雞白痢與雞傷寒沙門菌雙重PCR方法的建立和初步應(yīng)用

朱春紅，陶志云，劉宏祥，徐文娟，章雙杰，李 非，唐燕飛，蔣蓮華

(1.江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125；2.廣西富鳳集團(tuán)農(nóng)牧有限公司，廣西 南寧 530000)

沙門菌是一種常見的人獸共患病病原，部分血清型沙門菌在家禽生產(chǎn)過(guò)程中的感染和污染嚴(yán)重影響家禽生產(chǎn)效率，危害養(yǎng)禽業(yè)[1-3]。雞傷寒沙門菌的兩種不同的生物型-雞白痢沙門菌(Salmonellapullorum)和雞傷寒沙門菌(Salmonellagallinarum) (簡(jiǎn)述雞白痢和雞傷寒沙門菌),分別引起雞白痢(Pullorum disease) 和雞傷寒(Fowl typhoid)，都是雞的重要致病菌。一般情況下,雞白痢沙門菌多侵害20日齡以內(nèi)幼雛,引起白色下痢,病死率極高,在成年雞僅有零星死亡,但可成為無(wú)癥狀帶菌者,帶菌母雞經(jīng)卵巢垂直傳播。而雞傷寒沙門菌對(duì)雛雞、成年雞均可致病,常引起貧血、白細(xì)胞增多、出血為特征的急性膿毒敗血癥,死亡率可高達(dá)10%[5-6]。在美國(guó)和歐美國(guó)家，通過(guò)嚴(yán)格的凈化措施，基本控制雞白痢與雞傷寒對(duì)家禽生產(chǎn)的影響，而與西方發(fā)達(dá)國(guó)家的情況明顯不同的是，在我國(guó)以及眾多發(fā)展中國(guó)家的雞群中還普遍存在雞白痢與雞傷寒，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。

國(guó)務(wù)院頒布的《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》提出，2015年全國(guó)祖代以上種雞場(chǎng)的雞白痢沙門菌病達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)，2020年全國(guó)所有種雞場(chǎng)的雞白痢沙門菌病達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)。但目前我國(guó)部分育種場(chǎng)，曾祖代、祖代種雞場(chǎng)雞白痢抗體檢測(cè)結(jié)果很不理想，祖代種雞場(chǎng)仍然有部分雞出現(xiàn)雞白痢抗體陽(yáng)性，建立新的快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法有望加速此進(jìn)程。雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌具有相同的菌體抗原，常用的血清學(xué)方法不能區(qū)分兩者。對(duì)兩者的區(qū)分主要依據(jù)生化特性的差異，他們對(duì)麥芽糖、衛(wèi)矛醇、鳥氨酸等的發(fā)酵模式不同，但上述方法存在許多不足之處，耗時(shí)，重復(fù)性差。本試驗(yàn)中建立的快速PCR鑒定方法，能快速準(zhǔn)確鑒定同一血清型不同生物型沙門菌，在普通實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)上即可以實(shí)施。

1 材料與方法

1.1 菌株 本試驗(yàn)所用雞傷寒沙門菌-生物型雞白痢沙門菌CMCC50771標(biāo)準(zhǔn)株、生物型雞傷寒沙門菌CMCC50770標(biāo)準(zhǔn)株,購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所;大腸桿菌菌株以及56株不同血清型沙門菌，其中雞傷寒沙門菌4株，雞白痢沙門菌33株，奧爾巴尼沙門菌6株，山夫頓堡沙門菌3株，倫敦沙門菌1株，嬰兒沙門菌2株，鴨沙門菌1株，田納西沙門菌3株，火雞沙門菌3株為江蘇省家禽科學(xué)研究所菌種庫(kù)保存。

1.2 主要試劑與儀器 2×TaqPlus PCR Master Mix試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;dNTP、DNA Marker DL-2 000,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)產(chǎn)品。PCR儀(Thermo Fisher 公司);MP120-2電子秤(上?？蠌?qiáng)儀器有限公司);DYY-604型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(南京新校園生物技術(shù)研究所)。

1.3 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank已公布的雞白痢和雞傷寒沙門菌全基因組序列，以及數(shù)據(jù)庫(kù)中其他不同血清型沙門菌全基因組序列，序列分析比對(duì)，篩選雞白痢和雞傷寒沙門菌血清型特異性基因片段，并根據(jù)所獲得的基因片段利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，特異性引物信息如下：引物1-Up: 5′-TCG TTT ACG GCA TTA CAC AAG TA-3′；引物1-Lo:5′-CAA ACC CAG AGC CAA TCT TAT CT-3′；引物2-Up: 5′-TGT CGA CTG GGA CCC GCC CGC CCG C-3′；引物2-Lo:5′-CCA TCT TGT AGC GCA CCA T-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根據(jù)序列分析結(jié)果，引物1和引物2的產(chǎn)物片段大小分別為417 bp和636 bp。

