慢病毒介導(dǎo)miR-17過(guò)表達(dá)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的影響及機(jī)制初探

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)屬于炎癥性腸病(IBD)，好發(fā)于直腸和乙狀結(jié)腸[1]。UC的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，其與環(huán)境、遺傳、感染、細(xì)胞凋亡及免疫等多種因素相關(guān)。有研究顯示，腸道黏膜細(xì)胞對(duì)維持腸道微生態(tài)平衡具有重要作用，而腸道黏膜細(xì)胞凋亡率升高將導(dǎo)致腸道黏膜屏障受損[2]。腸道黏膜屏障受損與UC久治不愈、病情反復(fù)密切相關(guān)。miR-17是由6個(gè)序列相似、結(jié)構(gòu)相仿的核苷酸組成的RNA分子，其序列高度保守，存在于基因組中內(nèi)含子的非編碼區(qū)[3]。研究表明，miR-17主要與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)[4]。本研究探討了miR-17過(guò)表達(dá)對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織的影響及可能的機(jī)制，以期為UC的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠，雄性，共45只，體質(zhì)量為25～32 g。由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)提供，許可證號(hào)：SYXK(遼)2018-0087。室溫保持22 ℃～28 ℃，相對(duì)濕度35%～75%，晝夜自然光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)(美國(guó)Sigma公司)，裂解液(美國(guó)BD公司)，Tunel檢測(cè)試劑盒(上海碧云天公司)，水合氯醛(天津福星公司)，BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒(上海碧云天公司)，HE染色試劑盒(北京索萊寶公司)、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Beyotime公司)，兔單克隆抗Bim抗體(美國(guó)PAA公司)，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(上海碧云天公司)，SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(南京建成公司)，ECL發(fā)光試劑盒(美國(guó)Thermo公司)。 儀器：垂直電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。本研究由沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物公司設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。

1.3 分組與UC模型構(gòu)建

35只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食不禁水維持24 h，腹腔注射4%水合氯醛溶液(40 mg/kg)，待小鼠麻醉后，從小鼠的肛門(mén)插入直徑為5 mm的硅膠管，進(jìn)深約8 mm；該管另一端連接注射器，一次性注射2.5%TNBS乙醇溶液(TNBS溶于50 %的乙醇水溶液)灌腸(100 mg/kg)，灌腸完畢后，提拉尾巴使小鼠倒立3 min，放回原籠繼續(xù)飼養(yǎng)，參照文獻(xiàn)[5]制作UC模型。隨機(jī)選取5只小鼠處死，取結(jié)腸組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，判斷小鼠UC模型構(gòu)建成功與否。將30只UC模型構(gòu)建成功的小鼠隨機(jī)分成模型組(B組)、模型+空載體組(C組)、模型+miR-17過(guò)表達(dá)組(D組)，每組10只；另取10只小鼠用上述方法注射100 mg/kg的生理鹽水灌腸，設(shè)為正常組(A組)。其中C組小鼠在第1、7、14、21天時(shí)于尾靜脈注射慢病毒空載體100 μL；D組小鼠于相同時(shí)間點(diǎn)注射等量的miR-17過(guò)表達(dá)慢病毒載體；最后1次注射1周后處死全部4組小鼠，并將結(jié)腸組織存于-80 ℃冰箱中。

表1 引物序列

1.4 小鼠癥狀觀察與評(píng)分

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每日記錄每只小鼠的體質(zhì)量，觀察每只小鼠的糞便情況以及便血情況，根據(jù)UC的疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)標(biāo)準(zhǔn)，并參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行評(píng)分。具體如下：體質(zhì)量無(wú)下降，糞便正常且無(wú)便血計(jì)0分；體質(zhì)量下降<5 %，糞便松散且無(wú)便血計(jì)1分；體質(zhì)量下降5 %～10 %，糞便松散有便血計(jì)2分；體質(zhì)量下降11 %～15 %，稀便，有便血計(jì)3分；體質(zhì)量下降>15 %，稀便，肉眼血便計(jì)4分。

