視網(wǎng)膜α-crystallins在增生性視網(wǎng)膜疾病中的研究進展

徐雅慧， 袁源智

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院眼科，上海 200032

在哺乳動物眼球中，晶體蛋白是組成其晶狀體的重要結(jié)構(gòu)并維持其透明度。晶體蛋白可劃分為3個主要的家族：α- crystallins、β- crystallins、γ-crystallins。α-crystallins由αA-crystallin和αB-crystallin構(gòu)成，是晶體蛋白主要類型。研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，晶狀體以外的組織細胞中也存在α-crystallins。αA-crystallin可表達于視網(wǎng)膜、胸腺、脾臟等部位；αB-crystallin可表達于視網(wǎng)膜、角膜、視神經(jīng)、星形膠質(zhì)細胞、Müller細胞，以及大腦、腎臟、肺、肝臟、脾臟、皮膚、心臟和骨骼肌等眼外組織[3-5]。α-crystallins是小分子熱休克蛋白家族(small-molecule heat shock protein, sHSP)的重要組成部分，具有熱休克蛋白的特性。

由于缺氧、炎癥、外傷、血管病變等各種致病因素刺激，視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞缺血、缺氧，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth,VEGF)上調(diào)，促進病理性血管增生，同時視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)細胞和Müller細胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、αB-crystallin等可誘導(dǎo)細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致纖維瘢痕增生，形成一系列增生性視網(wǎng)膜疾病。增生性視網(wǎng)膜疾病主要包括增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy, PVR)[6]、新生血管性年齡相關(guān)性黃斑病變(neovascular age-related macular degeneration, nAMD)[7]和增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR)[8]。PDR中異常新生血管易滲漏，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫、出血，并在慢性刺激下形成纖維瘢痕，繼發(fā)視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜無灌注，是視力下降甚至致盲的主要原因。視網(wǎng)膜組織受到損傷引發(fā)增殖性改變的具體機制尚未完全清晰，已有眾多文獻[9-11]指出，α-crystallins可推進此過程且發(fā)揮不容忽視的作用。本文主要對α-crystallins促進視網(wǎng)膜血管和纖維增生的主要分子機制進行綜述。

1 α-crystallins的主要功能

α-crystallins的功能大致如下。(1)維持細胞骨架完整性：細胞骨架是一種復(fù)雜的動態(tài)結(jié)構(gòu)，由相互連接的細絲網(wǎng)絡(luò)組成，由微管(microtubules, MTs)、微絲(microfilaments, MFs)和中間絲(intermediate filaments, IFs)構(gòu)成，有利于維持細胞形狀，為細胞運動和分裂提供框架。例如，αB-crystallin作為微管蛋白/微管的分子伴侶，可在應(yīng)激狀態(tài)下調(diào)節(jié)微管動力學(xué)，維持細胞形態(tài)和細胞間黏附[12]。αA-crystallin與phakinin和filensin(2種晶體特異性IF蛋白)形成絡(luò)合物，也可能發(fā)揮相似作用。大鼠晶狀體纖維細胞研究[13-14]表明，αA-crystallin均勻分布于細胞骨架細肌絲，可保持晶狀體透明度。(2)抗凋亡和細胞保護：αB-crystallin參與多種細胞凋亡通路，可直接或間接阻止應(yīng)激誘導(dǎo)物和促凋亡因子發(fā)揮作用，例如作用于促凋亡因子Bax和Bcl-X(S)，從而抑制其向線粒體遷移[15]；抑制caspase-3和PARP(poly ADP-ribose polymerase)的激活[16]；抑制細胞色素C和caspase-8依賴的caspase-3活化[17]；與p53相互作用，防止其從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體[18]；抑制RAS活化，抑制RAF/MEK/ERK通路[19]等。此外，αB-crystallin可在S59和S45而非S19(S19廣泛非磷酸化)位點磷酸化活化后對抗大鼠腦星形膠質(zhì)細胞凋亡減少。也有研究[20]提示，在人類晶狀體中，αB-crystallin可在K92位點乙?；鰪娂毎Ｗo和抗凋亡的功能，由此說明αB-crystallin蛋白修飾后可更好地發(fā)揮生物學(xué)功能，其具體機制還需進一步研究。αA-crystallin也具有類似的細胞保護作用，如激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)[21]。(3)作為分子伴侶，促進細胞內(nèi)外分子正確折疊，增強其作用，與細胞色素c、caspase-6相互作用[22]，與Bax和Bcl-X(S)高度親和[23]，抑制促凋亡因子從細胞質(zhì)向線粒體遷移從而保護線粒體完整性。αB-crystallin還與內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)共同定位在RPE內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，從而調(diào)控VEGF介導(dǎo)的脈絡(luò)膜血管新生[24]。(4)作為外泌體蛋白發(fā)揮胞外作用：如星形膠質(zhì)細胞將αB-crystallin以外泌體形式分泌出胞，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[25]。此外，盡管αB-crystallin在S59位點被廣泛磷酸化，但在膠質(zhì)瘤細胞中，模擬磷酸化可顯著減少通過外泌體分泌的αB-crystallin，由此推測αB-crystallin以非磷酸化形式在胞外分泌[26]，其胞外作用有待研究。

