第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)孕晚期陰道菌群研究的應(yīng)用前景

郭珊珊綜述 劉繼紅，鄭倩文 審校

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科，云南 昆明 650101

在正常情況下，陰道微生態(tài)中的主要優(yōu)勢(shì)菌是乳桿菌，其占陰道菌群總量的95%[1-2]，乳桿菌與其他微生物共同維持陰道微環(huán)境的平衡，正常情況下不會(huì)致病[3]。然而孕晚期孕婦由于雌激素增多、免疫降低等原因?qū)е玛幍谰何蓙y，從而引發(fā)生殖道炎癥感染，甚至引起一系列早產(chǎn)、胎膜早破、新生兒感染等不良妊娠結(jié)局[4]，嚴(yán)重影響母嬰的存活質(zhì)量。因此，研究孕期陰道微生態(tài)對(duì)母嬰的影響是目前臨床關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。研究陰道微生態(tài)關(guān)鍵在于對(duì)陰道菌群進(jìn)行分析，但現(xiàn)階段臨床對(duì)陰道菌群的認(rèn)識(shí)大多基于傳統(tǒng)的白帶涂片、培養(yǎng)、生化鑒定等方法[5]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，人體內(nèi)的細(xì)菌僅有約10%能在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)，且大多數(shù)細(xì)菌是厭氧菌，其培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件也十分苛刻[6-7]。近幾年來(lái)，婦產(chǎn)科學(xué)者已通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法證實(shí)妊娠晚期陰道菌群變化與母嬰感染具有相關(guān)性，但對(duì)于妊娠晚期陰道感染所致不良妊娠結(jié)局的菌群結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)尚存在局限性和不完整性[8-9]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，非培養(yǎng)方法在陰道微生態(tài)的研究中取得顯著效果，第二代高通量測(cè)序技術(shù)越來(lái)越多在臨床得以應(yīng)用，該技術(shù)的應(yīng)用將對(duì)了解妊娠晚期陰道菌群結(jié)構(gòu)及其變化對(duì)母嬰的影響提供新的方向[10]。

1 研究陰道微生態(tài)的非培養(yǎng)方法

近年來(lái)隨著微生物技術(shù)的不斷發(fā)展，各種非培養(yǎng)方法越來(lái)越多的運(yùn)用于檢測(cè)陰道微環(huán)境，且各有優(yōu)缺點(diǎn)。PCR 與變性梯度凝膠電泳分析相結(jié)合的技術(shù)(polymerase chain reaction--denaturing gradient gel electrophores，PCR-DGGE)[11]是比較微生物菌群多樣性以及微生態(tài)環(huán)境變化的一種高效可靠的方法。該方法最大的優(yōu)點(diǎn)是可以檢測(cè)出不能培養(yǎng)的微生物，且檢出率高，不需要培養(yǎng)微生物，可通過(guò)特殊的超聲波及不斷研磨的方法直接提取DNA，然后對(duì)16S rDNA基因的可變區(qū)序列利用PCR擴(kuò)增、梯度凝膠電泳的方法，最后檢測(cè)出難以培養(yǎng)或者不能被培養(yǎng)的微生物，進(jìn)而反映出陰道微生態(tài)的多樣性。但是它需借助相關(guān)儀器進(jìn)行操作，受影響的因素較多，重復(fù)性差，勞動(dòng)強(qiáng)度和技術(shù)要求相對(duì)較高。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)(real-time quantitative PCR，qPCR)[12]是在PCR 整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中加入熒光信號(hào)，再探測(cè)PCR 全過(guò)程，之后再用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣本模板分析，再通過(guò)檢測(cè)該未知模板的熒光量，進(jìn)而確定樣本的核酸量，這樣說(shuō)來(lái)它也算是一種核酸定量技術(shù)。它的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速、高效，而且特異性與靈敏性特別高，但是該技術(shù)也有一定缺點(diǎn)，如不能檢測(cè)未知菌屬，也不能分析未知菌屬的動(dòng)態(tài)變化。

