MPO作為奶牛隱性乳房炎診斷指標(biāo)的研究

牛國(guó)慶，武果桃，任杰

（1.太原市小店區(qū)畜禽繁育工作站，太原 030032；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，太原 030032）

目前，乳房炎仍然是影響奶牛生產(chǎn)效益的主要負(fù)面因素之一[1]，不僅降低奶牛生產(chǎn)性能，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致奶牛淘汰。據(jù)報(bào)道，國(guó)內(nèi)奶牛乳房炎的發(fā)病率大約是20%～70%，每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)21億人民幣。相對(duì)于臨床型乳房炎，奶牛隱性乳房炎流行面廣，為臨床型乳房炎的15～40倍[2]，約占乳房炎的90%[3～5]，不但引起產(chǎn)奶量降低（可降低4%～10%），還影響乳品質(zhì)量及奶牛繁殖[6，7]。奶牛隱性乳房炎因無(wú)臨床癥狀，不易發(fā)現(xiàn)而容易被忽視，如不積極采取措施易轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床型乳房炎。因此，研究一種方便快捷、特異性好、可推廣使用的檢測(cè)方法，對(duì)隱性乳房炎患牛做出早期診斷并加以預(yù)防，對(duì)減少奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義[8]。

國(guó)內(nèi)外奶牛隱性乳房炎的檢測(cè)方法有體細(xì)胞數(shù)（SCC）檢測(cè)法、手握式導(dǎo)電儀檢測(cè)法、凝固酶試驗(yàn)(TCT)、單克隆抗體的免疫方法、DNA指紋圖技術(shù)檢測(cè)法、PCR檢測(cè)法等，這些方法大多需在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室才能完成，而且在臨床應(yīng)用時(shí)不能夠快速、簡(jiǎn)便地做出診斷。目前應(yīng)用先進(jìn)的ELISA試劑盒來(lái)檢測(cè)奶牛隱性乳房炎是一個(gè)快速簡(jiǎn)便的診斷思路。本試驗(yàn)基于ELISA的診斷方法，研究髓過(guò)氧化物酶作為奶牛隱性乳房炎診斷指標(biāo)的早期監(jiān)測(cè)效果。

髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）是PMN、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞釋放的嗜天青顆粒的主要成分[9,10]，并在炎癥過(guò)程中扮演著吞噬和溶菌的重要角色。MPO是乳房炎的指示性酶類(lèi)物質(zhì)，其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)抵抗微生物的作用已得到證實(shí)。瑞典的國(guó)家獸醫(yī)研究所于1994年制備了奶牛MPO的單克隆抗體，建立了針對(duì)牛乳中MPO的MPO-ELISA方法。本試驗(yàn)旨在研究奶牛隱性乳房炎發(fā)生時(shí)MPO與SCC及病原微生物的相關(guān)性，將MPO作為奶牛隱性乳房炎的指示性物質(zhì)，通過(guò)ELISA方法分析乳汁中MPO的量，以確定奶牛是否患隱性乳房炎[11]。通過(guò)MPO的研究對(duì)奶牛隱性乳房炎的檢測(cè)將上升到分子水平。目前，國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)關(guān)于奶牛乳房炎的MPO研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

太原市小店區(qū)某規(guī)模奶牛場(chǎng)隱性乳房炎泌乳奶牛200頭。

1.2 測(cè)試試劑及儀器

牛髓過(guò)氧化物酶(MPO)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒。

酶標(biāo)儀：芬蘭（Labsystems Multiskan MS），儀器型號(hào)：35 2型；洗板機(jī)：芬蘭（T h e r m o Labsystems），儀器型號(hào)：AC8；離心機(jī)：微量高速離心機(jī)（國(guó)產(chǎn)），儀器型號(hào)：TG16W；培養(yǎng)箱：隔水式恒溫培養(yǎng)箱（國(guó)產(chǎn)），儀器型號(hào)：GNP-9080。德國(guó)進(jìn)口的FOSS5000紅外線牛奶成分分析儀和FOSS5000體細(xì)胞測(cè)定儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 奶樣采集

所有奶樣來(lái)自某規(guī)?；膛?chǎng)的荷斯坦牛。奶樣采集用消毒取樣瓶，用取樣器無(wú)菌采取奶樣，每頭采集2份，每份10mL。其中1份用于體細(xì)胞計(jì)數(shù)或CMT測(cè)定，另1份-4℃～-20℃保存送測(cè)試中心用于MPOELISA測(cè)定。

1.3.2 MPO-ELISA檢測(cè)方法

應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定樣本牛奶中的髓過(guò)氧化物酶（MPO）水平。用純化的MPO抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被單抗的微孔中加入MPO，再與HRP標(biāo)記的MPO抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MPO呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中MPO的含量。

1.3.3 MPO、SCC相關(guān)性分析方法

利用德國(guó)進(jìn)口的FOSS5000紅外線牛奶成分分析儀和FOSS5000體細(xì)胞測(cè)定儀分析乳成分及SCC，每小時(shí)可分析奶樣150份。得出數(shù)據(jù)后導(dǎo)入DHI軟件系統(tǒng)中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，形成DHI報(bào)告后與理想的DHI參數(shù)進(jìn)行對(duì)比分析，然后進(jìn)行MPO與SCC檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析。

1.3.4 MPO、CMT相關(guān)性分析方法

選疑似隱性乳房炎泌乳奶牛60頭，共233個(gè)乳區(qū)乳樣，進(jìn)行CMT檢測(cè)，并進(jìn)行MPO與CMT檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性分析。

隱性乳房炎CMT法結(jié)果表示方式：陰性（-）表示為0，可疑（±）表示為1，弱陽(yáng)性（+）表示為2，陽(yáng)性（++）表示為3，強(qiáng)陽(yáng)性（+++）表示為4。

