人乳頭瘤病毒疫苗的應(yīng)用及研究進(jìn)展

尤淑文 葉菁 呂衛(wèi)國(guó)

宮頸癌是目前唯一病因明確，可預(yù)防可篩查的腫瘤?；谝患?jí)預(yù)防策略，目前預(yù)防性人乳頭瘤病毒（human papilloma virus,HPV）疫苗已逐漸普及，可有效預(yù)防大部分宮頸癌及生殖器疣。同時(shí)，隨著宮頸癌篩查技術(shù)的成熟及普及，越來(lái)越多的HPV感染狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)，二級(jí)預(yù)防——治療性疫苗的研發(fā)也成為熱點(diǎn)。治療性疫苗可介導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫，產(chǎn)生病毒特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞，殺死HPV感染的細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)HPV誘導(dǎo)的相關(guān)組織損傷，從而降低宮頸癌的發(fā)生率及病死率。本文現(xiàn)針對(duì)預(yù)防性及治療性HPV疫苗的機(jī)制、種類及目前存在的問(wèn)題等研究進(jìn)展作一綜述。

1 HPV預(yù)防性疫苗

1.1 疫苗應(yīng)用效果 目前，中國(guó)食品及藥品管理局已批準(zhǔn)上市了3種預(yù)防性HPV疫苗，分別是2價(jià)疫苗、4價(jià)疫苗和9價(jià)疫苗。這3種疫苗均覆蓋HPV16和18這兩種亞型，4價(jià)疫苗還可預(yù)防約90%與HPV6、11相關(guān)的肛門、生殖器疣。9價(jià)在4價(jià)疫苗的基礎(chǔ)上，增加了對(duì)31、33、45、52、58型 HPV 的預(yù)防，即 9價(jià) HPV 疫苗可預(yù)防約90%的宮頸癌及90%的肛門、生殖器疣[1-2]。

有研究表明，接種9價(jià)HPV疫苗的人群5年后仍可檢測(cè)到持續(xù)性HPV抗體應(yīng)答，并證明其抗體應(yīng)答是持久的[3]。而接種4價(jià)疫苗6年后，14～19歲女性的4價(jià)疫苗相關(guān)HPV感染率下降了64%[4]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，接種4價(jià)HPV疫苗的女性在10年的隨訪中均未檢查出與HPV 16、18型相關(guān)的高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變（cervical intraepithelial neoplasia 2/3，CIN 2/3），證明 4 價(jià)疫苗可持續(xù)提供至少10年的保護(hù)作用，其效力至少在10年內(nèi)保持在90%以上[5]。一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)9.4年的隨訪研究表明，接種2價(jià)疫苗3年后，接種人群中沒(méi)有發(fā)生HPV16、18感染及其相關(guān)的癌前病變及癌變，并且接種人群的HPV抗體滴度在9年后仍保持高水平狀態(tài)[6]。

1.2 疫苗接種實(shí)施方案 臨床研究提示，年齡＜15歲及年齡≥15歲的女性分別接受2劑及3劑HPV疫苗，其抗體滴度無(wú)顯著差異。因此世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）在 2015年對(duì) HPV 疫苗（包括2、4、9價(jià)疫苗）劑量實(shí)施方案進(jìn)行修訂，將＜15歲女性的3劑HPV疫苗方案改為2劑，但≥15歲女性仍推薦3劑方案[7]。使用上述疫苗實(shí)施方案可有效降低疫苗成本并提高覆蓋率[8]。

隨著疫苗研究不斷進(jìn)展，9價(jià)疫苗已經(jīng)被證實(shí)可預(yù)防的HPV范圍更廣，接種過(guò)2價(jià)或4價(jià)疫苗的個(gè)體可繼續(xù)接種9價(jià)疫苗鞏固、增強(qiáng)疫苗保護(hù)作用。注射4價(jià)或2價(jià)疫苗未滿3劑者，補(bǔ)注射9價(jià)疫苗至滿3劑，其抗體滴度水平以及新增加的亞型產(chǎn)生的抗體水平同樣具有保護(hù)效力。完成2價(jià)或4價(jià)疫苗的3劑接種計(jì)劃后再接種9價(jià)疫苗可以使抗體滴度達(dá)到一個(gè)較高并且穩(wěn)定的水平[9]。

1.3 注射HPV預(yù)防性疫苗人群的宮頸癌篩查方案接種預(yù)防性HPV疫苗并不能取代常規(guī)宮頸癌篩查，因?yàn)楝F(xiàn)有的預(yù)防性疫苗并不能覆蓋所有HPV致癌型別。此外，不是所有人群都能在指定的年齡階段進(jìn)行疫苗接種，故無(wú)法確認(rèn)在接種疫苗前是否已接觸過(guò)高危型HPV[10]，且不是所有人均在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成接種計(jì)劃[11]。故無(wú)論是否接種過(guò)HPV疫苗，均有進(jìn)行定期篩查的必要性。2018年美國(guó)預(yù)防服務(wù)工作組（United States Preventive Services Task Force，USPSTF）仍推薦 21～29 歲女性每3年進(jìn)行一次宮頸細(xì)胞學(xué)檢查，30～65歲女性每3年進(jìn)行一次宮頸細(xì)胞學(xué)檢查，或每5年進(jìn)行一次HPV檢查聯(lián)合宮頸細(xì)胞學(xué)檢查以篩查宮頸癌[12]。