基因芯片技術(shù)(gene-chip)基因芯片又稱DNA 芯片，它是根據(jù)細(xì)菌共有的16S rRNA 基因的高度保守性來(lái)檢測(cè)病原菌的?；蛐酒夹g(shù)具有高效、高速，且能定量，重復(fù)測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)。但同樣該技術(shù)不能測(cè)定未知物種，而且在定量方面較局限，成本也相對(duì)較高，限制了臨床應(yīng)用[13]。

Sanger 法測(cè)序在過(guò)去幾十年一直占主導(dǎo)地位，該技術(shù)與后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的其他DNA 測(cè)序統(tǒng)為一代DNA 測(cè)序[14]。該方法測(cè)序長(zhǎng)，結(jié)果準(zhǔn)確，但成本高昂，操作過(guò)程繁瑣，重復(fù)性差，不能自動(dòng)化，更主要的是不能進(jìn)行大規(guī)模的測(cè)序。

高通量測(cè)序技術(shù)又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)，顧名思義，它是在傳統(tǒng)Sange 測(cè)序的基礎(chǔ)上變革而來(lái)。它能一次對(duì)數(shù)百萬(wàn)條核酸分子進(jìn)行序列測(cè)定，也可以對(duì)某一微生物的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全面徹底的分析。最近幾年涌現(xiàn)的研究人體微生態(tài)的高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)主要是Roche 454 焦磷酸測(cè)序、Illumina Solexa 測(cè)序平臺(tái)等。要想全面分析微生物群的多樣性，首先在于獲取16S rRNA基因序列[15]。16S rRNA是現(xiàn)在用作細(xì)菌分類和鑒定的最常用的基因。學(xué)者張瑞芬等[16]指出，16S rRNA 基因是各細(xì)菌所共有的，其基因序列有保守區(qū)和可變區(qū)兩種類型，幾乎所有細(xì)菌保守區(qū)序列都是恒定的，而可變區(qū)在不同菌種、屬間存在一定程度的差異。由于可變區(qū)具的差異性，從而可對(duì)各菌種、屬的細(xì)菌進(jìn)行分類和鑒定。傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)獲取16S rRNA基因序列有限，而第二代高通量測(cè)序技術(shù)能快速大量獲取該基因，且測(cè)序更長(zhǎng)。XU等[17]提出對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行高通量測(cè)序可以獲得更準(zhǔn)確的微生物組定性和定量信息，而且讀起來(lái)很短，性價(jià)比高。高通量測(cè)序技術(shù)可全面深入了解陰道菌群環(huán)境，而且還可以發(fā)現(xiàn)未知的細(xì)菌，據(jù)此可進(jìn)一步探討孕晚期陰道菌群結(jié)構(gòu)及其與不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性。

2 第二代高通量測(cè)序技術(shù)在陰道微生態(tài)方面的研究進(jìn)展

當(dāng)人體處于健康狀態(tài)時(shí)，陰道內(nèi)的微生物主要是厭氧菌與需氧菌，其中厭氧菌數(shù)量是需氧菌的5倍，這些正常陰道微生物與宿主、環(huán)境之間處于相互制約的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)女性處于妊娠期時(shí)，由于菌群紊亂，易引起生殖道感染。鄧玉娟等[18]指出，懷孕期間陰道菌群紊亂的發(fā)生率遠(yuǎn)比非孕期高，而且通過(guò)對(duì)比在孕早期、中期和晚期菌群失調(diào)情況，未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。張仕茜等[19]提出，女性孕期由于微生態(tài)失衡，易引起生殖道炎癥感染,且最常見(jiàn)的陰道炎有陰道假絲酵母菌病(ulvovaginal candidias，VVC)、細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis，BV)、滴蟲(chóng)性陰道炎(trichomonal vaginitis，TV)等。學(xué)者黃璐[20]，馬菁雯等[21]基于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法提出在妊娠晚期菌群失調(diào)中所占比例最多的是假絲酵母菌，這導(dǎo)致產(chǎn)褥感染、新生兒感染、胎膜早破的發(fā)生率增加，但對(duì)于VVC、BV、TV等陰道菌群變化的多樣性及結(jié)構(gòu)并未進(jìn)一步說(shuō)明。這些學(xué)者利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究妊娠期晚期陰道微生態(tài)的變化始終存在局限性，因此，利用當(dāng)前更為高效、高速的第二代高通量測(cè)序技術(shù)研究孕晚期陰道菌群結(jié)構(gòu)顯得尤為必要。