操作步驟：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μL，再加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μL分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μL 棄掉，再各取50μL分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μL分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻后從第七、第八孔中分別取50μL加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻后從第九、第十孔中各取50μL棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μL，濃度分別為120U/L、80U/L、40U/L、20U/L、10U/L）。分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。

在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測(cè)樣品10μL（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻；用封板膜封板后置37℃溫育30min；將30倍（48T的20倍）濃縮洗滌液用蒸餾水30倍（48T的20倍）稀釋后備用；小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外；用封板膜封板后置37℃再溫育30min；再洗滌；每孔先加入顯色劑 A 50μL，再加入顯色劑 B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min；每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）；空白孔調(diào)零，以450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15min以內(nèi)進(jìn)行。計(jì)算方法：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS12統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)。多個(gè)樣本均數(shù)的比較用單因素方差分析，檢驗(yàn)結(jié)果P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶樣中MPO-ELISA的測(cè)定范圍和特異性

MPO標(biāo)準(zhǔn)品按濃度梯度進(jìn)行稀釋（見(jiàn)表1），以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD450nm作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

由圖1可知，擬合直線回歸方程為：Y=-1.9535+72.7047X（r=0.9987），濃度與吸光值擬合度較優(yōu)，表明該方法檢測(cè)α1-AGP的含量比較可信。

表1 MPO標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度

圖1 奶樣中MPO-ELISA

2.2 奶樣中MPO與SCC相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 奶樣中MPO、SCC相關(guān)性試驗(yàn)結(jié)果

表2 奶樣中MPO、SCC相關(guān)性結(jié)果

圖2、表2結(jié)果表明：在不同體細(xì)胞數(shù)（SCC）的奶樣中，隨著SCC的增高，MPO含量也增多，奶樣中SCC、MPO含量有一定正相關(guān)關(guān)系（r=0.257）。鑒于奶液中的SCC、MPO指標(biāo)在一定范圍內(nèi)相關(guān)，且具有很規(guī)律的正相關(guān)性，SCC可作為隱性乳房炎診斷指標(biāo)之一，所以奶樣中MPO含量也可作為隱性乳房炎的診斷依據(jù)。

2.3 奶樣中MPO與CMT的相關(guān)性

圖3 MPO與CMT結(jié)果相關(guān)性分析圖

表3 MPO與CMT結(jié)果相關(guān)性分析表

圖3、表3結(jié)果表明：在不同MPO奶樣中，隨著MPO含量的增高，CMT檢測(cè)結(jié)果也部分由陰性到強(qiáng)陽(yáng)性，奶樣中MPO與CMT相關(guān)系數(shù)r=0.546，二者顯著相關(guān)，尤其在陽(yáng)性（++）至強(qiáng)陽(yáng)性（+++）區(qū)間內(nèi)MPO與CMT極顯著相關(guān)，部分由陰性到陽(yáng)性范圍內(nèi)MPO與CMT相關(guān)性差，還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論與討論

奶牛隱性乳房炎因不表現(xiàn)臨床癥狀，在生產(chǎn)中不易被發(fā)現(xiàn)。但隱性乳房炎會(huì)降低乳腺腺泡腔的容積，降低產(chǎn)奶量，從而影響終生產(chǎn)奶量[12,13]。隱性乳房炎如沒(méi)有得到較好地處理，很容易轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床型乳房炎，使牛因乳房炎淘汰的幾率增加[14,15]，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

MPO系統(tǒng)是牛乳中內(nèi)源性抗菌系統(tǒng)之一，但還未得到應(yīng)有重視。奶?；既榉垦讜r(shí)趨動(dòng)到炎癥感染部位的PMN會(huì)釋放吞噬顆粒酶MPO，可以通過(guò)檢測(cè)奶牛乳腺炎時(shí)的MPO含量和活性對(duì)奶牛隱性乳房炎做出早期診斷。研究表明，用MPO-ELISA檢測(cè)牛奶中的MPO是一個(gè)方便可行的診斷早期乳房炎的方法，MPO的水平是一個(gè)很好的指標(biāo)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明：隱性乳房炎發(fā)生時(shí)，奶樣中MPO與SCC有一定正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r＝0.257，呈顯著正相關(guān)；奶樣中MPO與CMT相關(guān)系數(shù)為r=0.546，二者顯著相關(guān)。說(shuō)明MPO在乳房炎奶汁中具有很高特異性，MPO含量的高低可作為隱性乳房炎的診斷依據(jù)。

在臨床獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，針對(duì)目前我國(guó)奶牛隱性乳房炎的高發(fā)病率和診斷技術(shù)相對(duì)落后的現(xiàn)狀，根據(jù)MPO在隱性乳房炎奶牛乳汁中具有高特異性和可檢測(cè)性的特點(diǎn)[16]，通過(guò)制備奶牛McAb，建立MPO-ELISA檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)試紙條，直接檢測(cè)奶樣進(jìn)行早期快速診斷方法是完全可行的，對(duì)此瑞典的Cooray R做過(guò)精確的評(píng)估，對(duì)141份奶樣的體細(xì)胞數(shù)和ELISA檢測(cè)MPO濃度得出的相關(guān)系數(shù)值為0.91。奶中MPO的ELISA結(jié)果顯示具有很高的敏感性和特異性，敏感性的變異總和為10%，結(jié)果較為理想，因此可以根據(jù)牛乳中MPO水平建立奶牛隱性乳房炎的診斷指標(biāo)。此外，將上述檢測(cè)方法應(yīng)用于其他哺乳動(dòng)物的炎癥性疾病檢測(cè)中[17]，相信也將同樣會(huì)具有廣闊的空間和發(fā)展前景。