羊肚菌子實體組織細胞的低溫凍存與復(fù)蘇萌發(fā)現(xiàn)象的初步觀察

馬斐越，王清爽，周繁樹，張曉，王一東

（長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

羊肚菌（Morchella）是一種以美味、富含營養(yǎng)物質(zhì)而著稱于世的珍稀食用菌，屬于子囊菌亞門（Ascomycotina）、盤菌綱（Discomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella），具有很高的經(jīng)濟價值［1-2］。由于人們對于羊肚菌的生活史還不完全了解，目前的人工仿生栽培還存在較大的技術(shù)風險。所以對包括羊肚菌子實體組織細胞菌絲在內(nèi)的羊肚菌各發(fā)育階段菌絲的發(fā)生機制、發(fā)育規(guī)律等羊肚菌生活史相關(guān)的基礎(chǔ)研究就顯得尤為必要［3-6］。通過對采集的野生新鮮羊肚菌子實體進行無菌及破碎處理后，對組織細胞超低溫冷凍保存，利用冷凍細胞復(fù)蘇原理及有限稀釋法，對復(fù)蘇的羊肚菌組織細胞進行復(fù)蘇后在細胞培養(yǎng)板孔內(nèi)4℃下培養(yǎng)，倒置顯微鏡，其下觀察細胞培養(yǎng)孔內(nèi)組織細胞萌發(fā)情況，對非孢子萌發(fā)的、無污染的、具有典型羊肚菌菌絲形態(tài)的組織細胞萌發(fā)菌絲進行擴大培養(yǎng)，對培養(yǎng)物進行ELISA方法及18 s保守序列測序鑒定［7-11］，進而確定得到的子實體組織細胞萌發(fā)并分離的菌絲（菌種）為羊肚菌菌絲。該研究可為羊肚菌菌絲發(fā)育機理等基礎(chǔ)研究及人工栽培實踐提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株、羊肚菌子實體

羊肚菌（Morehella esculenta）標準菌株（51589號）購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

黑木耳（Auricularia auricula）菌種（栽培種），購于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所。

野生羊肚菌子實體，于2017年5月采自于長春市凈月潭國家森林公園，處理后的子實體組織細胞現(xiàn)保存于-80℃低溫冰柜。

1.1.2 主要試劑與耗材

HRP標記山羊抗兔IgG（H+L）、HRP標記山羊抗鼠IgG（H+L）購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限責任公司；TMB，購于sigma公司；馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）；菌絲萌發(fā)液（葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、水1 000 mL，121 ℃ 20 min）；二甲基亞砜（DMSO），北化產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

抗羊肚菌單抗C6A8雜交瘤細胞株現(xiàn)保存于該實驗室-80℃冷凍冰箱內(nèi)。抗羊肚菌單克隆抗體為C6A8細胞株腹水抗體［8］。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

1736R SCANSPEED高速離心機，Lrbogene公司；XD30型倒置顯微鏡（附攝影裝置及軟件），寧波舜宇公司；HZQ-QX型恒溫振蕩培養(yǎng)箱；DW-86L626型超低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司；ELx800TM酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；96孔、24孔一次性動物細胞培養(yǎng)板，1.8 ml內(nèi)旋細胞凍存管，Corning公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 羊肚菌子實體樣本的采集與處理

羊肚菌子實體于2017年5月10日至15日采集于吉林省長春市凈月潭國家森林公園，共采集到羊肚菌標本10份，用滅菌紙包裹放入盛有冰袋的保溫盒，迅速送至實驗室，在超凈臺內(nèi)將羊肚菌子實體表面泥土等雜物去除后置于無菌平皿中，用無菌生理鹽水沖洗子實體表面2-3次并用無菌棉球吸干殘留水分。

