-7細胞的生長并且明顯降低其侵襲能力，表明植物體姜黃素能夠抑制乳腺癌細胞的生長和侵襲，為進一步研究這種新型抗癌劑抗乳腺癌的作用提供試驗依據(jù)。以上研究提示，三維培養(yǎng)技術(shù)對于篩選治療乳腺癌的新型化療藥物或聯(lián)合化療方案均具有重要的意義。

3 三維培養(yǎng)在子宮內(nèi)膜癌研究中的應(yīng)用

3.1 子宮內(nèi)膜癌細胞生物學(xué)行為研究 Grun等[22]使用旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)法建立子宮內(nèi)膜癌細胞的三維培養(yǎng)模型，并與建立在二維培養(yǎng)中的相同細胞和原發(fā)性腫瘤的形態(tài)學(xué)特征進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與腫瘤細胞的二維單層培養(yǎng)物相比，三維多細胞球體呈簇狀生長，類似于乳頭狀結(jié)構(gòu)，細胞呈多形性，細胞核增大，核仁明顯，還存在有絲分裂細胞；三維多細胞球體與具有子宮內(nèi)膜乳頭狀結(jié)構(gòu)的原發(fā)腫瘤具有相似的形態(tài)學(xué)特征，表明三維細胞系的生長模式與原發(fā)腫瘤的形態(tài)學(xué)具有高度相似性，提示建立癌細胞系的三維培養(yǎng)模型對于研究子宮內(nèi)膜癌的生長模式具有重要價值。Yamamoto等[23]采用三維培養(yǎng)方法研究子宮內(nèi)膜癌細胞系（Ishikawa，HEC1A和AN3CA）的形態(tài)和AF-6/afadin表達，使用Matrigel侵襲測定來證明AF-6/afadin敲低后子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AF-6/afadin敲低導(dǎo)致三維細胞培養(yǎng)物中腺樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量減少，子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲能力增強，提示AF-6/afadin的表達缺失可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲，但抑制腺體結(jié)構(gòu)的形成。以上研究表明，三維培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用有力推動了對子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖、侵襲等生物學(xué)行為的研究。

3.2 子宮內(nèi)膜癌細胞對化療藥物的敏感性研究 晚期子宮內(nèi)膜癌患者常表現(xiàn)為對化療藥物的耐藥。Chitcholtan等[2]使用懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)出子宮內(nèi)膜癌細胞的三維多細胞結(jié)構(gòu)，并比較了多柔比星和順鉑在子宮內(nèi)膜癌三維多細胞結(jié)構(gòu)和二維單層培養(yǎng)物中的抗腫瘤活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多柔比星和順鉑在三維多細胞結(jié)構(gòu)中誘導(dǎo)的細胞凋亡少于二維單層培養(yǎng)物，且三維多細胞培養(yǎng)物比細胞單層培養(yǎng)物具有更高的活力，表明與二維培養(yǎng)物相比，三維多細胞結(jié)構(gòu)對檢測化療藥物敏感性表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢。

4 三維培養(yǎng)在宮頸癌研究中的應(yīng)用

Zhao等[24]使用宮頸癌Hela細胞、明膠、藻酸鹽、纖維蛋白原水凝膠為原料，并采用3D打印方法構(gòu)建宮頸癌體外培養(yǎng)模型。在宮頸癌3D打印模型中測量細胞增殖、MMP表達和化學(xué)抗性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與二維培養(yǎng)相比，3D打印模型中的Hela細胞顯示出更高的增殖速率、更高的MMP表達水平和更強的化療藥物的耐藥性，提示新的三維細胞打印技術(shù)可以促進三維癌癥研究的發(fā)展。

5 結(jié)語

綜上所述，與二維單層細胞培養(yǎng)相比，婦科惡性腫瘤細胞的三維立體培養(yǎng)模型與體內(nèi)腫瘤具有更為相似的形態(tài)學(xué)特征和細胞生物學(xué)特性，能夠較準確地模擬體內(nèi)腫瘤生長的真實情況。三維培養(yǎng)技術(shù)在研究婦科惡性腫瘤微環(huán)境、細胞生物學(xué)行為和篩選抗腫瘤藥物等方面具有重要意義。但三維培養(yǎng)技術(shù)仍然有些地方需要改進，例如操作耗時長、難以控制腫瘤球的大小和均一性等，尚需進一步研究不斷完善，以滿足臨床研究。