小鼠腦梗死模型中全腦成像技術(shù)應(yīng)用展望

張?zhí)碓?綜述 逯丹，徐安定 審校

暨南大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510632

缺血性腦卒中(ischemic stroke)具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率的特點[1]。是由于各種原因引起的腦部血流供應(yīng)障礙，引起局部腦組織的缺血、缺氧性壞死，從而迅速出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能缺損的一類臨床綜合征。越來越多的研究表明，缺血性卒中是中樞神經(jīng)系統(tǒng)整體的病變，即該疾病不單單是局部的神經(jīng)元的壞死，還涉及到遠隔部位的損害[2]，以及具有代償功能的其他腦組織啟動代償作用[3-4]。但是傳統(tǒng)的切片及成像技術(shù)不能有效地進行完整大腦的成像，導致在數(shù)據(jù)采集過程會丟失很多信息，尤其是神經(jīng)連接的信息。為此，完整的器官成像技術(shù)亟需發(fā)展。近年來，顯微光學切片斷層成像系統(tǒng)(micro-optical sectioning tomography，MOST)以及組織透明技術(shù)(tissue clearing techniques)和lightsheet microscopy系統(tǒng)具備采集和重建更為完整的大腦三維結(jié)構(gòu)，能為研究缺血性卒中在細胞水平以及神經(jīng)元之間的連接提供更好的技術(shù)支持。

1 小鼠局灶性缺血模型的構(gòu)建

由于小鼠腦血管的解剖特點和人類相似，如存在Willis環(huán)，使小鼠廣泛用于缺血性腦卒中模型的構(gòu)建[5]。常見的模型構(gòu)建方法包括大腦中動脈線栓法(intraluminal thread middle cerebral artery occlusion model)、外科手術(shù)的大腦中動脈阻塞法(surgical middle cerebral artery occlusion models)、光栓塞法模型(photothrombosis model)[6-7]。

盡管小鼠的大腦約為幾厘米，但是傳統(tǒng)的光學顯微鏡和共聚焦顯微鏡不能對鼠腦進行直接的完整三維成像。而且傳統(tǒng)的切片技術(shù)費時費力，需要進行微米級別的切片以及每張切片的成像，然后將大量的切片整合處理才可能得到完整的鼠腦信息[8]。實際上，計算機斷層掃描(computed tomography，CT)和磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)也具備整體的成像，目前在急性缺血性腦卒中患者廣泛應(yīng)用，但是其分辨率過低不能觀察細胞水平而在小鼠模型的研究中受到了限制[9-11]。為了更好更快的獲得鼠腦完整的三維成像，不同的科學家們有不同的改進，而歸根到底是從兩個基本思路入手：(1)以MOST系統(tǒng)為代表的通過自動化切片同時增加成像速度盡可能地得到鼠腦信息；(2)將組織透明化后直接對鼠腦進行“無損”的完整三維成像。

2MOST的系列成像

2010年，中國科學院團隊開發(fā)了MOST系統(tǒng)并在《Science》雜志上發(fā)表論文：“Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain”[12]。該系統(tǒng)能對大型樣本進行直接的自動化成像，通過自動化的切片同時極大提高成像速度實現(xiàn)全腦成像。具體做法是首先通過對全腦進行高爾基染色，之后該系統(tǒng)使用金剛石刀具對樹脂包埋組織進行切割以使得成像平面較為平整的同時，光學顯微鏡同步地采集該包埋組織表面信息，最后獲得1 um體素辨率的全腦高爾基染色組織信息。后面由于熒光標志熒光成像的需求，出現(xiàn)了熒光顯微光學斷層成像系統(tǒng)(fMOST)；同時為了降低信號噪比，盡可能地提高信息采集的分辨率，同時加速成像速度等目標下，科學家經(jīng)過多次的反復改良優(yōu)化，開發(fā)了結(jié)構(gòu)光照明熒光光學切片斷層成像系統(tǒng)(structured illumination fluorescence micro optical sectioning tomography，SI-fMOST)，該系統(tǒng)增加了雙色成像能力，即同時進行雙通道的高通量全腦成像，通過同時采集不同波長、不同發(fā)射特性的熒光標志物標志，進行對比反襯作用，進而提高整體的成像分辨率到亞微米級別。同時具備具有天然配準性能，即每張原始圖像均具備X坐標、Y坐標和Z坐標，能夠進行鼠腦的三維信息進行重建，從而準確還原神經(jīng)元在全腦的空間位置[13]。

實際上，MOST系統(tǒng)同樣需要對樣品進行切片，會損傷樣品，仍存在丟失部分切片之間信息的風險。但較傳統(tǒng)方法而言，該成像方式已經(jīng)可以呈現(xiàn)出更為完整的全腦信息的要求。

