兩種獼猴屬動物腸道微生物多樣性比較研究

趙俊松a,，張 梅a，桑正林，吳銀梅

(昭通學(xué)院 a.科技處；b.農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昭通 657000)

1 引言

動物與體內(nèi)腸道微生物在長期的共生過程中，形成了一個相互影響、相互作用的整體系統(tǒng)[1, 2]，促使對動物腸道微生物組成結(jié)構(gòu)的研究成為當(dāng)今科學(xué)研究的熱點(diǎn)，受到了廣泛的關(guān)注。目前，相關(guān)研究結(jié)果顯示人類的飲食、年齡、基因型、生活環(huán)境和相關(guān)疾病對體內(nèi)腸道微菌群的組成都具有重要的影響作用[3-9]。而在動物的整個進(jìn)化過程中，腸道微生物是否會產(chǎn)生相應(yīng)的協(xié)同進(jìn)化也是目前的研究熱點(diǎn)。通過分子生物學(xué)手段和宏基因再測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，宿主基因與腸道微生物結(jié)構(gòu)間存在著密切的聯(lián)系，宿主腸道微生物群落結(jié)構(gòu)存在著個體差異的特性[10]。對同卵雙胞胎和沒有血緣關(guān)系人群的腸道微生物結(jié)構(gòu)的比對分析發(fā)現(xiàn)，宿主的基因型對腸道微生物組成結(jié)構(gòu)具有顯著的影響，同卵雙胞胎腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)相似度比沒有血緣關(guān)系的人群腸道微生物組成結(jié)構(gòu)更相似[11]。Goodrich等人[3]對來自英國的1 000對雙胞胎腸道微生物進(jìn)行對比分析也揭示了腸道微生物多樣性受宿主遺傳學(xué)影響。即相關(guān)結(jié)果揭示了宿主腸道微生物的組成與宿主的遺傳背景間存在重要的聯(lián)系。因此，了解特定動物類群中共有的腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)，對研究動物腸道微生物與宿主本身的協(xié)同進(jìn)化具有重要意義。

非人靈長類動物(Non-human primates)起源于熱帶雨林地區(qū)，經(jīng)過輻射擴(kuò)散作用進(jìn)入到溫帶低地地區(qū)[12]，目前對相應(yīng)腸道微生物組成結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果分別揭示了白眉長臂猿(Hylobateshoolock)、黑猩猩(Pantroglodytes)、川金絲猴(Rhinopithecusroxellanae)[13]黑吼猴(Alouattacaraya)[14,15]、狐猴(Eulemurcollaris)[16]、藏酋猴[17]、食蟹猴(Macacafascicularis)[18]和恒河猴[19]等非人靈長類動物的腸道微生物組成結(jié)構(gòu)。同時，相關(guān)靈長類動物分布研究結(jié)果顯示，在中國分布著7種獼猴屬靈長類動物，其中恒河猴和藏酋猴在中國境內(nèi)分布最廣，數(shù)量較多；但相應(yīng)的研究主要集中在揭示單個物種組成結(jié)構(gòu)特征，對同屬動物間的腸道微生物組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對分析的研究較少，特別是對生活環(huán)境相似，食性相似的同屬靈長類動物的腸道微生物結(jié)構(gòu)特征的對比研究較缺乏；而藏酋猴和恒河猴在中國的分布廣、數(shù)量多、食性和生活環(huán)境相似且均屬于獼猴屬非人靈長類動物，是研究動物屬間腸道微生物組成結(jié)構(gòu)特征的理想選擇。因此，本研究基于上述研究對恒河猴和藏酋猴腸道微生物的高通量測序鑒定結(jié)果進(jìn)行整理分析；比較兩種食性相似、生活環(huán)境相似的獼猴屬非人靈長類動物腸道微生物組成結(jié)構(gòu)；揭示其食性、遺傳和其他生活環(huán)境因素對動物腸道微生物組成結(jié)構(gòu)的影響機(jī)制；為獼猴屬靈長類動物腸道微生物相關(guān)研究提供理論依據(jù)，同時為研究動物腸道微生物與宿主本身的協(xié)同進(jìn)化提供新的見解。

