1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸在惡臭假單胞菌趨化雙孢蘑菇菌絲中的作用

張朝輝，張 廣，聞亞美，楊艷青，劉亞非，張 會(huì)，王振河，邱立友

(1.河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003; 2.現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003; 3.周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 周口 466000; 4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

在自然界的各個(gè)小生境存在著多種真菌-細(xì)菌相互作用形成的真菌-細(xì)菌生物膜(Fungal-bacterial biofilm，F(xiàn)BB)，其共同進(jìn)化，發(fā)揮的作用超過任一單個(gè)成員，這些作用主要涉及動(dòng)植物健康和發(fā)育、生物地球化學(xué)循環(huán)、生物技術(shù)和食品生產(chǎn)等[1]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域則主要用于制備高效生物肥料接種劑、生防制劑等[2]。然而，制備FBB制劑耗時(shí)長，難以大規(guī)模生產(chǎn)。因此，非常有必要探討FBB的形成機(jī)理。

真菌與細(xì)菌相互作用形成FBB包括2個(gè)步驟，即細(xì)菌通過趨化菌絲分泌物運(yùn)動(dòng)接近菌絲或到達(dá)絲際(Mycosphere)，以及細(xì)菌和菌絲物理接觸或附著[3-4]。生防菌熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)可在病原真菌尖刀鐮孢菌(Fusariumoxysporum)菌絲表面定殖形成生物膜，并且該菌株對(duì)培養(yǎng)過尖刀鐮孢菌的培養(yǎng)基、尖刀鐮孢菌的次生代謝產(chǎn)物鐮刀菌酸有趨化響應(yīng)，細(xì)菌的趨化強(qiáng)度與鐮刀菌酸濃度呈顯著正相關(guān)。然而，該細(xì)菌的趨化缺失突變株在菌絲表面的定殖量顯著降低，并且對(duì)培養(yǎng)過尖刀鐮孢菌的培養(yǎng)基和鐮刀菌酸無趨化響應(yīng)。這些研究表明細(xì)菌在真菌菌絲表面的定殖與趨化有關(guān)，鐮刀菌酸可能是細(xì)菌趨化菌絲的強(qiáng)趨化物[5]。草酸是大多數(shù)真菌的主要菌絲分泌物。真菌宿主分泌的草酸是食真菌的土壤細(xì)菌山岡單胞菌(Collimonas)及土壤中常見的FBB形成細(xì)菌土伯克霍爾德菌(Paraburkholderiaterrae)趨化真菌菌絲的強(qiáng)趨化物，然而這些細(xì)菌對(duì)草酸的代謝利用能力較差[6-7]。土壤中真菌分泌的草酸對(duì)真菌具有多種生態(tài)功能，包括作為侵染致病毒力因子、降解木質(zhì)素輔助因子及增加礦質(zhì)元素的有效性和緩解重金屬毒性等[8-9]，因此，在許多真菌菌絲表面積聚有草酸鈣結(jié)晶[7]。真菌菌絲分泌物中的其他物質(zhì)是否是生物膜形成細(xì)菌的強(qiáng)趨化物尚未見報(bào)道。闡明細(xì)菌趨化真菌菌絲的強(qiáng)趨化物將有利于加快FBB制劑的生產(chǎn)。

雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)是世界上栽培范圍最廣、規(guī)模最大和生產(chǎn)量最高的一種人工栽培食用菌，由于色白味鮮，富含多種具有保健和藥用功效的營養(yǎng)物質(zhì)，其在國際市場中一直深受消費(fèi)者喜愛[10]。同時(shí)，雙孢蘑菇也是研究富含腐殖質(zhì)的落葉層中真菌適應(yīng)、定殖和生長的模式真菌[11]。雙孢蘑菇有別于其他許多食藥用菌的特征是，當(dāng)培養(yǎng)料中的菌絲發(fā)滿后，必須在培養(yǎng)料表面覆一層土才能出菇。在雙孢蘑菇覆土中棲息著大量的細(xì)菌，優(yōu)勢(shì)菌群是惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[12-13]。與土壤中其他細(xì)菌和真菌的相互作用相似，這些細(xì)菌也在雙孢蘑菇菌絲表面形成菌膜，在雙孢蘑菇菌絲表面同樣積聚有大量的草酸鈣結(jié)晶[14-15]。所以，雙孢蘑菇-細(xì)菌生物膜是理想的FBB研究對(duì)象。然而，惡臭假單胞菌趨化雙孢蘑菇菌絲的強(qiáng)趨化物還不清楚。