3 組織透明技術(shù)和整體成像

在傳統(tǒng)的組織切片過程中，組織器官的完整性遭到破壞，而且切片會破壞特殊結(jié)構(gòu)的連續(xù)性，如在制片過程中會切斷神經(jīng)元的軸突，從而無法得到完整的神經(jīng)纖維[8]。為了追求整個組織器官甚至整個模式動物在顯微鏡進行直接成像，生物組織透明技術(shù)蓬勃發(fā)展。大腦等組織器官是由于其含有水、蛋白質(zhì)、脂類等多種不同折光率的多種物質(zhì)，當光線通過不同組成成分時會發(fā)生折射、散射等現(xiàn)象，導致光學觀察受到限制[8，14]。組織透明技術(shù)(tissue clearing)通過各種處理方式對腦組織進行折射率的匹配以達到透明效果，盡可能減少光線在透過腦組織時的吸收和散射，使顯微鏡能采集整體大腦器官的信息，從而更加真實的還原目標的三維空間結(jié)構(gòu)[14-15]。

2007年，維也納科技大學的DODT等[14]通過浸泡苯甲醇和苯甲酸芐酯的混合物(benzyl alcohol-benzyl benzoate，BABB)使鼠腦神經(jīng)網(wǎng)路可視化，并且能清楚觀察到CA1椎體神經(jīng)元的樹突在整個海馬中的形態(tài)。總體來說組織透明技術(shù)的核心是盡可能追求透明化的效果和盡可能減少熒光信號的淬滅。后陸續(xù)出現(xiàn)許多不斷優(yōu)化的組織透明技術(shù)，以3DISCO[8]、iDISCO[16]、uDISCO和FDISCO[17]為代表的方法，該類技術(shù)主要通過有機溶劑對組織樣本進行脫水脫脂，再進行折射率的匹配得到透明效果，其突出優(yōu)點是透明效果佳、樣品處理簡單、成本較低、時間短，但是熒光淬滅較快也是其突出的缺點。CUBIC、CLARITY在保持熒光強度方面更具優(yōu)勢，其他透明技術(shù)包括Scale、ScaleS、PACT-PARS等方法，每種方法均有其的優(yōu)缺點[15]，使用者可根據(jù)自己的需要選擇相應(yīng)的方法。

當組織透明化之后，能容納鼠腦組織的成像系統(tǒng)也很重要，Light-sheet microscopy[14]和Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy(DSLM)[18]能對鼠腦甚至整個小鼠進行完整的三維成像。同MOST系統(tǒng)類似，這類顯微鏡系統(tǒng)也在追求高通量信息采集即更快的成像速度以及更高的分辨率。該類成像系統(tǒng)優(yōu)點在于在不損傷樣本的和信息數(shù)據(jù)丟失的同時，具備更為直接的三維成像數(shù)據(jù)采集能力，缺點是分辨率有待進一步的提高[14]。

4 整體成像在缺血性卒中的應(yīng)用和展望

4.1 神經(jīng)元連接的示蹤與成像 特定神經(jīng)元之間相互聯(lián)系形成神經(jīng)回路(neural circuit)。除了成像技術(shù)，神經(jīng)元的標志也同樣重要。通過神經(jīng)示蹤技術(shù)“點亮”神經(jīng)傳導束形態(tài)，從而顯示出整個神經(jīng)環(huán)路。傳統(tǒng)的神經(jīng)示蹤技術(shù)包括葡聚糖胺(BDAs)、熒光金(fluoro-gold，F(xiàn)G)、固藍(fast blue，F(xiàn)B)等[19-20]。這類示蹤劑存在許多缺點，包括因無法進行特異性標志在注射部位局部擴散導致示蹤不準確，示蹤過程中不能跨突觸或跨突觸的效率不穩(wěn)定，而且信號衰減嚴重不能進行長程示蹤等。而重組病毒載體作為示蹤劑，可以通過選擇不同的病毒特性而進行標志。而重組的病毒工具主要是通過改造嗜神經(jīng)病毒得到的，根據(jù)感染神經(jīng)元的特性和能否跨突觸傳播，常見的分類代表如下：順行跨多級突觸的單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)[21]、逆行跨多級突觸的偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)[22-23]，順行跨單級突觸的腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)[24]以及逆行跨單級突觸的狂犬病毒(rabies virus，RV)[25]。其優(yōu)勢是能準確的標志神經(jīng)元形態(tài)，跨突觸效率更為穩(wěn)定。