1.2.2 羊肚菌子實體組織細胞懸液的制備與凍存

在超凈臺內(nèi)，將處理過的子實體按菌蓋、菌柄分離，放入無菌研缽中加少量無菌生理鹽水進行研磨破碎（可加入適量無菌海沙助研），取樣于100×下鏡檢研磨的組織懸液，可見大量單個小段菌絲及少量組織碎塊后終止研磨，將研磨液及生理鹽水清洗研缽液體移入15 mL離心管，400 rpm離心5 min，將上清移入新的無菌15 mL離心管，3 000 rpm離心10 min后棄上清，將沉淀用細胞凍存液（90%無菌菌絲萌發(fā)液+10%DMSO混合液）懸浮，分裝于1.8 mL凍存管，每管1 mL，標記名稱、日期。將凍存管放入壁厚1.5 cm的泡沫保溫盒中并將保溫盒用膠帶封口，將保溫盒放入-80℃冰箱中，凍存管內(nèi)的組織細胞將緩慢降溫至-80℃。

1.2.3 凍存羊肚菌子實體組織液的復(fù)蘇與菌絲細胞的分離培養(yǎng)

凍存6個月后，將上述凍存管從-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，在凍存管內(nèi)冰凍固體即將完全融化時取出至室溫下完全解凍，超凈工作臺內(nèi)將凍存管內(nèi)組織細胞液轉(zhuǎn)入15 mL無菌離心管，滴加生理鹽水至10 mL，旋緊離心管蓋，2 000 rpm離心5 min，棄上清，用生理鹽水重懸，重復(fù)兩次生理鹽水洗滌離心后將沉淀用菌絲萌發(fā)液懸浮，轉(zhuǎn)移至24孔細胞培養(yǎng)板中，倒置顯微鏡下觀察，估算組織細胞的密度。用菌絲萌發(fā)液將組織細胞懸液稀釋至約10個/mL的終濃度，滴加96孔培養(yǎng)板，每孔2滴（約100 μL）。

1.2.4 4℃菌絲培養(yǎng)觀察與篩選及擴大培養(yǎng)

利用羊肚菌菌絲的低溫生長的特性，將細胞板邊緣封口后放入4℃冰箱避光培養(yǎng)。每日鏡檢，觀察孔內(nèi)菌絲生長情況并拍照記錄，觀察是否有雜菌生長。應(yīng)注意觀察盡量快速，防止室溫高（20℃）菌絲萌發(fā)生長過快對觀察的不利影響。

在大量觀察及比對分析后，選取96孔板內(nèi)非孢子萌發(fā)、無雜菌、符合羊肚菌菌絲形態(tài)的培養(yǎng)孔內(nèi)萌發(fā)生長的菌絲，吸取并移至PDA固體培養(yǎng)基上，室溫條件下避光培養(yǎng)。菌落萌發(fā)后，無菌挑取疑似羊肚菌菌落接種至PDB液體培養(yǎng)基，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中20℃，轉(zhuǎn)速110 rpm搖瓶培養(yǎng)。

1.2.5 分離菌絲的ELISA間接法鑒定

利用該實驗室的便利條件［12］，對分離并擴大培養(yǎng)的菌絲進行ELISA間接法檢測。

1.2.6 分離菌絲的分子生物學(xué)鑒定

將分離并擴大培養(yǎng)得到的球狀菌絲培養(yǎng)物送測序技術(shù)公司（華大公司）進行18 s基因測序比對，鑒定菌絲種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌子實體組織細胞菌絲萌發(fā)觀察結(jié)果

分別于2017年11月，2018年1月、3-5月，對2017年5月凍存的羊肚菌子實體組織細胞進行了五個批次復(fù)蘇，復(fù)蘇情況重復(fù)性良好。通過跟蹤觀察及比對拍攝的大量照片，凍存后子實體組織細胞復(fù)蘇萌發(fā)過程中可觀察到幾種現(xiàn)象：（1）與菌蓋組織細胞相比，絲狀菌柄細胞不易萌發(fā)；（2）4℃條件下培養(yǎng)5天左右，部分組織團塊開始有菌絲萌發(fā)，20天左右在培養(yǎng)孔內(nèi)形成肉眼可見的白色疑似羊肚菌菌絲團；（3）4℃條件下子囊孢子不易萌發(fā)；（4）在觀察孔各培養(yǎng)菌絲生長過程中，10天左右在部分孔內(nèi)觀察到與羊肚菌菌絲形態(tài)不同的雜菌。

