青海西寧牦牛病毒性腹瀉疫病病原學(xué)調(diào)查與分析

楊秀玲,李志強(qiáng),羅永珍,蘆光花

(1.青海省湟源縣城關(guān)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，青海 湟源 812199；2.青海省湟中縣上五莊鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，青海 湟中 811600；3.青海省湟源縣東峽鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，青海 湟源 812100；4.青海省湟中縣畜牧獸醫(yī)站，青海 湟中 811600)

牦牛為我國(guó)特有珍稀牛種之一，分布于青藏高原，是我國(guó)藏族人民衣食住行燒耕的主要來源，近年來隨著我國(guó)對(duì)特種動(dòng)物養(yǎng)殖扶持政策的不斷完善，各種補(bǔ)助的不斷提高，牦牛的規(guī)模化舍飼養(yǎng)殖得到了快速與盲目發(fā)展，但由于舍飼養(yǎng)殖導(dǎo)致了牦牛生活習(xí)性的改變，致使牦牛腹瀉性疫病增多，影響了牦牛產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。引起牦牛腹瀉的原因較多，主要包括營(yíng)養(yǎng)性腹瀉、細(xì)菌感染、病毒感染以及寄生蟲感染等，其中以病毒性腹瀉的危害最為嚴(yán)重。而引起牦牛病毒性腹瀉的致病原主要有牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛腸道病毒(BEV)、牛冠狀病毒(BCV)和牛星狀病毒(BAstV)[1-5]。為全面掌握青海省西寧市牦牛群中病毒性腹瀉各種致病原的感染現(xiàn)狀，本試驗(yàn)采用RT-PCR方法首次對(duì)2017年采集于西寧市下屬6各縣的74份具有腹瀉癥狀的牦牛糞便樣品進(jìn)行了BVDV、BRV、BEV、BCV和BAstV的核酸檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了單獨(dú)感染與混合感染的統(tǒng)計(jì)與分析，為西寧市牦牛腹瀉性疫病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2017年共采集青海省西寧市城東區(qū)、城西區(qū)、城北區(qū)、湟源縣、湟中縣、大通縣等部分地區(qū)牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)和散養(yǎng)戶中具有明顯腹瀉癥狀的牦牛新鮮糞便樣品共計(jì)74份。

1.2 主要試劑與試劑盒 病毒基因組RNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒、DL-2 000 DNA Marker，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 檢測(cè)樣品的處理 將采集的新鮮糞便樣品加入3倍體積滅菌生理鹽水中，碾磨、反復(fù)凍融3次，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液即得處理后的檢測(cè)樣品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品基因組RNA的提取 利用病毒基因組RNA提取試劑盒分別提取74份腹瀉牦牛檢測(cè)樣品的病毒基因組RNA。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成 分別根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]、[6]、[7]設(shè)計(jì),針對(duì)BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的特異性檢測(cè)引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。

表1 引物信息

1.6 RT-PCR擴(kuò)增 以提取的74份牦牛腹瀉樣品的基因組RNA為模板，分別利用合成的BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV特異性檢測(cè)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增(RT-PCR擴(kuò)增信息見表2)，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。

表2 RT-PCR擴(kuò)增信息

1.7 感染情況統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)74份牦牛腹瀉樣品的BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析5種致病原的單獨(dú)感染與混合感染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 采用RT-PCR方法分別對(duì)西寧市下屬6個(gè)縣市的74份腹瀉牦牛樣品進(jìn)行了BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的病原學(xué)檢測(cè)，結(jié)果如表3所示，共檢測(cè)出BVDV陽(yáng)性樣品28份(部分樣品電泳圖如圖1所示)，平均陽(yáng)性率為37.84%，6個(gè)縣市均存在BVDV感染，以湟源縣的陽(yáng)性感染率最高，達(dá)47.62%。共檢測(cè)出BRV陽(yáng)性樣品20份(部分樣品電泳圖如圖2所示)，平均陽(yáng)性率為27.03%，除城西區(qū)以外的5個(gè)縣市均存在BRV感染，以湟源縣的陽(yáng)性感染率最高，達(dá)38.10%。共檢測(cè)出BEV陽(yáng)性樣品17份(部分樣品電泳圖如圖3所示)，平均陽(yáng)性率為22.97%，6個(gè)縣市均存在BEV感染，以湟源縣的陽(yáng)性感染率最高，達(dá)28.57%。共檢測(cè)出BCV陽(yáng)性樣品4份(部分樣品電泳圖如圖4所示)，平均陽(yáng)性率為5.41%，感染區(qū)域主要集中在湟源縣、湟中縣、大通縣，以湟源縣的陽(yáng)性感染率最高，達(dá)9.52%。共檢測(cè)出BAstV陽(yáng)性樣品2份(部分樣品電泳圖如圖5所示)，平均陽(yáng)性率為2.70%，感染區(qū)域主要集中在湟源縣和湟中縣，感染率分別為4.76%和6.25%。該結(jié)果表明，西寧市大部分地區(qū)均存在BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的流行，其中以湟源縣的流行最為嚴(yán)重。而引起西寧市牦牛病毒性腹瀉的主要致病原為BVDV、BRV、BEV，其中以BVDV的感染最為嚴(yán)重。

表3 不同地區(qū)的檢測(cè)結(jié)果

圖1 部分樣品BVDV RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

M ： DL-2 000 DNA Marker；2、3、5、7 ：陽(yáng)性樣品；1、4、6、8：陰性樣品

圖2 部分樣品BRV RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

M ： DL-2 000 DNA Marker；2、3、6 ： 陽(yáng)性樣品；1、4、5、7：陰性樣品

圖3 部分樣品BEV RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：DL-2 000 DNA Marker；2、3、5、7：陽(yáng)性樣品；1、4、6、8：陰性樣品