2 材料與方法

本研究的研究對象藏酋猴和恒河猴均屬于獼猴屬中分布較為廣泛的類群，其中藏酋猴屬于獼猴屬動物中體型較大的一個類群，也是中國特有的靈長類動物之一，其主要分布于中國的中部地區(qū)，東至浙江、福建，西到四川，北達(dá)秦嶺南部，南至西藏南部[20]。糞便樣本來源于中國安徽黃山(118°11′W, 30°29′N)，平均海拔1841m，地處溫帶和亞熱帶交界地帶[21]；通過相關(guān)研究者的跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)其棲息地為落葉和常綠闊葉混合山地森林，其攝食的食物一般包括包括樹葉、水果、草，還有少量植物的花、根和昆蟲等，屬于雜食性靈長類動物[22,23]。恒河猴是目前世界分布最廣的非人靈長類動物，主要分布于南北回歸線之間的熱帶和亞熱帶地區(qū)，主要集中分布在中國大部至印度尼西亞間的南亞各國和日本[24]。在中國，除靠北的新疆、內(nèi)蒙、寧夏和東北外，其余各省均有恒河猴分布，屬于較為常見的非人靈長類動物[24]；其食物資源主要包括植物果實(shí)、花、樹葉和嫩芽等，且隨季節(jié)變化會存在一定的差異[25]。本研究的樣本來源于中國的西藏、大理、貴陽、南寧、西昌和?？诹鶄€野生恒河猴集聚區(qū)，其生活環(huán)境以常綠闊葉林為主。

本研究通過對Zhao等(2018)對恒河猴腸道微生物16SrRNA的高變區(qū)進(jìn)行測序揭示了36個野生恒河猴腸道微生物組成結(jié)果[19](從已發(fā)表的論文和聯(lián)系作者獲取的相關(guān)數(shù)據(jù))和Sun等(2016)對藏酋猴腸道微生物的16SrRNA的高變區(qū)進(jìn)行測序揭示了48個野生藏酋猴腸道微生物組成結(jié)果(從已發(fā)表的論文中獲取的數(shù)據(jù))[17]進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析；由于上述研究均是基于16SrRNA對動物腸道微生物菌群的研究，雖然所測區(qū)域存在差異，但通過序列比對后對動物腸道微生物的鑒定數(shù)據(jù)能準(zhǔn)確揭示出動物腸道微生物的組成特征，所以本研究基于上述研究對恒河猴和藏酋猴腸道微生物的高通量測序鑒定結(jié)果進(jìn)行整理分析；比對兩種獼猴屬非人靈長類動物腸道微生物組成結(jié)構(gòu)；通過Excel比對恒河猴和藏酋猴腸道微生物在門分類水平和屬分類水平上的共有和特有菌群，計算所占百分比，并通過VN圖進(jìn)行作圖展示；通過Origin pro 2018對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行箱線圖制作并通過SPSS2.0對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行T值檢驗(yàn)。揭示兩種在中國廣泛分布的兩種獼猴屬動物腸道微生物組成結(jié)構(gòu)特征；揭示獼猴屬動物腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 恒河猴和藏酋猴腸道微生物在門分類水平上的組成特征

我們將恒河猴和藏酋猴兩種獼猴屬動物腸道微生物在門分類水平上豐富度>0.01%的菌群進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn)，恒河猴和藏酋猴腸道微生物組成中均以Firmicutes和Bacteriodetes占主導(dǎo)地位，但豐富度存在差異；其中在門分類水平上Firmicutes(Mt=43.43±8.50%; Mm=53.60±8.65%)、Bacteriodetes(Mt=35.20±6.39%; Mm=33.60±11.87%)、Proteobacteria(Mt=14.66±8.77%; Mm=0.75±0.44%)、Actinobacteria(Mt=0.48±0.62%; Mm=1.55±1.29%)和Spirochaetia(Mt=2.03±2.25%; Mm=1.36±1.83%)菌群為恒河猴和藏酋猴共有的腸道微生物。Verrucomicrobia為藏酋猴種群特有腸道微生物；Tenericutes、Cyanobacteria和Fibrobacteres為恒河猴種群特有腸道微生物。恒河猴和藏酋猴共有菌群豐富度占藏酋猴腸道微生物總量的95.81%，占分離鑒定出種類豐富度的98.96%；占恒河猴腸道微生物總量的90.87%，占分離鑒定出種類豐富度的91.34%(圖1)。為了更進(jìn)一步的揭示藏酋猴和恒河猴共有腸道微生物在門分類水平的豐富度特征，我們對兩者共有的5種腸道微生物豐富度進(jìn)行了T值配對檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在門分類水平上，藏酋猴和恒河猴腸道微生物中Firmicutes(T=-4.984，df=35，P<0.05)、Proteobacteria(T=9.851，df=35，P<0.05)和Actinobacteria(T=-4.446，df=35，P<0.05)豐富度均存在顯著差異(圖1)。其中在恒河猴腸道微生物中Firmicutes和Actinobacteria豐富度顯著高于藏酋猴；藏酋猴腸道微生物中Proteobacteria豐富度顯著高于恒河猴。

圖1 恒河猴和藏酋猴腸道微生物門分類水平的比較(豐富度>0.01%);a.VN圖表示重疊種類；b.重疊菌群豐富度箱線圖,“*”表示差異性顯著，P<0.05.