（1）菌柄組織分離結(jié)果

圖1為觀察低倍稀釋（24孔培養(yǎng)板）的菌柄組織細胞，可以看出經(jīng)過20天的培養(yǎng)沒有出現(xiàn)萌發(fā)的菌絲，懷疑這可能與菌柄組織特殊的細胞結(jié)構(gòu)有關(guān)，菌柄中含有大量的膨大狀菌絲，膨大菌絲沒有利用孢子萌發(fā)液的營養(yǎng)而萌發(fā)生長。

圖1 4℃條件下接種在24孔細胞培養(yǎng)板20 d羊肚菌子實體菌柄組織細胞情況

（2）羊肚菌菌蓋組織細胞萌發(fā)、生長情況

由圖2可看出，該菌絲明顯是從一個羊肚菌組織塊細胞團中萌發(fā)生長的，組織細胞團中未見明顯的孢子囊及孢子；萌發(fā)菌絲由薄而透明的管狀壁構(gòu)成，內(nèi)含許多內(nèi)容物，菌絲直徑約8 μm，是呈竹節(jié)狀的有隔菌絲，菌絲有分枝，并且能夠相互融合形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，將該菌絲擴大培養(yǎng)的菌落編號為M10H3。

由圖3可看出，羊肚菌子囊呈長圓柱形，無色透明，子囊內(nèi)有有子囊孢子，單行排列，子囊孢子橢圓形，近無色，圖中箭頭所示的萌發(fā)菌絲是從貼近子囊結(jié)構(gòu)的組織細胞萌發(fā)而不是孢子萌發(fā)，萌發(fā)的菌絲在萌發(fā)初期沒有出現(xiàn)分支現(xiàn)象，其形態(tài)與圖3所示菌絲基本一致。將該菌絲擴大培養(yǎng)的菌落編號為M10H4。在圖3中可以比較明顯的觀察出子囊及子囊孢子，可以觀察到孢子沒有萌發(fā)，分析與比對實驗可以確定這種現(xiàn)象與4℃條件下培養(yǎng)有關(guān)。

圖2 4℃條件下羊肚菌子實體同一組織細胞團不同萌發(fā)時間下菌絲萌發(fā)生長過程

圖3 孢子囊結(jié)構(gòu)處萌發(fā)的菌絲生長的過程

在培養(yǎng)過程中還觀察到一些培養(yǎng)孔中菌絲形態(tài)特征與羊肚菌菌絲完全不同的雜菌，部分雜菌培養(yǎng)后期在培養(yǎng)孔內(nèi)形成青色菌絲團，疑似霉菌污染，對疑似雜菌污染的培養(yǎng)孔標記并廢棄。

2.2 分離菌絲擴大培養(yǎng)結(jié)果

將編號M10H3、M10H4的菌絲接種PDA培養(yǎng)基后，分別于3 d、5 d后形成菌落。菌絲生長初期呈乳白色，貼在培養(yǎng)基表面呈圓形生長，有光澤，尖端分泌無色露珠，生長至菌落半徑約1 cm時出現(xiàn)氣生菌絲，氣生菌絲生長初期呈乳白色。隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲顏色逐漸向棕紅色轉(zhuǎn)變，由于色素沉積，培養(yǎng)基顏色也逐漸加深向棕黃色轉(zhuǎn)變。隨著培養(yǎng)時間的增加出現(xiàn)菌核，菌核初期為分散的點狀白色小菌核，隨后變成淡黃色，后期變?yōu)楹稚Ｅc文獻記載［11］的羊肚菌菌落特征相符。

