液基薄層制片技術(shù)制作外周血淋巴細(xì)胞涂片方法學(xué)的建立及免疫組化染色應(yīng)用

孔慶暖 王麗娜

[摘要] 目的 應(yīng)用液基薄層制片技術(shù)制作外周血淋巴細(xì)胞涂片，以期建立更加簡單直觀且能夠與分子生物學(xué)相結(jié)合的外周血淋巴細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查方法。 方法 利用Ficoll-hypaque密度梯度離心法分離外周血淋巴細(xì)胞，液基細(xì)胞保存液中過夜保存，液基薄層涂片技術(shù)制作細(xì)胞涂片，并通過SP免疫組化染色觀察T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞表面抗原CD3和CD20在涂片淋巴細(xì)胞中的表達(dá)，并通過表達(dá)部位獲取兩種抗原的免疫表型保存情況。 結(jié)果 對5名健康者外周靜脈血制作淋巴細(xì)胞涂片，淋巴細(xì)胞獲得率達(dá)95%以上，形態(tài)保存完好，SP免疫組化法顯示，CD3和CD20抗原均清晰表達(dá)在相應(yīng)淋巴細(xì)胞亞群的細(xì)胞膜上，通過免疫組化法計(jì)數(shù)的淋巴細(xì)胞亞群比例和文獻(xiàn)結(jié)果相一致。 結(jié)論 與傳統(tǒng)外周血手工涂片相比，液基薄層制片技術(shù)制作外周血淋巴細(xì)胞涂片可快速有效地應(yīng)用于外周血淋巴細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化染色，對臨床淋巴細(xì)胞亞群分類、淋巴瘤分型及預(yù)后判斷有重要的應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 外周血；淋巴細(xì)胞；液基薄層制片；免疫組化

[中圖分類號] R446.111 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（c）-0023-04

Establishment of preparing lymphocytes smears with thinprep liquid-based technology in blood and application of immunostaining

KONG Qingnuan1 WANG Li'na2 HAN Zenglei1 HUANG Weiqing1▲

1.Department of Pathology， Qingdao Municipal Hospital， Shandong Province， Qingdao 266071， China； 2.Department of Clinical Laboratory， the Sixth People's Hospital of Qingdao City Qingdao City Hospital for Infectious Diseases， Shandong Province， Qingdao 266000， China

[Abstract] Objective To develop a new morphological examination method which make smears of lymphocytes in peripheral blood as well as applied with immunohistochemistry using thinprep liquid-based technology. Methods After separated by Ficoll-hypaque density centrifugation， lymphocytes in peripheral blood were preserved in special PreservCyt Solution overnight. And liquid-based smears were prepared with cytospin on the principle of thinprep cytologic test. The immune phenotype of lymphocytes were observed with CD3 and CD20 immunohistochemistry staning. Accurate expression location indicated the condition of antigen preservation in lymphocytes. Results The lymphocytes yields of five healthy volunteers reached up to 95% with complete and clear cell morphology. CD3 and CD20 were accordingly expressed on cell membranes of two lymphocyte subsets. The proportion of the two lymphocyte subsets calculated by immunohistochemstry staining was in accordance with previous literature. Conclusion The application of preparing lymphocytes smears with thinprep liquid-based technology in blood method in lymphocytes morphology observation and immunohistochemistry staining is rapid and effective compared with conditional manual blood smears. The method also has important values on lymphocyte subsets classification， lymphoma classification and prognosis.

[Key words] Peripheral blood； Lymphocytes； Thinprep liquid-based technology； Immunohistochemistry