前期研究發(fā)現(xiàn)，雙孢蘑菇的乙烯合成途徑與高等植物相同，都經(jīng)甲硫氨酸合成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC)，ACC進(jìn)而被氧化生成乙烯，合成途徑中的關(guān)鍵酶是ACC合成酶和ACC氧化酶[16]。雙孢蘑菇覆土出菇的機(jī)理是乙烯抑制雙孢蘑菇原基的形成，覆土中的優(yōu)勢(shì)菌群假單胞菌能夠產(chǎn)生ACC脫氨酶(ACC deaminase，AcdS)，其降解乙烯合成中間代謝物ACC生成氨和α-酮丁酸，從而降低雙孢蘑菇菌絲中乙烯的生物合成，進(jìn)而解除乙烯對(duì)雙孢蘑菇原基形成的抑制作用[17-20]。ACC是植物根際促生細(xì)菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)趨化根際的強(qiáng)趨化物，PGPR在植物根際定殖，降解ACC，可有效降低植物乙烯的合成，解除逆境條件下植物合成的乙烯對(duì)植物的抑制作用[21]。因此，推測ACC可能也是惡臭假單胞菌趨化雙孢蘑菇的強(qiáng)趨化物。為證實(shí)該假設(shè)，比較了惡臭假單胞菌UW4及其ACC脫氨酶缺失突變株UW4-AcdS-在雙孢蘑菇菌絲表面的定殖情況及對(duì)雙孢蘑菇菌絲主要分泌物的趨化特性，并對(duì)ACC引起的UW4趨化相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和定量RT-PCR分析，旨在進(jìn)一步解析ACC在假單胞菌趨化雙孢蘑菇菌絲中的作用機(jī)制，為開發(fā)新型高效生物膜肥料提供新的思路和方向。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 雙孢蘑菇AS2796購自福建省農(nóng)科院食用菌研究所；惡臭假單胞菌UW4及其ACC脫氨酶突變株UW4-AcdS-由加拿大滑鐵盧大學(xué)Glick教授惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基和緩沖液 PDA培養(yǎng)基用于AS2796的活化和培養(yǎng)[17]；TSB培養(yǎng)基用于細(xì)菌的活化和培養(yǎng)；胰蛋白胨水(TW)培養(yǎng)基(胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L)用于細(xì)菌的培養(yǎng)；甘油鹽培養(yǎng)基(甘油 5 g (單獨(dú)滅菌)，K2HPO411.2 g，KH2PO44.8 g，(NH4)2SO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，F(xiàn)e2(SO4)30.5 g，超純水 1 L)、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)基(pH值7.0 磷酸緩沖液10-1mol/L，EDTA 10-4mol/L，瓊脂糖 3 g，超純水 1 L)和細(xì)菌趨化培養(yǎng)基(pH值7.0 磷酸緩沖液10-1mol/L，EDTA 10-4mol/L，瓊脂糖 2 g，超純水 1 L)用于細(xì)菌趨化試驗(yàn)[22]。趨化緩沖液(CMB)(pH值7.0 磷酸緩沖液10-1mol/L，EDTA 10-4mol/L)參考Adler[22]和de Weert[23]的方法配制，略有改動(dòng)，主要用于細(xì)菌趨化試驗(yàn)。

1.1.3 主要試劑 ACC、檸檬酸和谷氨酰胺購自Sigma公司，氨基氧乙酸(AOA)購自阿拉丁公司。趨化試驗(yàn)所用其他試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 惡臭假單胞菌對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長速度的影響測定

將AS2796在PDA培養(yǎng)基中于25 ℃培養(yǎng)10 d，取菌絲邊緣直徑為1 cm的菌絲塊，轉(zhuǎn)接于PDA平板并添加不同濃度ACC合成酶抑制劑氨基氧乙酸(Aminooxyacetic acid，AOA)的PDA平板，培養(yǎng)6 d后，選取長勢(shì)好、菌絲直徑相同的平板用于UW4及其突變株接種試驗(yàn)。

將UW4和UW4-AcdS-分別接種于10 mL的TSB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600為1.9～2.0，取5 mL菌懸液，10 000 r/min離心1 min，再經(jīng)5 mL滅菌超純水洗滌3次后，用5 mL滅菌超純水重懸菌體，用作UW4和UW4-AcdS-促生試驗(yàn)的菌懸液。