圖4 部分樣品BCV RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

M:DL-2 000 DNA Marker；1、2:陽(yáng)性樣品； 3、4、5、6:陰性樣品

圖5 部分樣品BAstV RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

M:DL-2 000 DNA Marker；2:陽(yáng)性樣品； 1、3、4、5、6、7:陰性樣品

2.2 單獨(dú)感染與混合感染的統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)74份牦牛腹瀉樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV 5種致病原單獨(dú)感染與混合感染的統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果如表4所示，在單獨(dú)感染方面，共存在BVDV、BRV、BEV、BAstV 4種致病原的單獨(dú)感染，其中以BVDV的單獨(dú)感染率最高，達(dá)16.22%。在混合感染方面，共存在BVDV/BRV、BVDV/BEV、BVDV/BCV、BRV/BEV、BRV/BCV、BVDV/BRV/BEV、BVDV/BRV/BCV 7種混感型，其中以BVDV/BEV和BVDV/BRV的混合感染較嚴(yán)重，混感率分別達(dá)8.11%和6.76%。該結(jié)果表明，引起西寧市牦牛病毒性腹瀉的原因主要有BVDV、BRV、BEV、BAstV 4種致病原的單獨(dú)感染以及BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV 5種致病原的混合感染，且混合感染型較多，混合感染情況較復(fù)雜、較嚴(yán)重。

表4 單獨(dú)感染與混合感染的統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

近年來，隨著牦牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，牦牛病毒性腹瀉疾病的發(fā)生率也逐漸增多，逐步引起我國(guó)研究學(xué)者的重視，開展了大量的牦牛病毒性腹瀉疾病相關(guān)致病原的流行病學(xué)調(diào)查。陳新諾等[8]采用RT-PCR方法對(duì)四川和西藏部分高原地區(qū)采集的149份臨床腹瀉牦牛糞便樣品進(jìn)行了BVDV的檢測(cè)，BVDV陽(yáng)性檢出率為19.46%，其中西藏地區(qū)牦牛BVDV陽(yáng)性檢出率為27.14%，四川地區(qū)牦牛BVDV陽(yáng)性檢出率為12.66%。陳新諾等[9]應(yīng)用RT-PCR對(duì)青藏高原地區(qū)(西藏、青海、四川和云南)共計(jì)222份出現(xiàn)腹瀉癥狀的牦牛糞便樣品進(jìn)行了BVDV和BEV的病原學(xué)檢測(cè)，BVDV陽(yáng)性檢出率為20%，BEV陽(yáng)性檢出率為29.4%，BVDV/BEV混合感染陽(yáng)性率為4.8%。柳清[10]采用ELISA試劑盒對(duì)青海省6個(gè)規(guī)模牦牛飼養(yǎng)場(chǎng)和11戶散養(yǎng)戶的559份血清樣品進(jìn)行了BVDV抗體檢測(cè)，BVDV平均陽(yáng)性率為36.14%，規(guī)模牦牛場(chǎng)平均陽(yáng)性率為34.19%，散養(yǎng)戶平均陽(yáng)性率為39.42%。戴源森等[11]采用ELISA抗體檢測(cè)法和RT-PCR抗原檢測(cè)法對(duì)青海省海北州門源縣及周邊縣的712份牦牛血清樣品進(jìn)行了BVDV抗體與抗原的檢測(cè)，BVDV抗體平均陽(yáng)性率為21.21%，BVDV抗原平均陽(yáng)性率為22.19%。權(quán)英存等[12]采用RT-PCR方法對(duì)青海省部分地區(qū)的32份具有腹瀉癥狀的臨床病料進(jìn)行了BVDV、BRV、BCV的核酸檢測(cè)與分析，BVDV、BRV、BCV的陽(yáng)性率分別為65.63%、18.75%、34.38%。為豐富西寧市牦牛病毒性腹瀉疾病致病原的流行病學(xué)資料，本試驗(yàn)于2017年在西寧市境內(nèi)共采集了牦牛規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)和散養(yǎng)戶的腹瀉牦牛樣品74份，采用RT-PCR方法分別對(duì)其進(jìn)行了BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV 5種致病原的病原學(xué)檢測(cè)與分析，結(jié)果顯示，BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV平均陽(yáng)性感染率分別為37.84%、27.03%、22.97%、5.41%、2.70%，表明西寧市大部分地區(qū)均存在BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的流行，以BVDV、BRV、BEV的感染較為嚴(yán)重，其中本試驗(yàn)中西寧市腹瀉牦牛BVDV感染率略高于陳新諾等[8-9]調(diào)查的四川和西藏、青海和云南地區(qū)以及戴源森等[11]調(diào)查的青海省海北州門源縣，略低于權(quán)英存等[12]調(diào)查的青海省部分地區(qū)。同時(shí)本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)西寧市腹瀉牦牛群中存在多種致病原的混合感染，且混合感染型較多，混合感染情況較復(fù)雜、較嚴(yán)重，混合感染不但增加了疫病的診斷難度，同時(shí)對(duì)牛群造成的危害和經(jīng)濟(jì)損失更加嚴(yán)重，應(yīng)加強(qiáng)重視。筆者呼吁加強(qiáng)對(duì)牦牛病毒性腹瀉疫病的重視，加強(qiáng)對(duì)致病原的監(jiān)測(cè)，對(duì)感染牦牛應(yīng)及早淘汰和無害化處理，逐步建立和維護(hù)無病牛群，保障青海牦牛養(yǎng)殖業(yè)的快速與健康發(fā)展。