唾液生物標(biāo)志物在口腔癌篩查中的應(yīng)用

黃璐 戴杰 吳燕岷

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔內(nèi)科 杭州 310009；2.杭州市大江東醫(yī)院口腔科 杭州 311225；3.臺(tái)州醫(yī)院路橋院區(qū)口腔科 臺(tái)州 318050

口腔癌是一種頭頸癌，是一個(gè)嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，屬于人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，5年死亡率約為50%，其中最為常見(jiàn)的是口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma）[1]?？谇话┑拇婊盥嗜Q于準(zhǔn)確的部位和確診時(shí)的癌癥分期。2011年SEER數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，在考慮初始診斷階段、性別、種族、年齡組和治療方式的情況下，口腔癌患者的5年存活率約為57%，其中T1期癌癥患者的生存率大約能達(dá)到90%。因此，強(qiáng)調(diào)早期發(fā)現(xiàn)以提高患者的生存率，但是各種原因往往導(dǎo)致患者確診時(shí)已經(jīng)處于癌癥晚期（T3～T4期）[2-3]，嚴(yán)重影響了口腔癌的預(yù)后。

目前應(yīng)用于口腔癌檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法仍然是全面的臨床檢查、昂貴的生化檢測(cè)和具有侵入性的活組織檢查，所以尋找從生物體液（血液、尿液、唾液）中用于鑒定的生物標(biāo)志物具有早期診斷的潛在價(jià)值[4]。已有多項(xiàng)研究[5-6]證明唾液中含有的許多成分能夠反映患者在病理?xiàng)l件下的代謝水平；在唾液中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多種可能作為診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的潛在生物標(biāo)志物[7]。本文在簡(jiǎn)單介紹口腔癌及唾液生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)上，回顧匯總了口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)領(lǐng)域的潛在唾液生物標(biāo)志物，從多個(gè)環(huán)節(jié)分析了研究中存在的一些問(wèn)題與挑戰(zhàn)，對(duì)唾液生物標(biāo)志物在口腔鱗狀細(xì)胞癌領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值及未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了探討。

1 唾液生物標(biāo)志物簡(jiǎn)介

唾液是由唾液腺分泌液、齦溝液和黏膜滲出液等構(gòu)成的混合性液體，儲(chǔ)存了大量的人類(lèi)口腔微生物和口腔局部組織以及身體其他部位感染微生物的DNA、RNA、蛋白質(zhì)及代謝產(chǎn)物。另一方面，生物標(biāo)志物是正常生物學(xué)、病理學(xué)過(guò)程和對(duì)治療的藥理學(xué)反應(yīng)過(guò)程中變化的分子特征與指標(biāo)，可以為疾病的檢測(cè)、診斷和預(yù)后提供有用的信息。唾液是一種生物標(biāo)志物檢測(cè)的理想診斷介質(zhì)，其取材具有不侵襲性、易于采集、攜帶方便、貯存與運(yùn)輸成本低等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。

唾液中蛋白質(zhì)含量較低，成份比血清簡(jiǎn)單[10-11]。血液或血清中有大量的分子，這使得檢測(cè)低含量和相對(duì)隱蔽的生物標(biāo)志物變得困難。與血液不同的是，唾液中的生物標(biāo)志物被稀釋并易于獲取，可以使用高靈敏度的擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，比如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、Luminex xMAP液相芯片技術(shù)[12]、承載著納米金屬顆粒的微流控芯片檢測(cè)技術(shù)[13]、電化學(xué)磁珠生物傳感器[14]。這些特性使唾液成為發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的理想生物液體[15-16]。此外，口腔癌和口咽癌與唾液的直接接觸使唾液成為檢測(cè)這些癌癥類(lèi)型的高特異性的、高靈敏性的潛在篩查工具。

2 有關(guān)口腔癌及癌前篩查中潛在唾液生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

在口腔癌和癌前病變的診斷和檢測(cè)方面，關(guān)于唾液蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究很多。目前已有多種基于唾液的生物標(biāo)志物被用于早期發(fā)現(xiàn)口腔癌及癌前篩查[4,17-61]。從1992年底到現(xiàn)在，已有超過(guò)100項(xiàng)研究發(fā)表了120多種潛在唾液生物標(biāo)志物（DNA、RNA、蛋白質(zhì)），包括細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α等]、防御素-1、抑癌基因p53、角蛋白（Cyfra）21-1、組織多肽特異性抗原（tissue polypeptide specific antigen）、雙特異性磷酸酶（dual specificity phosphatase）、亞精胺/精胺-N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶（spermidine/spermine N1 acetyltransferase）、肌動(dòng)蛋白（profilin）、絲切蛋白（cofilin）-1、轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin）等，這些被認(rèn)為是口腔癌及癌前診斷的潛在生物標(biāo)志物。