分別取制備好的UW4和UW4-AcdS-菌懸液10 μL均勻涂布在上述培養(yǎng)6 d的雙孢蘑菇平板上，靠近菌絲邊緣涂布，涂布圈直徑大小約為1.5 cm，每個(gè)平板上涂布8個(gè)細(xì)菌圈，然后將平板置于25 ℃共培養(yǎng)，分別于共培養(yǎng)3，6，9 d時(shí)劃線測量共培養(yǎng)菌絲直徑。以涂布超純水代替菌懸液的雙孢蘑菇菌絲生長平板為對(duì)照(CK)。

1.3 惡臭假單胞菌在雙孢蘑菇菌絲表面的定殖觀察

待上述雙孢蘑菇菌絲生長覆蓋細(xì)菌涂布圈2/3時(shí)，挑取相互接合部位前端菌絲于顯微鏡下觀察菌絲與細(xì)菌的結(jié)合情況。

待上述雙孢蘑菇菌絲覆蓋細(xì)菌涂布圈時(shí)，用5 mm打孔器取菌絲前端相互接合部位的菌絲-細(xì)菌塊，經(jīng)無菌水沖洗2次(3 min/次)。然后將菌絲-細(xì)菌塊于3%的戊二醛溶液中4 ℃固定過夜后，用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次(15 min/次)，分別于30%，50%，70%，80%，90%，95%和100%的乙醇中梯度脫水，每梯度15 min，最后在乙酸異戊酯中置換15 min，經(jīng)臨界點(diǎn)干燥儀干燥并鍍膜后，使用HITACHI S3400掃描電鏡觀察。

1.4 惡臭假單胞菌對(duì)趨化物質(zhì)的趨化分析

將UW4及UW4-AcdS-接種于LB平板，于28 ℃培養(yǎng)2 d，挑單菌落接種于10 mL TW液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min過夜培養(yǎng)。取1 mL菌液離心(4 ℃、8 000 r/min、5 min)，棄上清，用1 mL無菌超純水沖洗2次后懸浮于1 mL超純水中，取200 μL接入250 mL甘油鹽液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600約1.2，于4 ℃存放用于點(diǎn)滴趨化分析、毛細(xì)管趨化分析和游動(dòng)平板分析。試驗(yàn)前用CMB緩沖液沖洗細(xì)菌并鏡檢，具有運(yùn)動(dòng)活性的細(xì)胞需大于90%。

點(diǎn)滴趨化分析：取上述250 mL菌懸液2瓶(500 mL)，離心(4 ℃、8 000 r/min、5 min)，去上清，用預(yù)冷CMB緩沖液20 mL沖洗2次后，懸浮于200 mL細(xì)菌趨化培養(yǎng)基中，混勻，分別取20 mL加入細(xì)菌趨化培養(yǎng)基平板進(jìn)行趨化分析。試驗(yàn)采用點(diǎn)滴試驗(yàn)法[24]，將10 μL濃度在500 mmol/L的趨化物質(zhì)(谷氨酰胺、檸檬酸和ACC)加入平板中央，在2～6 h內(nèi)觀察趨化現(xiàn)象。

游動(dòng)平板分析：取上述菌懸液15 mL，離心(4 ℃、8 000 r/min、5 min)，去上清，用預(yù)冷CMB緩沖液10 mL沖洗3次后，取10 μL菌懸液加入含有3 mmol/L 各種趨化物質(zhì)的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)基(20 mL)平板中央，以不加趨化物質(zhì)的運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)基作對(duì)照。測定R值，即趨化物質(zhì)的運(yùn)動(dòng)圈半徑與對(duì)照的比值。

毛細(xì)管趨化分析：參照Adler[25]報(bào)道的方法進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)趨化組與對(duì)照組(CMB)中細(xì)菌數(shù)量的比值R，若R>1，表明趨化物質(zhì)對(duì)細(xì)菌具有正向趨化效應(yīng)，反之，則具有負(fù)趨化效應(yīng)。