歐陽(yáng)才顏[22]通過(guò)利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)研究陰道菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果提出正常育齡期婦女陰道菌群結(jié)構(gòu)以卷曲乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌，而惰性乳桿菌比例極低。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為VVC陰道內(nèi)大部分為乳桿菌，其結(jié)構(gòu)類似于健康育齡婦女，但他通過(guò)Illumina 測(cè)序發(fā)現(xiàn)有別于傳統(tǒng)的新觀點(diǎn)，VVC患者的陰道菌群結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，且個(gè)體差異較大，其陰道內(nèi)乳桿菌下降，加德納菌、普氏菌屬、雙歧桿菌等厭氧菌大量增加，抑制了乳酸桿菌的增長(zhǎng)，從而降低了乳酸含量，引起陰道內(nèi)PH增加，陰道自凈作用減弱，使得假絲酵母菌得以大量繁殖，從而加劇陰道菌群失調(diào)。此外，他也指出經(jīng)過(guò)治療后，VVC 患者臨床癥狀雖消失，但大部分陰道菌群沒(méi)有恢復(fù)到以乳酸桿菌為主導(dǎo)的正常狀態(tài)；除此，他也提出惰性乳桿菌易增加女性患BV 的風(fēng)險(xiǎn)，并且惰性乳桿菌在BV患者中處于優(yōu)勢(shì)地位。

郭雙雙[23]利用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在TV女性陰道內(nèi)乳酸菌屬較正常對(duì)照組的減少，而纖毛菌屬、普雷沃菌屬等厭氧菌比正常對(duì)照組的增多。此外，她提出較之傳統(tǒng)方法，高通量測(cè)序技術(shù)能更全面、準(zhǔn)確地反應(yīng)陰道微生態(tài)結(jié)構(gòu)及變化。VIRTANEN 等[24]調(diào)查了50 例無(wú)癥狀女性中巴氏涂片的顯微鏡檢查結(jié)果與通過(guò)下一代測(cè)序確定的陰道微生物群組成之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，結(jié)果顯示巴氏涂片鏡檢對(duì)細(xì)菌性陰道病的診斷靈敏度為43.1～59.4%，特異性為83.3～93.6%，但是無(wú)法區(qū)分乳桿菌種或鑒定混合菌中的細(xì)菌，利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)分析的細(xì)菌群落更能確定陰道菌群的多樣化，能達(dá)到99%的覆蓋率，幾乎能檢測(cè)到陰道內(nèi)的所有細(xì)菌種類。

PETROVA 等[25]通過(guò)Illumina 測(cè)序發(fā)現(xiàn)，惰性乳桿菌經(jīng)常出現(xiàn)在陰道生物群，該物種在陰道健康中的作用尚不清楚，因?yàn)樵谡Ｇ闆r下以及在陰道功能異常都能發(fā)現(xiàn)，他提出惰性乳桿菌的存在可能與維持陰道內(nèi)正常的pH值環(huán)境有關(guān)。這一觀點(diǎn)與歐陽(yáng)才顏的觀點(diǎn)不同，歐陽(yáng)認(rèn)為正常陰道菌群結(jié)構(gòu)確實(shí)以卷曲乳酸桿菌為主，但惰性乳桿菌的含量極低，且惰性乳桿菌與陰道菌群異常相關(guān)，到底結(jié)論如何，這有待進(jìn)一步研究證實(shí)。除此，SOUZA等[26]也發(fā)現(xiàn)陰道炎癥感染者用甲硝唑治療后，陰道菌群的多樣性顯著下降，但是很少能恢復(fù)到以乳桿菌為主導(dǎo)的平衡狀態(tài)。