1.5 HE染色觀察小鼠結(jié)腸組織病理變化

將固定于4 %多聚甲醛溶液中的結(jié)腸組織取出，然后進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋和切片，對(duì)組織切片進(jìn)行脫蠟、水化、染色和封片。利用顯微鏡觀察切片。

1.6 TUNEL法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡情況

將小鼠結(jié)腸組織從4%多聚甲醛溶液中取出，制成石蠟切片；采用3 %過(guò)氧化氫溶液室溫孵育5 min，0.05 mol/L枸櫞酸鹽溶液100 ℃修復(fù)10 min，15%脫脂奶粉溶液封閉1 h，之后用1∶500 TUNEL檢測(cè)液室溫孵育90 min，1∶500熒光素抗體37 ℃孵育60 min，Hoechst室溫孵育5 min，封片，利用熒光顯微鏡觀察并拍照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈黃棕色或黃褐色，并且呈散狀分布，周?chē)鸁o(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，核固縮或核碎裂。凋亡指數(shù)=(凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100 %。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達(dá)水平

從-80 ℃冰箱中取出小鼠結(jié)腸組織80 mg，加入RNAiso Plus 1 000 μL剪碎，研磨勻漿，室溫中加入各項(xiàng)反應(yīng)試劑，37 ℃溫育，60 min；70 ℃溫育10 min。以U6為內(nèi)參，95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.8 Western Blot法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中Bim蛋白的水平

從-80 ℃冰箱中取出小鼠結(jié)腸組織，加入裂解液[組織體質(zhì)量(mg)∶裂解液(μL)=1∶9]，4 ℃離心20 min，提取上清液中的總蛋白，利用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣本總蛋白濃度；隨后加入25 %的上樣緩沖液，沸水浴10 min變性；應(yīng)用SDS-PAGE凝膠配置試劑盒進(jìn)行電泳；完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。1∶400兔單克隆Bim一抗4 ℃孵育過(guò)夜，1∶1 400 HRP標(biāo)記羊抗兔IgG室溫孵育1 h，用ECL發(fā)光液避光顯影。應(yīng)用Image J-pro 6.0 軟件進(jìn)行灰度值掃描分析，得出目的蛋白表達(dá)的相對(duì)值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組癥狀及DAI評(píng)分比較

A、B、C、D組小鼠DAI評(píng)分分別為(0.10±0.03)分、(3.60±0.05)分、(3.53±0.60)分和(1.57±0.36)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=113.57，P<0.001)。與A組相比，B、C、D組小鼠的DAI評(píng)分均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=22.112 7、21.670 5、9.287 3，P<0.05)。與B組相比，C組小鼠的DAI評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.442 2，P>0.05)，而D組則顯著降低(q=12.825 4，P<0.05)。與C組相比，D組小鼠DAI評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=12.383 1，P<0.05)。

2.2 各組小鼠結(jié)腸組織切片病理學(xué)比較

A組結(jié)腸組織細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化，也沒(méi)有觀察到任何病變。與A組相比，B、C組小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化，D組較B、C組明顯改善。見(jiàn)圖1。

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織TUNEL分析比較

A、B、C、D 組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(4.05±3.97)%、(77.68±5.89)%、(71.98±6.72)%和(30.20±8.64)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=288.81，P<0.001)。與A組相比，B、C、D 組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=35.688 4、32.925 6，12.674 9，P<0.05)。與B組相比，C組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=2.762 8，P>0.05)，而D組則顯著降低(q=23.013 5，P<0.05)。與C組相比，D組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=20.250 7，P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1各組小鼠結(jié)腸組織光鏡下的病理改變 HE染色 ×200A正常小鼠B模型組C模型+空載體組D模型+miR-17過(guò)表達(dá)組