1.5 ACC處理的惡臭假單胞菌轉(zhuǎn)錄組測序

1.5.1 樣品制備 將UW4單菌落接入10 mL TW液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min過夜培養(yǎng)，取1 mL菌液離心(4 ℃、8 000 r/min、5 min)，用1 mL無菌超純水沖洗2次后懸浮于1 mL超純水中，取200 μL接種于250 mL甘油鹽液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600約0.16時(shí)在細(xì)菌培養(yǎng)物中加入ACC(3 mmol/L)，以UW4中加入等體積的無菌超純水為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約1.2，離心收集菌體，用于轉(zhuǎn)錄組測序。

1.5.2 RNA的提取和檢測 樣品總RNA提取采用TRIzol法[26]。提取的總RNA經(jīng)分光光度計(jì)和Agilent Bioanalyzer 2100電泳質(zhì)檢合格后，保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 cDNA文庫構(gòu)建和測序 首先從總RNA中純化mRNA，按照RNeasy Micro kit操作流程純化10 μg 總RNA，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，所得產(chǎn)物用于測序文庫構(gòu)建。按照Encore Complete Prokaryotic RNA-Seq DR Multiplex Systems對(duì)純化后的mRNA進(jìn)行第一鏈cDNA合成、第二鏈cDNA合成，并采用Covaris S2系統(tǒng)超聲打斷cDNA，使目標(biāo)DNA片段化的長度約300 bp，在End Repair Mix的作用下進(jìn)行片段化DNA的末端修復(fù)，在3′末端添加poly(A)尾之后，連接用于測序的接頭，富集cDNA，完成cDNA樣本文庫的構(gòu)建。構(gòu)建好的cDNA文庫經(jīng)Qubit?2.0 Fluorometer和FlashGel Dock系統(tǒng)質(zhì)檢合格后，使用Illumina測序平臺(tái)進(jìn)行測序(由上海伯豪生物技術(shù)公司完成)。

1.5.4 上機(jī)測序 按照cBot User Guide所示流程，使用IlluminaHiSeq 2000測序儀的cBot完成cluster生成和第一向測序引物雜交過程。按照HiSeq 2000 User Guide準(zhǔn)備測序所需試劑，將帶有cluster的flow cell上機(jī)測序。選用paired-end程序，進(jìn)行paired end 2×50 nt multiplex測序。測序整個(gè)過程由Illumina提供的data collection software進(jìn)行控制，進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)監(jiān)控分析。

1.5.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)預(yù)處理：應(yīng)用fastx(version:0.0.13)進(jìn)行clean reads處理，包括去除質(zhì)量大于20 bp所占比例小于50%的reads、去除長度小于20 bp的reads、去除儀器系統(tǒng)誤差造成的準(zhǔn)確度不高的reads、去除reads中含有的模糊的N堿基、去除3′端質(zhì)量Q低于10 bp的堿基、去除reads中的接頭序列、去除rRNA reads。應(yīng)用bowtie 2 (version: 2-2.0.5)采用局部比對(duì)預(yù)處理后的reads進(jìn)行Genome mapping，采用的基因組序列來自NCBI(Pseudomonas_putida_UW4_uid182733)，下載地址為：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Bacteria/Pseudomonas_putida_UW4_uid182733。

基因表達(dá)分析：應(yīng)用BEDTools (version:2.16.1)對(duì)bowtie 2的mapping結(jié)果進(jìn)行基因覆蓋reads定量，利用perl腳本進(jìn)行基因定量。定量標(biāo)準(zhǔn)化公式如下：

其中，RPKM為Reads per kilobase of exon model per million mapped reads，transcription reads為覆蓋整個(gè)gene exon的reads數(shù)目；transcription length為gene exon總長度；total mapped reads in run為該樣本所有mapped genome的總reads數(shù)目。

差異表達(dá)基因分析挑選條件：①P-value<0.05；② log2(RPKM fold change)≥1。

1.6 惡臭假單胞菌趨化相關(guān)基因的熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

用于qRT-PCR的UW4和UW4-AcdS-菌株的總RNA提取和cDNA樣品制備參考轉(zhuǎn)錄組測序中相應(yīng)的方法進(jìn)行，cDNA合成采用cDNA mixture(TaKaRa，大連)。按照TB GreenTMFast qPCR Mix(TaKaRa，大連)使用20 μL反應(yīng)體系，參照qRT-PCR的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增[27]。qRT-PCR引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 35 s，循環(huán)40次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，60 ℃升溫至95 ℃，20 min；95 ℃ 15 s；10 ℃ 1 min。以rpsl為內(nèi)參基因，按照2-ΔΔCT方法對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量。