1.4 PCR模板的制備 采用煮沸裂解法[7]制備模板。從固體平板上挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基，37 ℃ 搖床培養(yǎng)過(guò)夜；次日取1 mL培養(yǎng)液，12 000 r/min 離心5 min，棄上清；用雙蒸水洗滌2次后用200 μL雙蒸水重懸，沸水浴10 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清；于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增體系與程序 10×的PCR緩沖液2.5 μL，濃度各為25 mM的dGTP、dCTP、dATP、dTTP混合物0.5 μL，濃度為2.5 U/μLTaqDNA聚合酶1.25 μL，引物混合物1 μL，于一無(wú)菌的PCR反應(yīng)薄壁管中。加入已制備好的待檢測(cè)模板1 μL，補(bǔ)水至總體積25 μL即可。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性45 s、60 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸1 min,共25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 延伸10 min后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 特異性檢測(cè) 56份已知血清型沙門菌LB過(guò)夜培養(yǎng)后，按1.4模板制備方法準(zhǔn)備PCR模板，進(jìn)行雙重PCR特異性檢測(cè)。

1.7 臨床樣本檢測(cè) 采集養(yǎng)殖場(chǎng)疑似雞白痢與雞傷寒沙門菌活禽棉拭子20份，將棉拭子接種于無(wú)菌的增菌培養(yǎng)基(亞硒酸鹽胱氨酸增菌液)37 ℃ 培養(yǎng)12 h。將渾濁培養(yǎng)液按1.4方法進(jìn)行PCR模板制備，隨后進(jìn)行雙重PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 雞白痢或者雞傷寒菌株經(jīng)雙重PCR后均顯示417 bp條帶，其中雞白痢沙門菌菌株僅顯示417 bp條帶，而雞傷寒沙門菌菌株經(jīng)雙重PCR結(jié)果后有2個(gè)條帶顯示，分別為417 bp，636 bp。上述試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期序列分析結(jié)果相符，如圖1所示。

圖1 雞傷寒和雞白痢沙門菌雙重PCR檢測(cè)結(jié)果

M：Marker,DL-2 000；1：雞傷寒沙門菌；2：雞白痢沙門菌；3：陰性對(duì)照(大腸桿菌)

2.2 特異性檢測(cè) 本試驗(yàn)中建立的雙重PCR檢測(cè)方法能檢測(cè)出56株不同血清型沙門菌中的4株雞傷寒沙門菌和33株雞白雞沙門菌，以其他血清型沙門菌為模板時(shí)，雙重PCR檢測(cè)結(jié)果顯示為陰性，這一結(jié)果說(shuō)明本試驗(yàn)中建立的雙重PCR方法能準(zhǔn)確檢測(cè)出雞白痢與雞傷寒菌菌株，與其他血清型沙門菌具有較好的區(qū)分。

2.3 臨床樣本檢測(cè) 如圖2所示，20份樣品中，共有9份為陽(yáng)性，其中含有雞白痢沙門菌8份(泳道1、3、7、8、11、14、17和18)，雞傷寒沙門菌1份(泳道5)。說(shuō)明本試驗(yàn)建立的方法可以很好的利用于臨床樣本的檢測(cè)。

圖2 臨床樣本雙重PCR檢測(cè)結(jié)果

1～20：不同臨床樣本；M：DL-2 000

3 討論

PCR技術(shù)是一種體外酶促擴(kuò)增DNA技術(shù)，具有速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)。運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)沙門菌，其特異性主要取決于所擴(kuò)增的靶序列是否是沙門菌高度保守的特異性片段以及引物的設(shè)計(jì)[8]。

為了增加對(duì)雞白痢沙門菌檢測(cè)的特異性，研究者建立了許多基于基因水平檢測(cè)的方法[9]，如PCR-RFLP，這種方法需要進(jìn)行2個(gè)步驟才能達(dá)到檢測(cè)的目的，即PCR和RFLP[10]；目前已有針對(duì)雞傷寒沙門菌檢測(cè)的等位基因特異性PCR方法，但該方法不能特異性地鑒定雞傷寒沙門菌不同生物型—雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌，本試驗(yàn)在分析不同血清型沙門菌全基因組序列的基礎(chǔ)上，篩選出雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌特異性基因序列，并以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立起雙重PCR方法鑒定雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌。

對(duì)已經(jīng)過(guò)血清學(xué)鑒定的56株不同血清型沙門菌進(jìn)行上述雙重PCR特異性檢驗(yàn)，本試驗(yàn)結(jié)果和細(xì)菌學(xué)結(jié)果完全一致，能將56株不同血清型沙門菌中3株雞傷寒沙門菌和33株雞白痢沙門菌菌株準(zhǔn)確區(qū)分出來(lái)，這一結(jié)果表明，試驗(yàn)建立的雙重PCR方法特異性較好。進(jìn)一步將上述已經(jīng)建立的雙重PCR方法應(yīng)用于臨床樣本檢測(cè)，對(duì)臨床20份可疑樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，8份雞白痢沙門菌陽(yáng)性和1份雞傷寒沙門菌陽(yáng)性檢出，這說(shuō)明，這一方法可以應(yīng)用于有簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)室配置的生產(chǎn)企業(yè)。