Fig.1 Comparison of gut microbiota phylum levels between rhesus macaques and Tibetan macaques (richness >0.01%); a.VN maps indicate overlapping species; b. overlapping flora abundance box plots, "*" indicates differences Significantly significant, P<0.05.

3.2 恒河猴和藏酋猴腸道微生物在屬分類水平上的組成特征

我們將恒河猴和藏酋猴兩種獼猴屬動物腸道微生物在屬分類水平上豐富度>0.01%的菌群進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在屬分類水平上，藏酋猴和恒河猴腸道微生物中共有菌群共有13種，包括Succinivibrio、Helicobacter、Faecalibacterium、Oscillibacter、Alloprevotella、Dialister、Blautia、Roseburia、Lachnospiracea、Catenibacterium、Anaerostipes、Flavonifractor和Dorea。其中Prevotella、Porphyromonadaceae和Treponema等17個屬為藏酋猴種群特有腸道微生物；Lactobacillus、Megasphaera和Subdoligranulum等28個屬為恒河猴種群特有腸道微生物。恒河猴和藏酋猴共有菌群豐富度占藏酋猴腸道微生物總量的27.43%，占分離鑒定出種類豐富度的50.63%；占恒河猴腸道微生物總量的9.31%，占分離鑒定出種類豐富度的42.21%(圖2)。對兩者共有的13種腸道微生物豐富度進(jìn)行了T值配對檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在屬分類水平上，藏酋猴和恒河猴腸道微生物中Succinivibrio(T=13.318，df=36，P<0.05)、Helicobacter(T=5.558，df=36，P<0.05)、Oscillibacter(T=5.591，df=36，P<0.05)、Blautia(T=-3.417，df=36，P<0.05)、Lachnospiracea(T=5.108，df=35，P<0.05)、Catenibacterium(T=-4.162，df=36，P<0.05)、Flavonifractor(T=5.098，df=36，P<0.05)和Dorea(T=-4.663，df=36，P<0.05) 8中菌群豐富度均存在顯著差異(圖2)。其中在恒河猴腸道微生物中Blautia、Catenibacterium和Dorea豐富度顯著高于藏酋猴；藏酋猴腸道微生物中Succinivibrio、Helicobacter、Oscillibacter、Lachnospiracea和Flavonifractor豐富度顯著高于恒河猴。

圖2 恒河猴和藏酋猴腸道微生物屬分類水平的比較(豐富度>0.01%);a.VN圖表示重疊種類；b.重疊菌群豐富度箱線圖,“*”表示差異性顯著，P<0.05.

Fig.2 Comparison of gut microbiota genus levels between rhesus macaques and Tibetan macaques (richness >0.01%); a.VN maps indicate overlapping species; b. overlapping flora abundance box plots, "*" indicates differences Significantly significant, P<0.05.

3.3 藏酋猴、恒河猴和食蟹猴腸道微生物在屬分類水平上的特征

為了更進(jìn)一步的揭示獼猴屬非人靈長類動物腸道微生物在屬分類水平上的組成特征，我們將恒河猴和藏酋猴腸道微生物在屬分類水平上的豐富度>0.01%的菌群平均豐富度與Li等在2018年所測得的食蟹猴腸道微生物在屬分類水平上的豐富度>0.01%的菌群平均豐富度[18]進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，在屬分類水平上，藏酋猴、恒河猴和食蟹猴腸道微生物中共有菌群共有7種(圖3)，包括Catenibacterium、Dialister、Faecalibacterium、Blautia、Dorea、Roseburia和Helicobacter。其中恒河猴與食蟹猴共有菌群包括Lactobacillus、Megasphaera和Subdoligranulum等15種；藏酋猴與食蟹猴共有菌群包括Prevotella、Ruminococcus和Clostridium等5種；恒河猴與藏酋猴共有菌群包括Succinivibrio、Lachnospira和Oscillibacter等4種。其中Helicobacter菌群豐富度在藏酋猴中的豐富度較高；Catenibacterium、Dialister、Faecalibacterium和Blautia菌群豐富度在恒河猴中的豐富度較高；而食蟹猴在共有的7中腸道微生物豐富度均較低(圖3)。

圖3 恒河猴、藏酋猴和食蟹猴腸道微生物屬分類水平的比較(豐富度>0.01%); a.VN圖表示重疊種類；b.重疊菌群豐富度柱狀圖.