2 HPV治療性疫苗的研究進(jìn)展

治療性疫苗不同于預(yù)防性疫苗，其可誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，并對(duì)HPV感染誘導(dǎo)的宮頸損傷及癌癥產(chǎn)生治療作用。

2.1 治療性疫苗的臨床意義 首先，預(yù)防性疫苗的普及受到一定的限制。至2016年末，雖有70個(gè)國(guó)家已將預(yù)防性疫苗列入國(guó)家免疫規(guī)劃[13]，但預(yù)防性疫苗的應(yīng)用主要集中在發(fā)達(dá)國(guó)家，欠發(fā)達(dá)國(guó)家的應(yīng)用率僅8%[14]，而欠發(fā)達(dá)國(guó)家才是宮頸癌，肛門、生殖器疣高發(fā)地區(qū)。其次，預(yù)防性疫苗無(wú)法消除已經(jīng)存在的感染及已經(jīng)形成的損傷，故預(yù)防性疫苗沒(méi)有治療效果。目前清除已感染細(xì)胞的有效途徑為治療性疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫[6，15]。

目前臨床中對(duì)宮頸病變的主要治療方法為物理方法切除，但切除術(shù)對(duì)機(jī)體損傷大且易復(fù)發(fā)。故研發(fā)HPV治療性疫苗迫在眉睫，以干預(yù)HPV感染所致的低級(jí)別病變的進(jìn)展、誘導(dǎo)現(xiàn)有病變的消退、預(yù)防治療后復(fù)發(fā)。

2.2 治療性疫苗的作用機(jī)制 病原體穿透機(jī)體上皮或黏膜屏障時(shí)，病毒衣殼中的病原體相關(guān)分子（pathogen associated molecular pattern,PAMPs）被病原體識(shí)別受體（pathogen recognition receptor,PRRs）識(shí)別。PRRs的激活促使抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APCs）流入感染部位并吞噬抗原，其后攜帶抗原遷移到淋巴結(jié)，進(jìn)一步激活T細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。激活的T細(xì)胞增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞，可直接消滅病毒感染的細(xì)胞。同時(shí)，IL-10等細(xì)胞因子促進(jìn)B細(xì)胞的增殖與分化，產(chǎn)生抗體，以應(yīng)對(duì)細(xì)胞外病原體。

HPV 基因組編碼的 7 個(gè)早期蛋白（E1、E2、E4、E5、E6、E7、E8）和 2 個(gè)晚期蛋白（L1、L2），均可成為疫苗的抗原靶點(diǎn)。其中，L1、L2編碼病毒衣殼蛋白，于早期感染基底層上皮細(xì)胞時(shí)起作用；E1、E2參與HPV病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖。由于該4種蛋白發(fā)生于病毒生命周期早期，故可成為疾病早期的治療靶點(diǎn)[16-17]。E6、E7可調(diào)控宿主細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，兩者僅存在于HPV誘導(dǎo)的癌前病變及癌變的組織中，故可成為HPV誘導(dǎo)的癌前病變及癌變的免疫治療的理想靶點(diǎn)。

2.3 治療性疫苗的種類 將靶點(diǎn)抗原的相關(guān)遺傳物質(zhì)呈遞至APCs，并誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而清除損傷及增殖異常的細(xì)胞組織是治療性疫苗的主要研究方向。尋找有效的抗原呈遞載體是治療性疫苗治療效果的關(guān)鍵。

2.3.1 以核酸為載體的治療性疫苗 DNA載體疫苗是將攜帶抗原相關(guān)DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至宿主組織細(xì)胞中，使其表達(dá)抗原相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而起到治療疾病的目的。DNA作為載體的優(yōu)勢(shì)在于構(gòu)造簡(jiǎn)單、成本低，熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，因缺乏抗載體免疫反應(yīng)，故其可重復(fù)給藥，同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫及細(xì)胞免疫，具有良好的安全性及耐受性[18]。目前包含HPV16、18的E6、E7基因片段的DNA載體疫苗VGX-3100，已于2015年進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，聯(lián)合化療應(yīng)用于167位宮頸癌患者，顯示出較好的治療效果，Ⅲ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中[19]。