目前外周血形態(tài)學(xué)檢測主要是應(yīng)用傳統(tǒng)血涂片的方法，但是存在重復(fù)性差、涂片質(zhì)量較低等缺點(diǎn)，且對淋巴系統(tǒng)相關(guān)病變引起的外周血淋巴細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變不能細(xì)致觀察，漏診率高，無法應(yīng)用于下一步的分子生物學(xué)檢測[1]。液基細(xì)胞學(xué)，簡稱TCT（ThinPrep Cytology Test），是一種將脫落細(xì)胞保存在液體中，并通過特殊設(shè)備將細(xì)胞均勻分散貼附在載玻片上制成涂片的技術(shù)，20世紀(jì)90年代中后期開發(fā)[2]，目前主要在病理科應(yīng)用于宮頸細(xì)胞學(xué)及體腔脫落細(xì)胞學(xué)檢測，它是通過機(jī)械、氣動(dòng)與流體力學(xué)原理，用全自動(dòng)設(shè)備將細(xì)胞涂成均勻的薄層標(biāo)本，其操作方法簡單，細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞表面相關(guān)抗原保存良好，技術(shù)水平先進(jìn)[3-4]。因此，本研究通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)和條件調(diào)整，將液基薄層制片技術(shù)與外周血淋巴細(xì)胞提取相結(jié)合，跨學(xué)科建立了一種可清晰準(zhǔn)確地觀察外周血淋巴細(xì)胞形態(tài)的方法，經(jīng)過驗(yàn)證該方法可應(yīng)用于進(jìn)一步SP免疫組化染色，該方法的建立將為惡性淋巴瘤的臨床診療及判斷預(yù)后帶來新的思路，有非常廣闊的應(yīng)用前景。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇健康自愿捐獻(xiàn)外周血者5名，均無淋巴造血系統(tǒng)疾病等慢性病史、惡性腫瘤病史、近期急性感染病史，1個(gè)月內(nèi)未服用任何藥物；男2名，女3名，年齡25～43歲，平均32.6歲；每人抽取外周靜脈血3 mL，常規(guī)EDTA抗凝管抗凝。

1.2 主要試劑和儀器

淋巴細(xì)胞分離液（北京Solarbio）；液基細(xì)胞處理試劑盒（寧波美生醫(yī)療器材有限公司）；兔抗人CD3單克隆抗體（1∶200，福建邁新生物技術(shù)有限公司）；兔抗人CD20單克隆抗體（1∶300，福建邁新生物技術(shù)有限公司）；自動(dòng)細(xì)胞制片機(jī)（寧波美生醫(yī)療器材有限公司）；低溫冰箱（青島海爾）；可控式恒溫干燥箱（山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 外周血淋巴細(xì)胞提取

應(yīng)用Ficoll-hypaque密度梯度離心法（1800 r/min）分離淋巴細(xì)胞，具體步驟如下：吸取新鮮EDTA抗凝血（30 min內(nèi)）2 mL，室溫下13 000 r/min離心3 min，去除上層血漿后加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液，低溫離心機(jī)離心30 min（4℃，1800 r/min），小心緩慢吸取第2層白色絮狀物（淋巴細(xì)胞層），用Hanks液低速離心洗滌細(xì)胞3次，將沉淀細(xì)胞保存于液基細(xì)胞處理試劑盒（內(nèi)含細(xì)胞保存液3 mL）內(nèi)，輕微震蕩后室溫過夜。

1.4 淋巴細(xì)胞液基涂片制備

取2 mL室溫過夜后的上述細(xì)胞保存液，常溫下用自動(dòng)細(xì)胞制片機(jī)離心5 min（1800 r/min），淋巴細(xì)胞離心于自動(dòng)細(xì)胞制片機(jī)內(nèi)的黏附載玻片上，制備成直徑2 cm的薄層液基細(xì)胞涂片，室溫5 min晾干，在預(yù)冷的4℃純丙酮中固定20 min后進(jìn)行Giemas染色評估淋巴細(xì)胞形態(tài)及淋巴細(xì)胞百分比。

1.5 免疫組化染色

上述純丙酮固定的淋巴細(xì)胞涂片經(jīng)PBS沖洗（3次，5 min/次）后，采用檸檬酸鹽（1∶100，pH 6.0）微波修復(fù)，將檸檬酸溶液放于微波爐中加熱至沸騰后放入涂片，持續(xù)2.5 min，自然冷卻后加入3%過氧化氫孵育30 min，PBS沖洗（3次，5 min/次），滴加50 μL一抗4℃過夜（兔抗人CD3、CD20單克隆抗體），PBS沖洗（3次，5 min/次），二抗（通用型IgG抗體）37℃孵育10 min，PBS沖洗后（3次，5 min/次）DAB顯色3 min，蘇木精復(fù)染30 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。PBS緩沖液代替一抗為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 淋巴細(xì)胞形態(tài)及比例評價(jià)