表1 熒光定量PCR引物Tab.1 The primer sets used for quantative Real time PCR

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)來自至少3個(gè)獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，均使用GraphPad Prism 7計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，數(shù)值=平均值±s，方差分析使用One-way ANOVA，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 惡臭假單胞菌對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長的影響

在PDA平板培養(yǎng)6 d的雙孢蘑菇菌絲邊緣涂布UW4及UW4-AcdS-的菌懸液進(jìn)行共培養(yǎng)，比較細(xì)菌對(duì)菌絲生長的影響。在涂布菌懸液6 d和9 d時(shí)，涂布UW4菌懸液的雙孢蘑菇菌絲生長距離顯著大于涂布超純水的雙孢蘑菇菌絲對(duì)照組，其中9 d時(shí)，涂布UW4菌懸液的雙孢蘑菇菌絲生長距離與對(duì)照組相比增加了10.85%。相反，涂布UW4-AcdS-菌懸液的雙孢蘑菇菌絲生長距離則顯著小于對(duì)照組，在9 d時(shí)的生長距離為對(duì)照組的92.09%(圖1)。表明UW4對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長有促進(jìn)作用，而UW4-AcdS-對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長則有顯著的抑制作用。

2.2 惡臭假單胞菌在雙孢蘑菇菌絲表面的定殖情況

為探索UW4對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長的促進(jìn)機(jī)理，首先使用顯微鏡觀察UW4是否在雙孢蘑菇菌絲表面定殖。挑取PDA平板中與UW4共培養(yǎng)的雙孢蘑菇菌絲進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果顯示，UW4能夠在雙孢蘑菇菌絲表面形成一層具有一定厚度的菌膜(圖2)。當(dāng)在PDA中添加200 μg/mL或400 μg/mL的AOA抑制雙孢蘑菇菌絲ACC合成酶活性時(shí)，UW4在雙孢蘑菇菌絲表面定殖量減少，不能形成菌膜(圖2)。與此結(jié)果相似，當(dāng)使用UW4-AcdS-突變株時(shí)，雙孢蘑菇菌絲表面也不能形成菌膜，且菌絲表面的細(xì)菌數(shù)量也較少(圖2)。

不同小寫字母表示差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。圖5同。 Different small letters indicate significant differences at P<0.05.The same as Fig.5.

圖2 惡臭假單胞菌在雙孢蘑菇菌絲表面定殖的顯微觀察(10×100)Fig.2 The microscopic examination of the Agaricus bisporus mycelia colonized by Pseudomonas putida

為進(jìn)一步確認(rèn)UW4在雙孢蘑菇菌絲表面的定殖情況，使用電鏡對(duì)UW4在雙孢蘑菇菌絲表面的定殖情況進(jìn)行了觀察。UW4菌體在菌絲表面大量定殖形成清晰的菌膜。與此相反，UW4-AcdS-在雙孢蘑菇菌絲表面幾乎沒有定殖(圖3)。

2.3 惡臭假單胞菌UW4對(duì)幾種雙孢蘑菇菌絲分泌物的趨化反應(yīng)

雙孢蘑菇菌絲可分泌多種氨基酸，其中對(duì)惡臭假單胞菌有較強(qiáng)趨化作用的是谷氨酰胺和脯氨酸等[28]，對(duì)惡臭假單胞菌有較強(qiáng)趨化作用的有機(jī)酸有檸檬酸、琥珀酸和蘋果酸等[29]。因此，選擇了谷氨酰胺、檸檬酸和ACC作為趨化物，測定了UW4和UW4-AcdS-對(duì)這3種物質(zhì)的趨化反應(yīng)。點(diǎn)滴趨化分析和游動(dòng)平板分析結(jié)果均顯示，UW4和UW4-AcdS-均能夠趨化谷氨酰胺和檸檬酸，產(chǎn)生相似的趨化反應(yīng)，然而，UW4可對(duì)ACC產(chǎn)生趨化，而UW4-AcdS-則不趨化ACC(圖4、表2)。

圖3 惡臭假單胞菌在雙孢蘑菇菌絲表面定殖 的掃描電鏡觀察(Bar=10 μm)Fig.3 The scanning electron micrograph of the Agaricus bisporus mycelia colonized by Pseudomonas putida