MOST系統(tǒng)以及透明組織后整體成像在神經(jīng)科學領(lǐng)域取得了巨大的進步。如通過MOST系統(tǒng)對APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠三維重建，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元樹突在杏仁核(basolateral amygdala，BLA)明顯減少，該腦區(qū)樹突的減少可能是阿爾茲海默病的原因之一[26]；通過腺病毒標志神經(jīng)元在MOST系統(tǒng)成像，重建出紋狀體(striatum)-丘腦前內(nèi)側(cè)核(anteromedial thalamic nucleus)-前額葉內(nèi)側(cè)皮層(medial prefrontal cortex，mPFC)環(huán)路以及substantia innominate-anteromedial thalamic nucleus-mPFC環(huán)路[27]；通過肌肉注射rAAV病毒后，經(jīng)過FDISCO使脊髓透明化后，可追蹤支配肌肉的下運動神經(jīng)元在脊髓的逆行投射[28]。

在皮層局灶性腦梗死動物模型中，丘腦、黑質(zhì)等非缺血區(qū)域存在神經(jīng)元、神經(jīng)纖維的丟失，神經(jīng)膠質(zhì)細胞如小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞增生[2]。同時，通過深部腦刺激(deep brain stimulation)方法刺激小腦齒狀核，可以通過齒狀核-丘腦-皮層最終作用于皮層，引起突觸新生(synaptogenesis)、突觸可塑性(synaptic plasticity)標志物等的增加，有利于運動功能恢復[3]。提示缺血性腦梗死的功能變化不僅需要關(guān)注導致局部腦缺血引起細胞壞死的區(qū)域，更重要的是探索在腦梗死病理狀態(tài)下運動、感覺等功能相關(guān)的神經(jīng)回路的改變[29]。因此，選擇合適的病毒工具標志神經(jīng)環(huán)路，根據(jù)自己需要通過透明化后成像或直接進行MOST系列系統(tǒng)成像，可能更好的揭示神經(jīng)元、神經(jīng)連接等在缺血性卒中后全腦內(nèi)的三維變化。

4.2 全腦血管成像研究 CLARTY在細胞水平上定位并重建大腦的血管系統(tǒng)的三維結(jié)構(gòu)整體成像[30]；MOST系統(tǒng)同樣可以重建鼠腦的動靜脈的脈管系統(tǒng)在大腦的空間分布[31]，也可獲取腦出血小鼠模型的神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)(neurovascular networks)信息等[32]。當大腦的供血動脈發(fā)生狹窄或堵塞，腦的側(cè)枝循環(huán)會代償達到缺血區(qū)域，從而使缺血組織得到不同程度的灌注代償。目前許多研究的聚焦于缺血周圍區(qū)新生血管的變化，研究范圍較為局限[33]。但是新生血管是否局限于缺血周圍區(qū)域和代償形式值得進一步深究。而且似乎鮮有人研究其他供血腦血管包括Wills環(huán)血管在腦梗死發(fā)生后的整體變化。通過構(gòu)建小鼠缺血性卒中模型，進行血管的標志后運用上述兩種方式進行全腦高分辨率的血管成像，有利于進一步揭示在卒中發(fā)生時以及卒中后的整體大腦血管的變化，進一步揭示腦血管病的病理生理過程。

4.3 神經(jīng)膠質(zhì)細胞的整體變化 由于神經(jīng)膠質(zhì)細胞的形態(tài)不像神經(jīng)元和血管可以追蹤，使得神經(jīng)膠質(zhì)細胞在全腦成像似乎沒那么重要。實際上，在發(fā)生缺血性卒中后，缺血區(qū)域、缺血周圍區(qū)域、丘腦、脊髓等多個部位的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞均出現(xiàn)改變[2，34-35]。而且，小膠質(zhì)細胞(microglia)和星形膠質(zhì)細胞(astrocyte)為代表的神經(jīng)膠質(zhì)細胞在缺血性卒中后發(fā)揮的功能非常復雜，比如小膠質(zhì)細胞在卒中后存在不同極化狀態(tài)可能具備不同功能，星形膠質(zhì)細胞可能在卒中后不同時期具備損傷或促進康復功能[35-36]。全腦成像無疑利于卒中后膠質(zhì)細胞變化的研究，比如研究包括膠質(zhì)細胞在卒中后如何發(fā)生遷移，在中風前后同一腦區(qū)以及不同腦區(qū)之間的數(shù)目變化、形態(tài)改變和功能發(fā)揮是否存在差異等。

5 展望

透明化技術(shù)仍在往更簡便、更快捷和透明化效果更好的方向發(fā)展。不管是MOST系統(tǒng)還是透明化后成像方法均有其不足?？傮w來說，包括成像分辨率仍可以進一步提高，成像速度進一步加快以及容納更大型的組織標本成像等。缺血性腦卒中可以影響很多功能，以運動功能為例子，運動功能的障礙機制可能同時引起包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周器官在內(nèi)的整體變化。因此，未來的挑戰(zhàn)除了關(guān)注于全腦范圍內(nèi)的神經(jīng)血管同時變化，可能還在于如何聯(lián)系中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其支配器官在缺血性腦卒中的變化。