傳統(tǒng)外周血涂片是應(yīng)用推片技術(shù)制作，優(yōu)點(diǎn)在于能夠觀察全血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，但由于受到手工操作限制，存在方法操作一致性差、細(xì)胞涂片過厚、由于紅細(xì)胞過多對淋巴細(xì)胞形態(tài)觀察不仔細(xì)等缺點(diǎn)，而且涂片觀察有時(shí)間性的限制。應(yīng)用液基細(xì)胞技術(shù)制備的淋巴細(xì)胞涂片，殘余紅細(xì)胞可被細(xì)胞保存液有效破壞，且細(xì)胞經(jīng)過固定，采用中性樹膠封片，保存時(shí)間長久。Giemas染色證實(shí)，該方法制備淋巴細(xì)胞涂片細(xì)胞操作簡單，一致性好，形態(tài)完整，細(xì)胞核清晰，核膜圓滑，無細(xì)胞自溶脹大，無皺縮脫水等現(xiàn)象，5張涂片淋巴細(xì)胞比例均96%以上。見圖1（封四）。

2.2 免疫組化染色評估

免疫組化抗體CD3抗原標(biāo)記T淋巴細(xì)胞亞群，CD20抗原標(biāo)記B淋巴細(xì)胞亞群，兩者陽性標(biāo)記均為細(xì)胞膜棕黃色顆粒沉積。染色完成后每張涂片計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陽性染色T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞比例。SP免疫組化染色結(jié)果顯示，CD3及CD20抗體均在淋巴細(xì)胞細(xì)胞膜完整清晰表達(dá)（圖2、3，封四），統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，5名健康者外周血中T淋巴細(xì)胞所占比例平均80.6%，B淋巴細(xì)胞所占比例平均6.6%，見表1。T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞比例與流式細(xì)胞學(xué)等檢測方法結(jié)果基本一致[5-8]。

3 討論

外周血檢測創(chuàng)傷性小，簡單快速，標(biāo)本易于獲得，可檢測指標(biāo)廣泛，是臨床輔助檢查的重要工具[9]。隨著惡性淋巴瘤發(fā)病率的逐年上升，外周血對于早期發(fā)現(xiàn)異形淋巴細(xì)胞、淋巴瘤患者的臨床特征，評估治療效果及淋巴瘤預(yù)后監(jiān)測等有重要的價(jià)值[10-11]。王冰潔等[12]研究表明，不同淋巴瘤類型呈現(xiàn)不同的EBV感染狀態(tài)，外周血EBV-DNA陽性為影響淋巴瘤患者總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。然而由于流式細(xì)胞學(xué)和其他分子生物學(xué)等新技術(shù)的飛速發(fā)展，以外周血涂片為主的傳統(tǒng)血液形態(tài)學(xué)因?yàn)橥科|(zhì)量等原因受到極大的發(fā)展限制[13-14]。液基薄層制片技術(shù)是近幾年迅速發(fā)展的細(xì)胞學(xué)檢測方法，目前主要應(yīng)用于婦科及胸腹腔脫落細(xì)胞學(xué)檢查，在病理科應(yīng)用較為廣泛[4，15-16]。近年來免疫組化在液基細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值已得到廣泛證實(shí)：P16和Ki67免疫組化聯(lián)合應(yīng)用能顯著提高宮頸上皮內(nèi)瘤變的液基細(xì)胞陽性率；在胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)中，免疫組化能夠清晰地標(biāo)記出惡性腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行腫瘤分型[17-19]。本研究將該技術(shù)應(yīng)用到血液學(xué)檢查中，發(fā)現(xiàn)通過這種方法保存和制作的淋巴細(xì)胞涂片，操作簡單，制作的細(xì)胞形態(tài)完整清晰，且能夠應(yīng)用于進(jìn)一步的免疫組化檢查。

