電針深刺對三叉神經(jīng)痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中P2Y2受體及Kv3.4表達(dá)的影響

李崖雪，高瑞雪，劉 瀟*，王 豐，李曉陵，閆禹竹，王欣波，孫士紅，任佰亮

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

原發(fā)性三叉神經(jīng)痛(TN)是最痛苦、難治疾病之一，發(fā)病率接近 4.5/100 000，老年女性多發(fā)[1-2]。目前，中樞病因?qū)W說認(rèn)為TN的發(fā)病為癲癇樣改變，周圍學(xué)說認(rèn)為是該神經(jīng)脫髓鞘改變[3]。在三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中存在P2Y2 受體，激活P2Y2受體通過抑制Kv通道亞型表達(dá)增強TG神經(jīng)元興奮性，引起大鼠顏面病理性疼痛[4]，本研究通過運用電針配合深刺下關(guān)穴方法降低大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中P2Y2受體表達(dá)情況并增加Kv3.4 mRNA表達(dá)而達(dá)到止痛目的。

1 材料與方法

1.1 動物 SD成年雄性大鼠，體質(zhì)量（250±50）g由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 主要儀器與試劑 5-0可吸收鉻腸線（上海醫(yī)療器械有限公司），小鼠來源的大鼠β-actin單克隆抗體（Cell signal technique公司），多克隆兔抗大鼠P2Y2（Santa Cruz 公司）；E831型電泳儀（Consort公司比利時），Western Blot轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)及垂直電泳(Bio-Rad公司美國），羊抗大鼠Kv3.4（Santa Cruz公司），PTPCR儀（CORBETTRESEARCH澳大利亞公司)。

1.3 模型制備 對SD大鼠進(jìn)行腹腔麻醉后俯臥位固定，局部消毒，鏡下做右眉弓上弧形切口，暴露出眼眶，撥開內(nèi)容物，暴露出眶下神經(jīng)，從近向遠(yuǎn)分離眶下神經(jīng)。用2根鉻線結(jié)扎神經(jīng)，間距2 mm。壓迫力度：纖維鏡下可見神經(jīng)略微變細(xì)，不全阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)，保持神經(jīng)外膜血液通暢。待動物醒后進(jìn)行觀察（通常于術(shù)后14 d成模），模型成功率70%。

1.4 模型成立標(biāo)準(zhǔn) 14 d后操作員持刺激棒對大鼠患側(cè)面部進(jìn)行刺激，如出現(xiàn)：大鼠患側(cè)面部避免被接觸，快速后退，或表現(xiàn)將頭面藏于身下，躲避刺激或團(tuán)起身子向籠壁靠攏，大鼠快速抓咬刺激物的攻擊行為，非對稱性面部搔抓至少連續(xù)3次中的任意1項或l項以上即模型成立。

1.5 分組及治療方法 選用成年雄性SD大鼠30只，隨機分為3組，各10只。電針組（電針配合深刺下關(guān)穴治療組）：14 d后（模型成立）即開始對大鼠治療，采用不銹鋼毫針，規(guī)格：0.18 mm×13 mm（上海真康醫(yī)療公司）；右側(cè)下關(guān)穴進(jìn)行直刺，深度約5 mm（盡量接近三叉神經(jīng)半月節(jié)處），向后平刺百會穴，深度約3 mm；連接電針治療儀，正極連接百會穴，負(fù)極連接下關(guān)穴，選擇波形：輸出頻率80 Hz/s連續(xù)波，電針20 min，再留針10 min后拔針，2次/d，14 d為1療程。假手術(shù)組：切開皮膚暴露神經(jīng)，不結(jié)扎神經(jīng)，縫合右側(cè)眶部皮膚后觀察。模型組：切開皮膚暴露神經(jīng)，結(jié)扎神經(jīng)，制備大鼠TN模型。

1.6 痛閾測定 用BME-403型細(xì)絲法檢測儀從小到大逐漸增加折力，對大鼠觸須及周圍皮膚進(jìn)行刺激，各強度需要刺激6次，取平均值確定大鼠痛閾。當(dāng)強度大于20.1g時，大鼠未出現(xiàn)疼痛反應(yīng)，痛閾即可以定為20.1g。對各組大鼠痛閾進(jìn)行統(tǒng)計比較。