為了對(duì)唾液生物標(biāo)志物在口腔癌及癌前篩查方面的研究進(jìn)行回顧性分析，筆者在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了文獻(xiàn)檢索，檢索詞包含：“saliva”、“salivary”、“biomarker”、“oral cancer”、“precancer”（檢索詞單獨(dú)或幾個(gè)配對(duì)進(jìn)行檢索）；文獻(xiàn)發(fā)表時(shí)限設(shè)置為1995年1月至2018年6月。排除綜述、論述、技術(shù)類(lèi)文章等非研究性論文之后，進(jìn)一步對(duì)文獻(xiàn)標(biāo)題及摘要進(jìn)行閱讀，去掉以下文獻(xiàn)：1）研究對(duì)象非人類(lèi)；2）缺乏對(duì)照或患者群體；3）研究方法缺乏清晰描述。最終篩選出的文獻(xiàn)是通過(guò)比較人類(lèi)正常對(duì)照組和口腔癌患病組來(lái)研究該領(lǐng)域的潛在唾液生物標(biāo)志物的研究型論文，共計(jì)61篇。

2.1 樣品的采集方法

在所有的61項(xiàng)研究中，有47項(xiàng)研究表明是對(duì)整個(gè)唾液和特定的腺體唾液都進(jìn)行了分析；在分析未刺激和刺激后采集唾液之間，有42項(xiàng)研究選擇了刺激后收集唾液進(jìn)行分析；39項(xiàng)研究考慮了在采樣前不同時(shí)期的口腔刺激，如飲食和口腔衛(wèi)生習(xí)慣；大多數(shù)研究收集唾液的時(shí)間是早上，但沒(méi)有提到準(zhǔn)確的收集時(shí)間。

2.2 樣品檢測(cè)前的處理方式

在唾液取樣后，通常采用離心去除固體成分（包括食物殘?jiān)?，但是不同研究采用的離心參數(shù)不同，包含以下方案：800g離心10 min、2 000g離心10 min、2 600g離心15 min、2 000 r·min-1離心5 min、14 000 r·min-1離心20 min等[4,17-61]，其中也有少數(shù)研究在不離心的情況下直接對(duì)整個(gè)唾液進(jìn)行評(píng)估[56-57]。一般情況下，先冷凍樣品，在進(jìn)行后續(xù)分析之前才取出離心，所以大多數(shù)有關(guān)唾液生物標(biāo)志物的研究只分析了唾液樣本中不包含細(xì)胞的部分，但是唾液中70%的DNA來(lái)自于口腔黏膜細(xì)胞，離心處理導(dǎo)致了一些潛在生物標(biāo)志物的遺漏。另外，少數(shù)研究會(huì)使用RNA酶或蛋白酶抑制劑來(lái)減少唾液RNA和蛋白質(zhì)的降解[49,58-59]；大多數(shù)研究中并沒(méi)有添加任何抑制劑，都是直接離心后將上清樣品儲(chǔ)存在-80～4 ℃環(huán)境中[40]，但是信使RNA（messenger RNA，mRNA）性質(zhì)特別不穩(wěn)定，在幾分鐘內(nèi)就可以完全降解；僅有3項(xiàng)研究是立即分析樣本。

2.3 樣品的檢測(cè)方法

在唾液生物標(biāo)志物的檢測(cè)方面，常見(jiàn)的檢測(cè)技術(shù)有二維凝膠電泳、ELISA、Luminex xMAP液相芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)定量（Western blot）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）等。因?yàn)槊宽?xiàng)研究采用的檢測(cè)方法都不一致，不同研究相同標(biāo)志物的水平差異較大，無(wú)法進(jìn)行對(duì)比。為了加快唾液生物標(biāo)志物在臨床上的使用，很有必要對(duì)其樣品的采集、儲(chǔ)存及分析等進(jìn)行規(guī)范化，在此基礎(chǔ)上通過(guò)不同的基礎(chǔ)研究找出潛在的唾液生物標(biāo)志物，最終應(yīng)用于臨床測(cè)試。

2.4 研究對(duì)象的選擇

大多數(shù)的研究在選擇患者時(shí)并沒(méi)有特定的選擇標(biāo)準(zhǔn)，僅僅是將收集到的所有患者及正常人進(jìn)行匯總，在此基礎(chǔ)上得到的結(jié)果往往可靠性相對(duì)不強(qiáng)，建議在選取研究對(duì)象時(shí)，設(shè)定一個(gè)明確的篩選標(biāo)準(zhǔn)，比如年齡、性別、臨床表型程度等，盡量縮小組內(nèi)和組間的個(gè)體差異。本文對(duì)已報(bào)道的口腔癌及癌前診斷的唾液生物標(biāo)志物進(jìn)行了整理（表1）。