眾所周知，固定液的成分對細(xì)胞抗原保存非常重要，固定液的不正確應(yīng)用可導(dǎo)致細(xì)胞膜上的抗原丟失，對后續(xù)免疫組化產(chǎn)生假陰性結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)過程中，筆者對比了純酒精、10%中性甲醛、常溫丙酮及4℃純丙酮4種不同的固定液成分，通過反復(fù)條件調(diào)整和摸索，確認(rèn)4℃純丙酮是最佳固定試劑，將丙酮提前24 h放入4℃冰箱預(yù)冷，該方法不僅可以為后續(xù)免疫組化保存了完整的抗原，且細(xì)胞黏附力好，在反復(fù)沖洗過程中不易脫片，該方法也是借鑒了婦科脫落細(xì)胞免疫組化的固定條件[20-21]。本研究所用的液基細(xì)胞保存液是成熟的商業(yè)化產(chǎn)品，所含成分能夠有效地破壞殘余紅細(xì)胞，完全去除紅細(xì)胞對涂片質(zhì)量的影響，因此淋巴細(xì)胞得率高，基本保存了外周血中所有淋巴細(xì)胞類型，能夠反映外周血淋巴細(xì)胞的基本情況。CD3和CD20是淋巴細(xì)胞的重要標(biāo)志物，分別表達(dá)在T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞細(xì)胞膜上。現(xiàn)有研究表明，血液中淋巴細(xì)胞分類以T淋巴細(xì)胞為主，比例占80%左右，B淋巴細(xì)胞比例為3%～10%不等，筆者通過免疫組化證實(shí)，該方法所獲得淋巴細(xì)胞比例與之前的研究結(jié)果基本一致[5-8]，因此該方法對淋巴細(xì)胞亞群分型有重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)方法雖然對鑒定早期病例及患者預(yù)后和治療有重要意義，但同時(shí)存在一定的缺點(diǎn)，例如假陽性率高，對血液異常成分或異型淋巴細(xì)胞不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和鑒別，特別是對形態(tài)學(xué)作為主要診斷標(biāo)準(zhǔn)的淋巴系統(tǒng)疾病不能提供基本信息等。因此，血液形態(tài)學(xué)仍然應(yīng)該做為分子生物學(xué)技術(shù)的重要基礎(chǔ)和補(bǔ)充，兩者互為促進(jìn)，互相發(fā)展才能夠發(fā)現(xiàn)新的病種和類型，對血液疾病有更加深入的認(rèn)識[22-23]。本研究屬于方法學(xué)的跨領(lǐng)域使用。應(yīng)該認(rèn)識到，生物醫(yī)學(xué)迅猛發(fā)展的今天，多學(xué)科、多領(lǐng)域的交流與合作是解決病因病理，治療疑難疾病的重要里程，因此，血液做為臨床輔助檢查的重要目標(biāo)，應(yīng)該通過多種渠道和實(shí)驗(yàn)學(xué)方法，深入發(fā)現(xiàn)及挖掘其自身的價(jià)值和潛力，不放過一絲蛛絲馬跡，使其為臨床提供盡可能多而有價(jià)值的參考數(shù)據(jù)。

本研究將液基薄層制片技術(shù)和血液形態(tài)學(xué)結(jié)合起來，創(chuàng)建了一種可用于免疫組化的檢測外周學(xué)淋巴細(xì)胞形態(tài)的新方法，該方法將對淋巴系統(tǒng)疾病的血液學(xué)檢查創(chuàng)立了新的思路，而且可以應(yīng)用免疫組化對淋巴瘤亞型進(jìn)行進(jìn)一步分類，對淋巴細(xì)胞亞群的研究有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，因其取材簡便，制備技術(shù)簡單，可為臨床判斷淋巴瘤預(yù)后、監(jiān)測化療指標(biāo)提供新的方法。

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（收稿日期：2015-03-11 本文編輯：程 銘）