2.3.2 以病毒為載體的治療性疫苗 由于病毒具有將自己遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)至宿主細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制的能力，故將病毒非重要基因轉(zhuǎn)換成目標(biāo)抗原基因，可將抗原基因轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄并翻譯成免疫原性蛋白，從而誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的發(fā)生，起到治療目的。目前研究較為廣泛的是腺病毒、腺相關(guān)病毒及痘病毒。痘病毒相比于腺病毒，其遺傳物質(zhì)更多、更穩(wěn)定，故可攜帶、支持并表達(dá)更多的轉(zhuǎn)入基因[20]。36例CIN1-CIN3患者進(jìn)行包含HPV E2基因的痘病毒疫苗Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)后，34例痊愈，2例CIN3轉(zhuǎn)歸至CIN1[21]。進(jìn)一步對(duì)1 176例女性患者及180例男性患者進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)，89.3%的女性患者及55.5%的男性患者痊愈[22]。

2.3.3 以細(xì)菌為載體的治療性疫苗 減毒活菌載體疫苗可有效誘導(dǎo)黏膜、體液、細(xì)胞免疫反應(yīng)，疫苗注射后，即被APCs吞噬并有效誘導(dǎo)體液及細(xì)胞免疫[23]。最常用減毒活菌為單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm），Lm被吞噬細(xì)胞吞噬后，分泌膜活性毒力因子LLO和磷脂酶C，降解囊泡，進(jìn)入吞噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中并轉(zhuǎn)錄、翻譯目標(biāo)蛋白，并通過(guò)內(nèi)源性抗原處理途徑激活CD4+及CD8+T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)[24]。酵母菌相關(guān)疫苗同樣為研究熱點(diǎn)，重組HPV-16 L1酵母株可產(chǎn)生食用型HPV疫苗，在小鼠身上已得到較好應(yīng)用效果。將編碼優(yōu)化的HPV-16 L1基因克隆至酵母細(xì)胞中，采用層析法純化酵母提取物中的L1蛋白，免疫電子顯微鏡顯示，合成的蛋白含有天然構(gòu)象表位，具有巨大潛力[25]。以細(xì)菌及真菌為載體的治療性疫苗的優(yōu)勢(shì)在于制備成本低，安全性較高，應(yīng)用后一旦出現(xiàn)不良反應(yīng)，可立即通過(guò)使用抗生素等藥物對(duì)其進(jìn)行清除。

2.3.4 以多肽為載體的治療性疫苗 哺乳動(dòng)物針對(duì)HPV的細(xì)胞免疫是由攜帶E6或E7起始表位的肽段誘導(dǎo)產(chǎn)生[26]，以多肽為載體的治療性疫苗的優(yōu)勢(shì)在于安全、穩(wěn)定、可大批量生產(chǎn)[27]。合成長(zhǎng)肽（＞20個(gè)氨基酸）被用于載體，其經(jīng)過(guò)APCs加工及呈遞后，可誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。多肽疫苗免疫原性較低，聯(lián)合應(yīng)用PepCan等免疫佐劑可有效提高其免疫原性。多肽疫苗ISA101的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，47%患者病變部位組織學(xué)恢復(fù)正常，Ⅱ期臨床試驗(yàn)中30%患者痊愈，且2年內(nèi)無(wú)復(fù)發(fā)[28]。

2.4 治療性疫苗研發(fā)中存在的問(wèn)題 治療性疫苗雖然具有較好的應(yīng)用前景，但目前大多仍處于臨床前及臨床研究階段。幾種取得進(jìn)展的疫苗也存在較明顯的缺陷。比如DNA載體疫苗注射后，體細(xì)胞對(duì)DNA的攝取率較低，導(dǎo)致大部分DNA滯留在細(xì)胞外[29]。以及疫苗肌肉注射后，質(zhì)粒進(jìn)入并轉(zhuǎn)染肌細(xì)胞，然而肌細(xì)胞不屬于APCs，無(wú)法形成較強(qiáng)的特異性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致效果不佳。病毒載體疫苗的主要問(wèn)題在于所應(yīng)用的病毒多為常見(jiàn)病毒，如60%的成年人體內(nèi)含有高滴度腺病毒抗體[30]，導(dǎo)致腺病毒載體無(wú)法進(jìn)入靶細(xì)胞，從而無(wú)法達(dá)到預(yù)期的治療效果。

3 展望

目前應(yīng)用于臨床的預(yù)防性HPV疫苗已取得較好應(yīng)用效果，9價(jià)HPV疫苗對(duì)宮頸癌的預(yù)防達(dá)到90%，各個(gè)國(guó)家也在努力提高疫苗接種率。相比較而言，治療性疫苗目前還處于研究階段，存在疫苗中抗原攝取率低、誘導(dǎo)細(xì)胞免疫原性低等問(wèn)題。研究人員正在嘗試通過(guò)改變局部免疫調(diào)節(jié)、改變載體密碼子、檢查點(diǎn)阻斷、局部組織細(xì)胞膜電穿孔以及聯(lián)合應(yīng)用化療藥物等方法改善缺陷。我們相信治療性疫苗將會(huì)更廣泛應(yīng)用于臨床，預(yù)防性疫苗聯(lián)合治療性疫苗，可更加全面保護(hù)患者免受HPV誘導(dǎo)的宮頸癌等疾病的困擾。