結核分枝桿菌對乙硫異煙胺/丙硫異煙胺耐藥的機制及其增敏劑研究進展

宋艷華 高孟秋 李琦

耐藥結核病(MDR-TB)是全球結核病控制的重大挑戰(zhàn)。2019全球結核病播報數(shù)據(jù)顯示，全球估計約有48.4萬例為新發(fā)的耐利福平結核病(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)，其中有78%為MDR-TB。 中國是MDR-TB高負擔國家之一，和印度、俄羅斯3個國家占了全球1/2的MDR/RR-TB患者[1]。對一線核心抗結核殺菌藥品異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RFP)耐藥的MDR-TB，需要二線抗結核藥物治療，WHO指南推薦4～5種抗結核藥品組成MDR-TB治療方案[2]。二線抗結核藥物因為不良反應多、用藥不便、療效欠佳等局限性，往往導致不規(guī)律治療，增加產生廣泛耐藥結核病(XDR-TB)的風險。研發(fā)新型有效的抗結核藥物是治愈MDR-TB的關鍵，目前只有貝達喹啉和德拉馬尼兩種藥品用于臨床。乙硫異煙胺(ethionamide，ETH)/丙硫異煙胺(prothionamide，PTH)是在1950年發(fā)現(xiàn)的抗結核藥物，但是因為這兩種藥品的有效濃度和藥物不良反應(消化道反應、肝損傷等)相關，限制了應用，一直為二線抗結核藥品；ETH/PTH對一線藥物耐藥的MTB仍可敏感，所以隨著對INH、RFP耐藥的MDR-TB的增多， ETH/PTH主要用于MDR-TB的治療，目前仍是WHO相關指南推薦為RR-TB/MDR-TB治療的藥品之一[2]。近年來， ETH/PTH增敏劑的研究也取得了明顯進展。筆者就兩種藥品的應用史、流行病學、作用機制、耐藥及與INH交叉耐藥機制、增敏劑研究等方面進行綜述。

一、ETH/PTH簡介

ETH和ETH是在20世紀50年代后期合成，都是異煙酸的衍生物。兩種藥品在體外和體內都表現(xiàn)出了抗MTB活性，作用機制和INH相似，都是抑制分枝菌酸的合成，但抗菌活性較INH活性低，ETH對MTB野生株的最低抑菌濃度(MIC)為 0.5～2 mg/L； PTH對MTB的 MIC值在0.125～1.0 mg/L[3]。PTH在小鼠體內表現(xiàn)出和ETH相似的抗菌活性，并且患者使用中不良反應較ETH少[4]。ETH與PTH結構和作用機制相似，可以視為同一種藥物，在應用中兩藥可以相互代替[5-6]，我國僅生產PTH，屬于二線抗結核藥品，因為口服方便性及可獲得性，PTH目前在我國的MDR-TB方案中常作為一個基本的組成部分[6-7]。

二、流行病學

PTH作為二線抗結核藥品，在我國抗結核藥物治療中的應用遠不如一線抗結核藥物普遍，但是由于和INH存在部分交叉耐藥性，并且隨著在MDR-TB患者中的應用時間延長，PTH耐藥株在我國的流行情況及耐藥特征需要了解。2010年我國結核病流行病學調查顯示，INH耐藥率為 30.8%，PTH總耐藥率為12.9%(95%CI：9.2%～17.4%)[8]；來自部分結核病防治機構的數(shù)據(jù)顯示，MDR-TB(包括XDR-TB)中PTH耐藥率為4.5%和6.0%[9-10]；來自一些結核病?？漆t(yī)院的數(shù)據(jù)顯示 MDR-TB(包括XDR-TB)的PTH的耐藥率為20.0%～24.8%[11-13]，其中筆者的研究(數(shù)據(jù)來自北京胸科醫(yī)院)顯示PTH的耐藥率隨著MDR-TB到XDR-TB耐藥譜的增寬，PTH耐藥率逐漸增高，在MDR-TB中為11.2%，pre-XDR-TB中為30.1%，XDR-TB中為70.6%[14]。而非洲的MDR-TB患者中對ETH的耐藥率較高， MDR-TB 臨床分離菌株中 78.6%(11/14)對ETH耐藥，在泰國的MDR-TB患者中這一耐藥率為15.0%[15]。對ETH耐藥的菌株基本上都對INH耐藥[16-17]。由此可見，在不同地區(qū)對INH耐藥的菌株(尤其是MDR-TB)同時對ETH/PTH耐藥的耐藥率具有差異性， ETH/PTH的應用需要結合所在地區(qū)的耐藥菌株流行情況制訂合理的治療方案。