通過(guò)以上論述可知，由于陰道內(nèi)大多數(shù)為厭氧菌，通過(guò)傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和普通的非培養(yǎng)方法很難明確陰道微生態(tài)結(jié)構(gòu)，更難以個(gè)體化的分析在妊娠不同時(shí)期陰道菌群的差異性[27]。第二代高通量測(cè)序技術(shù)可深入了解到正常陰道菌群結(jié)構(gòu)及VVC、BV、TV 患者等的菌群變化，發(fā)現(xiàn)新觀點(diǎn)、新認(rèn)識(shí)，因此，利用該技術(shù)也可深入了解孕期陰道菌群結(jié)構(gòu)。

3 第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)妊娠晚期菌群變化研究的前景

基于第二代高通量測(cè)序技術(shù)具備的優(yōu)良條件及上述各學(xué)者利用該技術(shù)對(duì)非孕期VVC、BV、TV 等患者的菌群結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展，目前同樣可對(duì)妊娠晚期陰道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行高通量測(cè)序分析。在妊娠晚期因各種因素影響下，是否會(huì)導(dǎo)致陰道內(nèi)正常存在的卷曲乳桿菌降低及陰道內(nèi)其他的加氏乳桿菌、加德納菌、普氏菌屬等厭氧菌的增加，從而導(dǎo)致陰道菌群多樣性增加及菌群結(jié)構(gòu)改變，這些目前尚沒(méi)明確的報(bào)道。就如YERUVA等[28]學(xué)者提出，不同的乳桿菌與正常的陰道微菌群的存在是決定陰道微生物菌群穩(wěn)定性的主要因素，其中卷曲乳桿菌促進(jìn)了正常陰道菌群的穩(wěn)定性，而加氏乳桿菌或惰性乳桿菌則在一定程度上導(dǎo)致了異常的陰道微生物群落的出現(xiàn)，在孕期這些菌群如何變化有待于進(jìn)一步研究。另外，在通過(guò)使用抗生素治療后患者雖癥狀消失，但陰道菌群一定時(shí)間內(nèi)并未恢復(fù)到正常狀態(tài),所以無(wú)癥狀感染組與不良妊娠結(jié)局可能存在相關(guān)性，這也有待于證實(shí)。

于慧君等[29]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在妊娠晚期孕婦由于陰道菌群紊亂引發(fā)的陰道感染中，有炎癥感染癥狀組發(fā)生胎膜早破、早產(chǎn)、新生兒感染等方面的疾病顯著高于無(wú)癥狀組,而無(wú)癥狀組與正常對(duì)照組的妊娠結(jié)局無(wú)明顯差別。國(guó)外的SUBTIL等[30]學(xué)者指出在孕期患有陰道炎的孕婦，其有臨床感染癥狀者比起正常對(duì)照組更容易發(fā)生不良妊娠結(jié)局，其對(duì)84 530名孕婦進(jìn)行了篩查，其中5 630例患有細(xì)菌性陰道病，發(fā)現(xiàn)感染者更易出現(xiàn)流產(chǎn)或自然早產(chǎn)。黃鎮(zhèn)華等[31]也提出與上述作者相同的觀點(diǎn)，除此，他還指出無(wú)癥狀感染組較之正常對(duì)照組易發(fā)生產(chǎn)褥感染，這也有待進(jìn)一步研究。

由于目前尚未明確證實(shí)無(wú)癥狀感染組與母嬰不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性，因此，可利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)有癥狀感染者和無(wú)癥狀感染者的陰道菌群結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)無(wú)癥狀組與妊娠晚期母嬰不良妊娠結(jié)局的關(guān)系也可能得以證實(shí)。

4 結(jié)語(yǔ)

第二代高通量測(cè)序技術(shù)因?yàn)槌杀据^高，現(xiàn)在還僅僅局限在科學(xué)研究，尚不能廣泛運(yùn)用于臨床研究,而且現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外在妊娠晚期利用該技術(shù)研究陰道微生態(tài)的相關(guān)文獻(xiàn)也相對(duì)較少。隨著第二代高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，相信未來(lái)能更廣泛的應(yīng)用于臨床研究，為妊娠晚期陰道微生態(tài)的研究提供新的方法和依據(jù)，進(jìn)而評(píng)估孕晚期母嬰感染的風(fēng)險(xiǎn)、評(píng)價(jià)療效、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)等，以此減少母嬰感染發(fā)生率，提高母嬰生命質(zhì)量。