挑取上述菌絲接種PDB液體培養(yǎng)基，置搖床培養(yǎng)，3 d后形成菌絲球，初期為乳白色，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液逐漸變得澄清透明，菌絲球體積增大，顏色變淡棕褐色。

2.3 ELISA間接法鑒定分離菌株

以P/N≥2.1判定為陽性，檢測結(jié)果見表1。1孔為編號M10H3菌絲液樣本、2孔為編號M10H4菌絲液樣本、3孔為羊肚菌標準菌株51589菌絲液陽性樣本、4孔為木耳菌絲液陰性樣本、5孔為包被緩沖液（空白對照）。進行多次檢測，每次檢測有4組平行試驗。

表1 ELISA間接法檢測分離菌株結(jié)果

由表1可以看出，以標準羊肚菌抗原（51589號）為陽性對照，木耳為陰性對照，包被緩沖液為試劑空白，進行了多次的ELISA間接法檢測。結(jié)果顯示M10H3、M10H4均表現(xiàn)為陽性，確定為羊肚菌菌絲。

2.4 分離菌種的測序鑒定

分離并經(jīng)擴大培養(yǎng)的菌絲樣本，送基因測序公司經(jīng)過對樣本的18S保守序列的測序及比對，給出的鑒定結(jié)果為：樣品與morchella sp.親緣關(guān)系最近?？梢源_定分離得到的菌絲為羊肚菌菌絲。

3 結(jié)論

（1）該研究對-80℃低溫保存6個月以上的新鮮羊肚菌子實體組織細胞，分別進行了5個批次的凍存的羊肚菌組織細胞的復(fù)蘇，所有批次的復(fù)蘇效果良好。說明該方法可以較長時間的保存羊肚菌組織細胞并可以隨時進行菌絲萌發(fā)與分離。這為羊肚菌子實體組織細胞及其他不同發(fā)育階段的菌絲細胞等實驗材料的保存提供了借鑒，為羊肚菌生活史的基礎(chǔ)研究帶來便利。

（2）包括羊肚菌在內(nèi)的食用菌栽培實踐中，子實體的菌種分離具有不可替代的重要作用。目前廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)的組織塊平板分離實體菌種菌絲方法，存在著無法確定分離得到的萌發(fā)菌絲是由組織細胞萌發(fā)（次級菌絲）還是孢子萌發(fā)（初級菌絲）亦或是多種組織細胞與孢子萌發(fā)的混合物的缺陷，而本研究介紹的羊肚菌子實體組織細胞菌種分離方法具有可以便捷的實時觀察到組織細胞萌發(fā)與生長情況、菌絲細胞來源明確的特點，避免了傳統(tǒng)方法的缺陷。該方法可為羊肚菌子實體組織細胞萌發(fā)菌絲的確定提供直接便捷的方法參考。

（3）羊肚菌子實體存在著多種形態(tài)的細胞組織，該研究觀察到的（如圖4）子囊結(jié)構(gòu)附近的組織細胞萌發(fā)菌絲與之前觀察到的孢子萌發(fā)的菌絲（初級菌絲）在形態(tài)上基本沒有差異，這是否存在著子實體組織結(jié)構(gòu)細胞萌發(fā)菌絲后，其萌發(fā)的菌絲由于其環(huán)境及營養(yǎng)方式的改變而使萌發(fā)的菌絲（分離的菌絲）生理結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生了改變，如從羊肚菌生活史中高分化的產(chǎn)囊絲或是側(cè)絲（擬側(cè)絲）再轉(zhuǎn)變?yōu)闋I養(yǎng)菌絲，如同自然界中經(jīng)歷了冬季低溫后復(fù)蘇的菌絲或是潛在的出菇點沒有出菇的生殖菌絲轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)生長的菌絲等問題還有待于進一步的研究與分析。