三、ETH/PTH的抗結核作用機制

ETH/PTH的抗結核作用機制主要是抑制敏感細菌分枝菌酸的合成而使細胞壁破裂[6]。INH、ETH/PTH和吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)相似，需要在細菌體內激活而發(fā)揮作用。ETH/PTH由黃素腺嘌呤二核苷酸單加氧酶(EthA，又稱EtaA，由Rv3854c編碼)激活，形成ETH-NAD或者PTH-NAD復合物，之后和INH作用機制相似，作用于enoyl-ACP還原酶(InhA，Rv1484編碼)[18]，進而降低單不飽和?；鵄CP(acyl-ACP)到?；鵄CP的合成，干擾脂肪酸合酶Ⅱ(FASⅡ)形成，導致分枝菌酸的生物合成的受阻，導致MTB死亡[18-19]。但是因為和INH存在部分相同作用通路，導致INH和ETH/PTH存在著部分交叉耐藥。

四、對ETH/PTH耐藥的機制

對ETH/PTH耐藥的機制，主要包括ETH/PTH前藥激活酶 EthA和EthA的轉錄調控因子EthR、藥物的作用靶點enoyl-ACP還原酶InhA編碼基因突變，及其他調節(jié)藥物激活或者作用的酶類基因的改變，如ndh基因、mshA基因、nudC基因等[18]。下面對3個主要的耐藥機制進行說明。

(一) ETH/PTH的作用靶點InhA的改變(inhA基因突變)

ETH/PTH的作用靶點enoyl-ACP還原酶InhA基因突變，是ETH/PTH耐藥機制，也是INH和ETH/PTH交叉耐藥的主要機制。

1960年有研究者從用過INH但是沒有用過ETH的結核病患者的臨床分離株中發(fā)現(xiàn)了對INH和ETH共耐藥的菌株[20]； 1990年隨著分枝桿菌質粒轉化系統(tǒng)技術的發(fā)展，證實MTB的InhA改變是對INH和ETH共耐藥性的共同機制。Banerjee 等[21]在1994年通過構建恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)，牛分枝桿菌(M.biovs)耐藥株及敏感株的基因組DNA文庫，并通過質粒轉染到野生型M.smegmatis、M.biovs、MTB的方法，發(fā)現(xiàn)inhA基因的開放閱讀框(Open reading frames，ORF)突變或者inhA過度表達足以引起M.smegmatis、M.biovs、MTB對INH和ETH 共耐藥，同時通過基因測序分析等方法證實inhAORF的S94A突變是引起INH和ETH共耐藥的原因。把對INH和ETH耐藥的M.smegmatis中的inhAS94A突變體轉染到野生型MTB中，獲得的菌株對INH和ETH耐藥性較野生型MTB高5倍[22]。分子化學研究顯示，inhAS94A突變導致InhA共作用因子NADH的米氏常數(shù)(Km值)增加，同時減少了INH-NAD和InhA(S94A)的結合，顯著減弱INH-NAD對InhA(S94A)的抑制作用[23]。另外，inhA調控序列的c-15t突變，使inhA基因的mRNA水平增加20倍，導致inhA過度表達，INH和ETH的對MTB的MIC增加了8倍[23]。