1.7 Western Blot方法檢測P2Y2受體 用PBS洗滌培養(yǎng)后的三叉神經(jīng)半月節(jié),加入細(xì)胞裂解液，進(jìn)行裂解細(xì)胞，刮下細(xì)胞后，收集于微量離心管中，5～10 min沸水浴， 12 000 r/min離心10 min。取上清，測定蛋白含量（Bradford法）。樣品每種取蛋白50 μg，加入上樣緩沖液后進(jìn)行不連續(xù)SDS-PAGE（濃縮膠60g/L，分離膠100g/L）。泳畢，把蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，滴加BSA（10 g/L）封閉，依次滴加一抗（多克隆兔抗大鼠P2Y2 ，濃度1:1 000）及二抗（標(biāo)記的羊抗兔IgG，1:3 000 HRP），室溫下分別作用1、2 h。然后進(jìn)行洗膜，之后用化學(xué)發(fā)光法ECL進(jìn)行檢測，程序為將X線片先顯影2～20 min，進(jìn)行定影，再通過圖像分析軟件Image tool讀取在X線膠片上測得目的條帶的光密度值，然后檢測β-actin條帶的光密度值，以此做參考標(biāo)化各組P2Y2蛋白表達(dá)量。

1.8 實時定量PCR檢測Kv3.4 mRNA表達(dá)情況 提取三叉神經(jīng)節(jié)RNA，取總RNA 1 μg為模板，以β-actin做為內(nèi)參，進(jìn)行檢測。擴增條件：先95 ℃預(yù)變性，然后持續(xù)5 min進(jìn)入30個循環(huán)，72 ℃7 min延伸；β-actin擴增條件：先95 ℃預(yù)變性，在4 min后進(jìn)行32個循環(huán)，10 min 72 ℃延伸。擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。采用凝膠成像系統(tǒng)對目的電泳條帶進(jìn)行讀取，將3組Kv3.4的灰度值標(biāo)化，進(jìn)行比較。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 17. 0統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P＜0.05為有差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組痛閾比較 見表1。

表 1 3組痛閾比較（，n = 10）

表 1 3組痛閾比較（，n = 10）

注：與模型組比較，# P＜0.05

組 別 術(shù)后14 d 術(shù)后28 d假手術(shù)組 10.22±3.46 # 11.56±2.36#針刺組 1.46±0.25 10.36±2.88#模型組 1.02±0.04 3.44 ±1.65

2.2 3組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P2Y2受體蛋白表達(dá)情況 模型成立后（術(shù)后14 d），假手術(shù)后14 d及電針深刺治療14 d（術(shù)后28 d）后，Western blot方法測定大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中 P2Y2受體的表達(dá)。經(jīng)電針深刺法治療后三叉神經(jīng)痛大鼠TG中P2Y2受體的表達(dá)顯著下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 3組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中 Kv3.4 mRNA的表達(dá)情況 模型成立后（術(shù)后14 d），假手術(shù)后14 d及電針深刺治療14 d（術(shù)后28 d）后，采用實時定量PCR測定大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中 Kv3.4 mRNA的表達(dá)。經(jīng)電針深刺法治療后三叉神經(jīng)痛大鼠TG中Kv3.4 mRNA表達(dá)顯著增加，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

三叉神經(jīng)痛，針灸選穴上常以局部選穴為主或按分支選穴[5]，存在誘發(fā)三叉神經(jīng)痛發(fā)作的弊端[6]，本研究顏面只取一個遠(yuǎn)離疼痛部位的下關(guān)穴[7]，與總督一身陽氣的百會穴[8]相配，既不會誘發(fā)疼痛又起到疏調(diào)顏面陽經(jīng)經(jīng)氣作用，達(dá)到經(jīng)脈通則不痛的目的。配合電針波形中密波以充分達(dá)到鎮(zhèn)痛作用[9-10]。

同時下關(guān)穴深刺盡量接近三叉神經(jīng)半月節(jié)，在三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中存在P2Y2受體。 P2Y2受體在體內(nèi)廣泛分布，激活后具有顯著病理生理效應(yīng)[11]。P2Y2受體下調(diào)（可以通過該受體抑制劑）對傳遞疼痛信號起到抑制作用，從而終止疼痛[12]。而三叉神經(jīng)痛發(fā)病機制正是由于某種損傷激活TG上P2Y2受體，進(jìn)而抑制Kv通道亞型表達(dá)增強TG神經(jīng)元興奮性，引起大鼠顏面病理性疼痛[4]。本研究通過運用電針配合深刺[13]下關(guān)穴方法盡量接近并刺激大鼠三叉神經(jīng)節(jié)，降低大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中P2Y2受體表達(dá)情況。同時電壓門控性鉀通道亦受到TG上P2Y2受體的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步促使神經(jīng)末梢中神經(jīng)遞質(zhì)釋放[14]。通過研究，在TN發(fā)作時IA起作用最明，IA的Kv通道亞型主要是Kv3.4等。本實驗結(jié)果顯示，電針深刺法治療后三叉神經(jīng)痛大鼠疼痛程度明顯減輕，TG中P2Y2受體的表達(dá)顯著下降、Kv3.4 mRNA表達(dá)顯著增加，與模型組比較，P＜0.05，與假手術(shù)組比較，P＞0.05。結(jié)論：此法可以通過降低P2Y2受體表達(dá)同時增加Kv3.4 mRNA表達(dá)，抑制神經(jīng)元興奮性而起到鎮(zhèn)痛作用。

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