2 α-crystallins與增生性視網(wǎng)膜疾病

2.1 α-crystallins與糖尿病視網(wǎng)膜病變 糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病重要的微血管病變之一，也是糖尿病患者視力喪失的主要原因。糖尿病引起視網(wǎng)膜缺血缺氧，導(dǎo)致新生血管在視網(wǎng)膜表面增生，不成熟的新生血管出血滲出加重病變。αB-crystallin領(lǐng)域一個重要的研究方向是其與多種蛋白包括凋亡、細胞骨架、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)蛋白的相互作用?；诎閭H蛋白的特性，αB-crystallin與這些蛋白之間可能存在天然聯(lián)系，尤其在某些疾病中，αB-crystallin可能間接參與其病理過程。以下主要闡述α-crystallins促進視網(wǎng)膜新生血管的過程。

在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy, OIR)和脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)大鼠模型中敲減αB-crystallin能使視網(wǎng)膜新生血管病理過程中表達增高的VEGF和缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)的表達情況維持在低水平。研究[24]利用免疫沉淀證實了αB-crystallin與VEGF共同定位在RPE內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并發(fā)現(xiàn)αB-crystallin在低氧下保護VEGF而間接促進血管新生。另一方面， Dong等[27]發(fā)現(xiàn)，在人眼視網(wǎng)膜組織上，磷酸化αB-crystallin(αB-crystallin活化形式)在CD31+視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞內(nèi)顯著表達，并與VEGF、p38-絲裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)共同定位在PDR黃斑前膜。磷酸化αB-crystallin(尤其是S59位點磷酸化)可作為VEGF、p-p38 MAPK的伴侶蛋白，使其正確折疊而減少降解，參與形成PDR視網(wǎng)膜的新生血管[27]。此外，PDR患者玻璃體內(nèi)αB-crystallin、VEGF表達量較正常人顯著增加，其中，全視網(wǎng)膜光凝(pan-retinal photocoagulation, PRP)術(shù)后患者玻璃體內(nèi)這2種蛋白表達有所下降[28]。因此，體內(nèi)和體外實驗均證明，αB-crystallin直接或者間接地促進視網(wǎng)膜血管新生。αA-crystallin似乎也有類似作用。有研究[29]顯示，體外內(nèi)皮細胞培養(yǎng)聯(lián)合OIR、CNV模型，敲減αA-crystallin同樣可通過VEGF和VEGFR2通路抑制眼部血管新生。

α-crystallins通過促進VEGF表達和正確折疊而增加視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生。另外，αB-crystallin也能上調(diào)表達一些內(nèi)皮細胞黏附蛋白而增強白細胞募集，影響內(nèi)皮細胞炎癥激活過程[30]。是否存在其他影響因素及如何將該特性應(yīng)用到治療上尚需進一步研究。

2.2 α-Crystallins與年齡相關(guān)性黃斑變性 年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)是導(dǎo)致老年人發(fā)生不可逆視力喪失的主要疾病之一，臨床上主要分為萎縮性(干性)AMD和滲出性(濕性)AMD。早期萎縮性AMD的特征是黃斑內(nèi)的色素變化和玻璃膜疣的形成。隨著疾病進展，感光細胞、RPE細胞和脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞進行性變性，最終可發(fā)展為地圖狀萎縮(geographic atrophy, GA)；滲出性AMD眼底特征為脈絡(luò)膜新生血管膜(choroidal neovascularmembrane, CNVM)生成，常伴有出血和滲出。