在對ETH/PTH耐藥的臨床分離株中，inhA基因突變是比較常見的分子機制，包括調控序列和ORF突變。在對INH和ETH/PTH耐藥的菌株中分別有8%～43%和47%～65%菌株存在inhA基因突變[24]，以調控序列突變?yōu)橹?。最常見的突變是c-15t[11,16]，對INH和ETH/PTH共耐藥的菌株中約70%有此突變，其次是g-17t[16]。單inhAc-15t 突變的MTB臨床株多為對INH低度耐藥(MIC<2 mg/L)[22]，少部分菌株的MIC略高(MIC在2～4 mg/L)[16]；而對ETH耐藥的程度變化較大(MIC從<2.5 mg/L 到≥200 mg/L)[16]。而據(jù)報道在c-15t突變的對INH耐藥的菌株中有1/2以上合并KatG和ethA、inhA編碼區(qū)突變[16,22]。 對INH和ETH/PTH耐藥菌株的臨床檢測結果中，inhA的ORF突變發(fā)生率較調控序列低，主要突變類型為S94A，其次是I21T、 I95P[22]，這些突變菌株多對INH呈低度耐藥[22,25]，對ETH呈高度耐藥[16]。我國Tan等[26]的研究顯示，在46株對PTH耐藥的菌株中，26.1%菌株存在c-15t突變，13%菌株存在S94A突變。而據(jù)報道在inhA的c-15t突變的對INH耐藥的菌株中有1/2以上合并katG和ethA、inhA編碼區(qū)突變[22,27]。這可能是由于對INH和ETH/PTH共耐藥的菌株多為MDR-TB菌株，隨著耐藥種類及程度的累積增加，突變基因及位點也積累增多，對INH及ETH的表型耐藥也可能是不同機制的多個基因位點聯(lián)合突變的結果；而且對于沒有檢測出inhA基因突變的臨床株，選擇ETH/PTH組成方案時，也要考慮其他耐藥基因突變存在可能，注意觀察療效及進行表型藥敏試驗隨訪。

另外，和臨床株的耐藥分子機制不同，體外含INH和ETH培養(yǎng)基上獲得的耐藥株缺乏inhA基因突變[27]。既往臨床株研究多數(shù)關注的是對INH或者ETH/PTH耐藥的菌株(以MDR-TB為主)中inhA的突變情況，對敏感株中inhA突變情況研究較少。最近幾年來數(shù)個臨床研究報道，inhAc-15t(合并或不合并其他inhAORF基因突變)突變的臨床菌株中仍有一定比例(13.5%～69%)的菌株對ETH/PTH敏感[11,28-31]。所以筆者認為，inhA基因突變與 ETH/PTH表型藥敏試驗結果為耐藥的相關性可能具有地域性，inhA突變株可能存在其他機制發(fā)揮對ETH作用，inhA突變的臨床意義需要進一步研究。

(二) ETH/PTH激活酶EthA的改變(ethA 突變)

ETH/PTH需要經(jīng)過細菌的EthA酶激活才能發(fā)揮生物效應。在實驗室由ETH藥培養(yǎng)基篩選出耐藥株，有19.4%(7/46)菌株存在ethA基因錯義或缺失突變[29]。在臨床株研究中，ethA基因突變也是對ETH耐藥的一種重要分子機制。據(jù)報道，在對ETH耐藥的MDR-TB臨床株中有54.2%～100.0%菌株存在ethA突變[15,17,32]，部分菌株合并inhA基因突變?；騟thA的突變中大約2/3的核苷酸變化是錯義突變，而其余則是插入、缺失或無意義突變；這些突變位點分布在ethA的整個編碼區(qū)域，沒有優(yōu)勢突變位點[18]。我國Tan等[26]的研究中，46株對PTH臨床耐藥的菌株中，19株(51.4%) 有ethA突變，16 株(43.2%)有inhA調控序列突變，6 株(16.2%) 為inhAORF突變。法國一項研究顯示，對ETH耐藥的菌株中，62%菌株具有inhA的突變(ORF和/或調控序列)，47%的ethA存在突變[32]。不同地區(qū)菌株ethA的突變率有差異，結合體外研究數(shù)據(jù)，考慮ethA基因突變和ETH藥物應用，是造成對ETH耐藥的重要機制，對于ETH應用較廣泛或者耐藥率較高的地區(qū)，在考慮選擇ETH組成方案時，有必要進行ethA基因的分子耐藥檢測。

(三) EthA調控因子EthR的改變(ethR基因)

EthR(Rv3855)是一種轉錄抑制因子，負向調控ethA的轉錄。ethR失活的菌株對ETH高度敏感，ethR過度表達導致MTB對ETH的耐藥性增加[33]。對ETH高耐藥的臨床株中，4%的菌株有此突變，突變類型為A95T和F110L[32]；但是部分對ETH耐藥的菌株含有ethA或inhA突變?；騟thR可能在臨床菌株對ETH耐藥只中扮演次要的角色。但是，以ethR為靶點抑制劑的研究是新藥研究的一個方向，目的是減少EthR對EthA的負向調控作用， 促進常規(guī)劑量下ETH/PTH的殺菌作用。