Figure 3 Comparison of the taxonomic levels of the gut flora of rhesus macaques, Tibetan macaques and cynomolgus macaques (richness >0.01%); a.VN maps indicate overlapping species; b. overlapping flora abundance histograms.

4 討論

4.1 獼猴屬靈長類動物腸道微生物門分類水平組成特征分析

我們的分析結(jié)果顯示，在腸道微生物門分類水平上Firmicutes、Bacteriodetes、Proteobacteria、Actinobacteria和Spirochaetia菌群為恒河猴和藏酋猴共有的腸道微生物，其中藏酋猴上述5個門菌群豐富度占整個腸道微生物豐富度的95.81%，其中Firmicutes和Bacteriodetes豐富度占總豐富度的78.64%；恒河猴上述5個門菌群豐富度占整個腸道微生物豐富度的90.87%，其中Firmicutes和Bacteriodetes豐富度占總豐富度的87.20%；這與人類和其他哺乳動物的腸道微生物組成結(jié)構(gòu)相似[26,27,28]，以Firmicutes和Bacteriodetes占主導(dǎo)地位；先前的相關(guān)研究結(jié)果揭示了動物腸道微生物中的Firmicutes中含有大量能夠編碼與動物能量代謝相關(guān)的酶的基因，能夠編碼產(chǎn)生多種動物體內(nèi)的消化酶，幫助宿主消化分解多種大分子物質(zhì)，促進(jìn)宿主對相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收作用[29]。而Bacteriodetes的主要功能則是降解宿主體內(nèi)的糖類物質(zhì)和蛋白質(zhì)物質(zhì)，促進(jìn)對糖水化合物的分解作用[30-33]。這或許也表明Firmicutes和Bacteriodetes在哺乳動物中的豐富度高與其宿主的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制存在一定的協(xié)同作用，高豐富度的Firmicutes和Bacteriodetes能有效的促進(jìn)其宿主的食物消化過程，有助于其能量的攝取，從而增強(qiáng)其對不同生活環(huán)境的適應(yīng)性。另外我們還發(fā)現(xiàn)在獼猴屬的恒河猴和藏酋猴動物腸道微生物中還存在著一定量的Proteobacteria、Actinobacteria和Spirochaetia菌群，盡管目前對相關(guān)菌群對宿主所產(chǎn)生的功能還不明確，但在對獼猴屬另一種動物食蟹猴腸道微生物的組成的研究中也發(fā)現(xiàn)含有一定量的上述菌群[18]，或許這表明Firmicutes、Bacteriodetes、Proteobacteria、Actinobacteria和Spirochaetia在獼猴屬非人靈長類動物腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)中扮演著核心菌群的角色；豐富度的變化或許與其環(huán)境適應(yīng)性存在聯(lián)系更大。

本研究的結(jié)果還顯示了，在獼猴屬靈長類動物中恒河猴和藏酋猴的腸道微生物中均存在部分種群特有菌群，在門分類水平上恒河猴特有的菌群包括Tenericutes、Cyanobacteria和Fibrobacteres，藏酋猴種群特有腸道微生物包括Verrucomicrobia，而目前的研究揭示Verrucomicrobia屬于土壤環(huán)境中的優(yōu)勢菌群[34]，但對于其在動物腸道中的因果關(guān)系并不明確，需要進(jìn)一步的研究確定。同時，恒河猴腸道微生物菌群中存在的種群特有菌群與宿主的相關(guān)作用機(jī)制目前的研究報道較缺乏，相關(guān)作用機(jī)制也不明確；但葉莉等學(xué)者在2015年的中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會上的摘要報道揭示了在中國不同恒河猴種群體內(nèi)均存在上述三種菌群，其推測該類菌群的豐富度與食性和環(huán)境生態(tài)存在一定關(guān)系[35]。或許這類菌群的存在與動物生活的環(huán)境存在一定的相關(guān)性，但具體的因果關(guān)系需要進(jìn)一步的研究進(jìn)行揭示確定。