續(xù)表1

續(xù)表1

2.5 其他因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

口腔作為一種微環(huán)境，其外傷、牙菌斑、牙齦炎、牙周炎、真菌感染等疾病都會(huì)導(dǎo)致微生物、促炎細(xì)胞因子等的變化，在一定程度上會(huì)影響口腔癌和癌前病變的唾液生物標(biāo)志物水平。因此，為了驗(yàn)證口腔癌特定唾液生物標(biāo)志物的可靠性，需要對(duì)具有普通非腫瘤性口腔炎性疾病的個(gè)體進(jìn)行可能的唾液生物標(biāo)志物的研究。但是，在不考慮其他炎癥條件的情況下，建議盡可能根據(jù)唾液生物標(biāo)志物水平來(lái)診斷口腔癌、癌前病變。

許多潛在的口腔癌唾液生物標(biāo)志物，如8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和丙二醛在肺癌和乳腺癌等不同癌癥中也會(huì)發(fā)生改變[60-61]，說(shuō)明多個(gè)唾液生物標(biāo)志物可能會(huì)因一種以上癌癥的存在而顯著改變，在這種情況下可以考慮唾液生物標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)口腔癌，增加診斷結(jié)果的可靠性及特異性。然而，有關(guān)唾液生物標(biāo)志物聯(lián)合診斷口腔癌的研究很少，需要進(jìn)一步的深入。已研究報(bào)道的多種唾液生物標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)情況匯總見(jiàn)表1。

2.6 唾液微生物作為潛在生物標(biāo)志物的應(yīng)用價(jià)值

就唾液微生物種類(lèi)而言，雖然已有研究證明正常人和口腔癌患者的微生物種類(lèi)和數(shù)量存在差異，比如流感嗜血菌、棒桿菌、卟啉單胞菌、羅卡利馬氏體、芽孢桿菌等[47]。但是，微生物之間的差異受多種因素（比如年齡、性別等）綜合影響。因此，有關(guān)唾液微生物在口腔癌中應(yīng)用的研究還需要進(jìn)一步深入，筆者認(rèn)為將微生物作為潛在的生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用價(jià)值不大。

2.7 應(yīng)用于口腔癌篩查所面對(duì)的問(wèn)題與挑戰(zhàn)

從多個(gè)方面對(duì)檢索到的文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，筆者發(fā)現(xiàn)有關(guān)唾液生物標(biāo)志物在口腔癌及癌前篩查領(lǐng)域的研究尚處于早期階段，很多相關(guān)問(wèn)題及挑戰(zhàn)亟待解決。例如：唾液樣本的采集、處理和儲(chǔ)存缺乏標(biāo)準(zhǔn)化；口腔癌、癌前和健康個(gè)體的潛在唾液生物標(biāo)志物水平存在廣泛的不一致性和不穩(wěn)定性，唾液生物標(biāo)志物的特異性及靈敏性有待進(jìn)一步驗(yàn)證；微小RNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA等[41-42]最新RNA領(lǐng)域研究相對(duì)空白，尚無(wú)可單獨(dú)用于口腔癌診斷的唾液指標(biāo)；需要標(biāo)準(zhǔn)化口腔唾液生物標(biāo)志物，以適應(yīng)不同的慢性口腔炎性疾病和其他類(lèi)型的癌癥患者；為了排除其他癌癥對(duì)唾液生物標(biāo)志物水平的影響，提高口腔癌及癌前篩查的診斷效果，可以合理聯(lián)合檢測(cè)多種唾液生物標(biāo)志物。使唾液生物標(biāo)志物在臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)中標(biāo)準(zhǔn)化的步驟可歸納為3步：1）唾液樣本采集、處理和分析方法的標(biāo)準(zhǔn)化；2）明確非癌癥患者和癌癥患者中不同水平的唾液生物標(biāo)志物；3）唾液生物標(biāo)志物的確認(rèn)。

3 唾液生物標(biāo)志物的未來(lái)展望

唾液易于采集、處理、儲(chǔ)存，且含有高質(zhì)量的DNA，是血液的完美替代品。唾液組學(xué)的研究對(duì)于識(shí)別疾病的高特異性及靈敏性生物標(biāo)志物和潛在的藥物靶點(diǎn)具有重要作用。唾液基因組學(xué)還具有遺傳篩查、早期疾病診斷的潛力。目前，唾液及其在疾病診斷中的應(yīng)用研究仍處于初級(jí)階段，由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的方法和技術(shù)，這些研究的進(jìn)展受到了限制，且相互之間可比性很低，因此急需開(kāi)發(fā)一套唾液生物標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)化鑒定系統(tǒng)。唾液組學(xué)的系統(tǒng)知識(shí)網(wǎng)絡(luò)和疾病的精確生物標(biāo)志物有助于更好地理解口腔健康和系統(tǒng)健康之間的關(guān)系，這將促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的應(yīng)用，促進(jìn)精準(zhǔn)、無(wú)痛、方便的靶向治療的個(gè)性化。