圖4 惡臭假單胞菌UW4和UW4-AcdS-對(duì)ACC等物質(zhì)的趨化反應(yīng)Fig.4 The chemotactic response of Pseudomonas putida UW4 and UW4-AcdS- to ACC and other substances

表2 惡臭假單胞菌UW4和UW4-AcdS-對(duì)ACC等物質(zhì)的趨化能力分析Tab.2 Chemotactic ability of Pseudomonas putida UW4 and UW4-AcdS- to ACC and other substances

注：R值為不同處理與對(duì)照的趨化圈半徑之比。不同小寫字母表示數(shù)據(jù)之間存在顯著差異(P<0.05)。表3同。

Note: The R value is the ratio of chemotaxis radius between treatments and CK.The different letters represent the significance difference(P<0.05).The same as Tab.3.

在點(diǎn)滴趨化分析和游動(dòng)平板分析的基礎(chǔ)上，采用毛細(xì)管趨化分析法測定了ACC對(duì)UW4的趨化能力和最適趨化濃度。表3結(jié)果顯示，ACC、檸檬酸和谷氨酰胺均可以誘導(dǎo)UW4產(chǎn)生正趨化效應(yīng)。其中檸檬酸和谷氨酰胺的最適趨化濃度分別在10-5mol/L和10-3～10-5mol/L。與谷氨酰胺類似，ACC可以在各濃度下誘導(dǎo)UW4產(chǎn)生正趨化效應(yīng)，在5×10-3mol/L的濃度下，平板中的細(xì)菌數(shù)最多，達(dá)到28.4×103cfu/mL(表3)，表明ACC對(duì)UW4的最適趨化濃度在10-3mol/L左右。ACC在5×10-3mol/L時(shí)與對(duì)照相比的R值達(dá)到7.28，顯著高于檸檬酸和谷氨酰胺在各濃度下的R值。這些結(jié)果表明，與檸檬酸和谷氨酰胺類似，ACC也是誘導(dǎo)惡臭假單胞菌趨化的一種強(qiáng)趨化物。

表3 惡臭假單胞菌UW4對(duì)ACC等物質(zhì)的趨化濃度分析Tab.3 The concentration analysis of Pseudomonas putida UW4 to ACC and other substances

注：R值為趨化物處理中的細(xì)菌數(shù)與對(duì)照中細(xì)菌數(shù)之比。

Note: The R value is the ratio between the number of bacteria in chemoattractant treatments and in CK.

2.4 惡臭假單胞菌UW4對(duì)ACC產(chǎn)生趨化的差異表達(dá)基因分析

以UW4為對(duì)照組，以ACC處理的UW4為處理組，使用轉(zhuǎn)錄組測序分析方法篩選UW4對(duì)ACC產(chǎn)生趨化且與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的差異表達(dá)基因。與對(duì)照相比，UW4經(jīng)ACC處理后，篩選到5個(gè)上調(diào)趨化運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因和23個(gè)下調(diào)趨化運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因。其中，趨化信號(hào)傳導(dǎo)基因cheY家族相關(guān)基因(14051552)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而cheY家族相關(guān)基因(14051602)呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。同時(shí)，與趨化運(yùn)動(dòng)相關(guān)的鞭毛組裝基因(14055599和14054890)也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。而下調(diào)基因多為趨化信號(hào)受體蛋白(甲基趨化性受體蛋白、甲基受體趨化感應(yīng)傳導(dǎo)蛋白和趨化感應(yīng)傳導(dǎo)蛋白)等相關(guān)基因，表明這些基因可能不是ACC趨化受體(表4)。

2.5 惡臭假單胞菌UW4與趨化運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)的qRT-PCR分析

為進(jìn)一步確認(rèn)UW4中與趨化運(yùn)動(dòng)相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)情況，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，使用qRT-PCR的方法對(duì)與趨化運(yùn)動(dòng)相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。圖5結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，ACC處理的UW4中與響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(cheY)相關(guān)的cheY-R基因(14051552)的表達(dá)量顯著上調(diào)了6.90倍；鞭毛組裝相關(guān)基因flgM(14055599)的表達(dá)量與對(duì)照相比也顯著上調(diào)了6.38倍。然而，ACC處理的UW4中甲基趨化受體蛋白基因mcp1(14055832)和mcp2(14051596)的表達(dá)量分別是對(duì)照的0.29倍和0.25倍。同時(shí)，UW4-AcdS-中這些基因的表達(dá)量與對(duì)照相比都未發(fā)生明顯變化(圖5)。這些結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相符，表明ACC處理會(huì)誘導(dǎo)UW4中與趨化運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因表達(dá)量發(fā)生上升或下調(diào)變化，從而改變細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)方向。