圖2各組小鼠結(jié)腸組織TUNEL分析 HE染色 ×200A正常小鼠B模型組C模型+空載體組D模型+miR-17過(guò)表達(dá)組

2.4 各組小鼠結(jié)腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達(dá)水平比較

如表2所示，4組小鼠結(jié)腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達(dá)水平相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.88、86.67，P<0.001)。與A組相比，B、C、D組小鼠結(jié)腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達(dá)水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=12.694 4、12.933 9、7.305 3，P<0.05；q=17.985 9、19.569 6、6.900 3，P<0.05)。與B組相比，C組小鼠結(jié)腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.239 5、1.587 3，P>0.05)，而D組則均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.389 1、11.085 7，P<0.05)。與C組相比，D組小鼠結(jié)腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.628 6、12.669 3，P<0.05)。

表2 各組小鼠結(jié)腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達(dá)水平

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織中Bim蛋白的表達(dá)水平比較

A、B、C、D組小鼠結(jié)腸組織中Bim蛋白的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.39±0.16、0.93±0.17、0.70±0.18和0.36±0.18，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.25，P<0.001)。與A組相比，B、C組小鼠結(jié)腸組織中Bim蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=7.869 7、5.605 9，P<0.05)。與B組相比，C組小鼠結(jié)腸組織中Bim蛋白的相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=2.260 0，P>0.05)，而D組則顯著降低(q=8.398 3，P<0.05)。與C組相比，D組小鼠結(jié)腸組織中Bim蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=6.138 3，P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織中Bim蛋白的表達(dá)

3 討論

UC患者多伴有腸道炎性反應(yīng)和腸道黏膜潰瘍性損傷，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉等[7]。研究發(fā)現(xiàn)，UC是誘發(fā)結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)因素[8]。UC的病因較為復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制可能與遺傳、環(huán)境、免疫、腸道菌群失調(diào)及黏膜細(xì)胞過(guò)度凋亡等因素有關(guān)[9-12]。UC反復(fù)發(fā)作可能是因結(jié)腸黏膜細(xì)胞凋亡增多導(dǎo)致屏障功能受損所致[13]。因此，抑制腸道黏膜細(xì)胞凋亡可能對(duì)UC的腸道屏障修復(fù)起重要作用。本研究給予小鼠2.5% TNBS乙醇溶液灌腸構(gòu)建UC模型，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染miR-17使之過(guò)表達(dá)抑制腸道黏膜細(xì)胞凋亡，觀察UC小鼠的癥狀及結(jié)腸黏膜病理變化，并探究其機(jī)制。

本研究基于小鼠的癥狀、體征、DAI評(píng)分和小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)檢查，評(píng)價(jià)UC造模成功與否，結(jié)果顯示，與正常小鼠相比，UC模型小鼠出現(xiàn)明顯的UC癥狀及體征，并且DAI評(píng)分明顯升高，小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯病理?yè)p傷，表明UC小鼠模型造模成功。本研究觀察了慢病毒介導(dǎo)miR-17過(guò)表達(dá)對(duì)UC小鼠的影響，并通過(guò)光鏡觀察各組小鼠結(jié)腸的病理變化，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-17可能減輕UC小鼠結(jié)腸組織的病理?yè)p傷，使得潰瘍得到抑制并逐漸愈合。本研究結(jié)果表明，UC小鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著增加，導(dǎo)致潰瘍加重，而過(guò)表達(dá)miR-17可使小鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯下降；同時(shí)，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了Bim mRNA、PTEN mRNA及Bim蛋白的表達(dá)情況，也得出上述結(jié)論。提示過(guò)表達(dá)miR-17可能是通過(guò)降低Bim蛋白表達(dá)而抑制了PTEN/Akt通路，下調(diào)UC小鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞的凋亡，從而使得UC小鼠的結(jié)腸組織潰瘍受到抑制。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miR-17對(duì)UC小鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低Bim蛋白表達(dá)及抑制PTEN/Akt通路有關(guān)，推測(cè)miR-17可能是UC的新靶點(diǎn)，但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。