晚期濕性AMD黃斑區(qū)視網(wǎng)膜下纖維化涉及一個重要的過程：上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。肌成纖維細胞是CNVM的主要細胞構(gòu)成，表現(xiàn)為α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫反應(yīng)陽性。組織學(xué)研究[31-32]表明，肌成纖維細胞來源于骨髓源性細胞和RPE細胞等。黃斑區(qū)RPE損傷后，RPE細胞失去其頂端-基底極性，向遷移性的肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，伴上皮細胞標(biāo)志物(如CD31、VE-cadherin)表達減少和間質(zhì)標(biāo)志物(α-SMA、細胞外基質(zhì)蛋白)表達增加[33-34]。α-crystallins與此表型轉(zhuǎn)化密不可分。對24例AMD眼和25例正常眼黃斑區(qū)Bruch膜-脈絡(luò)膜復(fù)合物進行定量蛋白質(zhì)組分析，顯示AMD眼中α-crystallins表達明顯增加[35]。近年來，研究[11]發(fā)現(xiàn)αB-crystallin作為SMAD4分子伴侶，可增強其核內(nèi)轉(zhuǎn)移和聚集，激活TGF-β/Smad通路，參與EMT形成，調(diào)控濕性AMD晚期視網(wǎng)膜下纖維化發(fā)展。同時也有不少關(guān)于αB-crystallin在繼發(fā)性白內(nèi)障和肺纖維化等其他內(nèi)臟器官EMT作用的研究[36-37]。

因此，α-crystallins如何作用于AMD尤其是濕性AMD繼發(fā)的視網(wǎng)膜下纖維化，值得進一步研究。另外，除了參與EMT過程，探索α-crystallins是否也參與視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細胞間質(zhì)化轉(zhuǎn)變(endothelial-to-mesenchymal transition, endoMT)，有利于深入了解α-crystallins與AMD的關(guān)系。

2.3 α-crystallins與增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變 PVR是孔源性視網(wǎng)膜脫離(rhegmatogenous retinal detachment, RD)手術(shù)修復(fù)的嚴(yán)重并發(fā)癥，特征是在視網(wǎng)膜前表面形成纖維膜，稱為視網(wǎng)膜前膜(epiretinal membrane, ERM)，其收縮導(dǎo)致視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)扭曲和皺褶，最終發(fā)生牽拉性視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment, RD)[38]。合理的治療手段是通過手術(shù)去除活躍的細胞和細胞膜，必要時切除整個玻璃體。研究[39]證明，ERM成分復(fù)雜，包括RPE細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞、膠質(zhì)細胞和巨噬細胞等，RPE細胞外泌體分泌的αB-crystallin也在ERM表達。

通過對玻璃體液進行蛋白組學(xué)和基因發(fā)現(xiàn)，約60%玻璃體蛋白分子量和蛋白形態(tài)符合細胞外泌體特征[40]。因此外泌體在玻璃體和視網(wǎng)膜之間的運輸作用不容忽視，同時外泌體對于ERMs的作用仍值得思考。一項研究[41]證實，阻礙RPE細胞αB-crystallin表達可改變外泌體標(biāo)志物(LAMP1、LAMP3)分布。因此，αB-crystallin除參與構(gòu)成ERM外，還可促進外泌體合成。結(jié)合臨床32例RD患者玻璃體樣本αB-crystallin表達量顯著增加的結(jié)果[28]，推測αB-crystallin除調(diào)控視網(wǎng)膜下纖維化外也可能促進ERM形成，加重視網(wǎng)膜損害。

3 α-crystallins的應(yīng)用前景

目前增生性視網(wǎng)膜疾病的治療方法比較有限，主要有激光光凝、玻璃體切除額外纖維血管膜、抗血管生成藥物等。為了提高臨床療效，有必要研發(fā)抑制視網(wǎng)膜血管增生和纖維化的新藥。近年基于α-crystallins分子伴侶特性，研發(fā)了mini-αA peptide和mini-αB peptide[42]，將其與α-crystallins重組為蛋白多聚顆粒、重組腺病毒[43-44]。此類多肽伴侶可防止蛋白質(zhì)聚集和纖維形成，保護突變晶體蛋白，同時抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等。近年來發(fā)現(xiàn)一種可以阻斷αB-crystallin與VEGF-16聯(lián)系的小分子抑制劑[45]，或可將其應(yīng)用于新生血管性視網(wǎng)膜疾病[46]。因此，研發(fā)出阻斷α-crystallins與SMAD通路聯(lián)系的抑制劑，或?qū)⑹怪委烠NV和視網(wǎng)膜下纖維化成為可能。