五、 ETH增敏劑的研究進展

細胞壁的完整性、通透性、致病性對于分枝桿菌的生存至關重要，是一個重要的藥物靶點。抗結核藥品ETH/PTH、INH作用于MTB的細胞壁的脂類的合成過程，對這些已經(jīng)存在抗結核藥物作用機制的深入了解，進一步促進了未來藥物靶點的發(fā)現(xiàn)及新型藥物的研發(fā)。近年來基于EthA轉錄調控因子EthR的抑制劑(ETH增敏劑)研究取得了新的進展。

ETH作為一種前藥，需要細菌的單加氧酶 EthA激活才能具有殺菌活性。EthR是轉錄調控因子TetR家族的一員，基因ethR與ethA排列在一個共同的基因間啟動子區(qū)域的不同操作子中，負向調控ethA的轉錄。通過抑制EthR的功能，增強ethA的表達，促進ETH/PTH 的殺菌活性，是新藥研發(fā)的一個方向。

近年來，采用基于結構或者片段的藥物設計方法，通過虛擬篩選新型分子結構物，在尋找EthR 抑制劑方面進行了大量的新型分子研究，發(fā)現(xiàn)一些化合物(如BDM31343、BDM41906)能具有抑制EthR的作用。體外及動物體內研究顯示，這些抑制物和ETH同時應用，可增強ETH對MTB敏感菌株的殺菌活性[34]；同時提高了對INH和RFP耐藥的MDR-TB菌株殺菌作用，但是對ethA突變耐藥菌株殺菌作用不確定。在對EthR 抑制劑進一步結構改造中發(fā)現(xiàn)的一種新型化合物SMARt-420，這種化合物失去了與EthR結合的能力，但是它仍然能增強ETH抗結核作用[35-36]。用SMART-420處理的牛分枝桿菌BCG轉錄組的分析，揭示了編碼轉錄調節(jié)因子和氧化還原酶(分別命名為EthR2和EthA2)的兩個隱性基因的強烈誘導， SMART-420的靶點是EthR2，而不是EthR[37]。SMARt-420與EthR2結合并改變其構象，從而阻斷后者在EthA2啟動子上游的結合?；騟thA2和ethR2是一對ethA和ethR同源基因，EthR2抑制EthA2的轉錄表達，而不是EthA。 EthR2和EthR分子結構相似， SMARt-420 通過抑制EthA2作用，增加對ETH有激活作用的EthR2的表達，同時繞過ethA、ethR基因突變靶點，所以SMARt-420 和ETH聯(lián)合可以增加敏感株對ETH敏感性，同時提高ethA基因突變的耐藥菌株對ETH的敏感性，其發(fā)揮作用的靶點仍是InhA[36]。SMARt-420作為ETH的增敏劑的出現(xiàn)將在絕大多數(shù)MDR-TB中提高ETH的殺菌活性，即使對ETH耐藥的ethA突變菌株，也能發(fā)揮殺菌活性。但是其人體安全性及有效性數(shù)據(jù)需要進一步驗證。

另外，以InhA為靶點的新型藥物研究也有發(fā)現(xiàn)。烯酰-ACP還原酶InhA是參脂肪酸合成的酶，是抗結核藥物開發(fā)的有效靶點之一。大多數(shù)對INH耐藥的是katG突變，導致INH-NAD復合物形成障礙，使得INH不能被激活； ETH/PTH發(fā)揮殺菌作用也是同樣需要激活，ethA等突變導致其激活受阻，進而不能和InhA結合發(fā)揮生物活性。但是設計直接抑制InhA的化合物就可以繞過katG基因和inhA基因，直接發(fā)生效應[38]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些化合物對MTB的InhA有明顯的抑制作用。如二苯醚衍生物具有和InhA具有高親和力等特點，但一些二苯醚化合物只在體外具有顯著的療效，沒有體內活性。在InhA抑制劑中，4-羥基-2-吡啶酮(4-hydroxy-2-pyridones)是種具有體外及體內顯著抑制InhA活性和較好藥代動力學參數(shù)的新化學物[38]，具有一定的研究和應用前景。

六、總結

ETH/PTH目前仍是WHO耐多藥治療指南和我國專家共識推薦的治療MDR-TB的藥品，了解耐藥特征及分子機制，將指導我們選擇藥物組成合適方案，同時基于ETH、PTH作用機制的新藥的研發(fā)，為耐藥結核病治療及終結結核病的目標帶來新的希望。