4.2 獼猴屬靈長類動物腸道微生物屬分類水平組成特征分析

由于實(shí)驗(yàn)方法的差異和現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)量的限制使其先前的研究對恒河猴和藏酋猴腸道微生物在屬分類水平上分離鑒定出的菌群占總體的比例較小，但對其已鑒定出來的菌群對揭示動物腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)也具有重要意義。因此，我們對已鑒定出的腸道微生物在恒河猴和藏酋猴腸道微生物屬分類水平上的比對發(fā)現(xiàn)Succinivibrio、Helicobacter、Faecalibacterium、Oscillibacter、Alloprevotella、Dialister、Blautia、Roseburia、Lachnospiracea、Catenibacterium、Anaerostipes、Flavonifractor和Dorea為其共有的腸道微生物，與Li等在2018年研究得到的食蟹猴腸道微生物[18]在屬分類水平上的豐富度>0.01%的菌群平均豐富度進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，在屬分類水平上，藏酋猴、恒河猴和食蟹猴腸道微生物中共有菌群共有7種，包括Catenibacterium、Dialister、Faecalibacterium、Blautia、Dorea、Roseburia和Helicobacter。其中相關(guān)研究顯示Blautia具有水解植物葡糖神經(jīng)酰胺(GluCer)能力的菌株[36]，這或許與其獼猴屬動物屬于雜食性的食性有關(guān)，該菌群在宿主對植物性食物的消化中具有重要作用；Dialister是一種導(dǎo)致人類牙周炎的病原菌[37]，或許這與獼猴屬動物屬于雜食性動物也存在一定的聯(lián)系；Roseburia是一種從人類糞便中分離出來，在機(jī)體糖酵解過程中產(chǎn)丁酸的菌群[38]，與宿主的能量代謝存在一定聯(lián)系。而目前的研究結(jié)果揭示Helicobacter和Faecalibacterium豐富度可能與動物體的健康程度存在一定關(guān)系[39-41]，對其與宿主間的協(xié)同適應(yīng)機(jī)制并不確定，有待進(jìn)一步的研究揭示。盡管其上述7種菌群在恒河猴、藏酋猴和食蟹猴中的豐富度存在差異，但這在三種獼猴屬動物腸道微生物中均存在，且部分菌群與其食性存在相應(yīng)關(guān)系；或許表明在動物適應(yīng)性進(jìn)化過程中，腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)受動物食性和生活環(huán)境的影響更大。通過對比我們發(fā)現(xiàn)在恒河猴、藏酋猴和食蟹猴體內(nèi)腸道微生物中存在包括Lactobacillus、Ruminococcus和Fibrobacter等大部分種群特有菌群。目前的相關(guān)研究也揭示了Lactobacillus[42]、Ruminococcus[43]和Fibrobacter[44]等菌群與動物的食性和代謝存在一定的關(guān)系。這或許從另一方面證明了動物適應(yīng)性進(jìn)化過程中，腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)與動物食性和生活環(huán)境的協(xié)同作用更明顯。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)在獼猴屬動物腸道微生物組成門分類水平中Firmicutes、Bacteriodetes、Proteobacteria、Actinobacteria和Spirochaetia作為核心菌群存在于獼猴屬非人靈長類動物腸道中，在屬分類水平中Catenibacterium、Dialister、Faecalibacterium、Blautia、Dorea、Roseburia和Helicobacter作為核心菌群存在于獼猴屬非人靈長類動物腸道中；從門分類水平和屬分類水平中，獼猴屬動物腸道微生物共有核心菌群所占比例顯著大于種群特有菌群，但在不同物種中豐富度存在顯著差異；或許表明環(huán)境和食性等其他因素比遺傳效應(yīng)對動物腸道微生物組成結(jié)構(gòu)的影響更大。通過對獼猴屬的兩種非人靈長類動物腸道微生物組成結(jié)構(gòu)的對比綜述，我們發(fā)現(xiàn)目前的相關(guān)研究主要集中在揭示動物類群的腸道微生物組成結(jié)構(gòu)方面，對其腸道微生物與宿主間的協(xié)同適應(yīng)機(jī)制的研究報道也主要是腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)方面，所得結(jié)論并不能揭示其具體的適應(yīng)機(jī)制；特別是對相關(guān)菌群與宿主間的作用機(jī)理的研究較缺乏，后續(xù)的相關(guān)研究可以通過相應(yīng)驗(yàn)證性試驗(yàn)研究，從而準(zhǔn)確的揭示腸道微生物與宿主協(xié)同適應(yīng)機(jī)制。