3 結(jié)論與討論

自2003年首次通過人工培養(yǎng)得到植物根際促生細(xì)菌根瘤菌和土壤中常見絲狀真菌曲霉形成的FBB制劑以來[30]，由于FBB在固氮、溶磷、根際定殖、生防等方面表現(xiàn)出比其單一成員更優(yōu)越的特性，在生物肥料研發(fā)領(lǐng)域受到極大地重視，發(fā)展迅猛[31]。能夠形成FBB的絲狀真菌除曲霉外，還有多種，包括青霉(Penicillium)、木霉(Trichoderma)、離褶傘(Lyophyllum)、外生菌根真菌雙色蠟?zāi)?Laccariabicolor)、疫霉(Phytophthora)、腐霉(Pythium)和蕈菌中的糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)等[2, 32]。在FBB中，真菌菌絲網(wǎng)絡(luò)能夠?yàn)榧?xì)菌提供營養(yǎng)和運(yùn)動(dòng)載體[33-34]，使得細(xì)菌能夠沿著真菌菌絲高速公路進(jìn)行遠(yuǎn)距離遷移[35]，而細(xì)菌則能保護(hù)真菌免受抗真菌抗生素的作用[36-37]。另外，形成生物膜的細(xì)菌和真菌的代謝活動(dòng)與游離的細(xì)胞相比也發(fā)生了較大的變化，二者相對(duì)抗的代謝活動(dòng)減弱[38]，碳氮代謝加強(qiáng)[39]。

表4 惡臭假單胞菌UW4響應(yīng)ACC處理 的趨化運(yùn)動(dòng)相關(guān)的差異表達(dá)基因Tab.4 The differentially expressed genes related with chemotaxis and movement responding to ACC treatment in Pseudomonas putida UW4

圖5 惡臭假單胞菌UW4響應(yīng)ACC誘導(dǎo)的 趨化運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)的qRT-PCR分析Fig.5 The analysis of chemotaxis- and movement-related genes responding to ACC treatment in Pseudomonas putida UW4 by qRT-PCR

PGPR識(shí)別真菌菌絲分泌物作為趨化物，通過趨化達(dá)到絲際，是形成FBB的關(guān)鍵第一步。厘清PGPR趨化絲際的關(guān)鍵趨化物，將為高效構(gòu)建FBB提供理論依據(jù)。盡管熒光假單胞菌對(duì)尖刀鐮孢菌分泌的真菌毒素鐮刀菌酸表現(xiàn)出強(qiáng)的趨化性，然而，在鐮刀菌酸合成量很少的尖刀鐮孢菌突變株菌絲表面定殖的熒光假單胞菌的數(shù)量與其尖刀鐮孢菌親株沒有差異，表明鐮刀菌酸并不是熒光假單胞菌趨化菌絲的唯一菌絲分泌物[5]。草酸是植物根系和真菌菌絲常見的分泌物，許多PGPR能夠趨化草酸，但趨化強(qiáng)度明顯弱于蘋果酸和檸檬酸等有機(jī)酸[21]。因此，PGPR趨化真菌菌絲分泌物形成FBB的強(qiáng)趨化物不是真菌毒素和草酸。

PGPR除具有能夠在根際定殖的共同特征外，另一個(gè)重要的特征是絕大多數(shù)PGPR產(chǎn)AcdS，AcdS催化ACC裂解為氨和α-酮丁酸，使得PGPR能夠利用ACC作為碳源和氮源。已發(fā)現(xiàn)的能夠合成并分泌ACC的真菌有橘青霉(Penicilliumcitrinum)[40]和雙孢蘑菇[16]，但從許多真菌的基因組中發(fā)現(xiàn)有ACC合成酶基因，因此，合成并分泌ACC可能普遍存在于真菌中。本研究發(fā)現(xiàn)，惡臭假單胞菌UW4能夠趨化ACC，趨化強(qiáng)度超過雙孢蘑菇菌絲分泌物中的主要氨基酸和有機(jī)酸。當(dāng)使用AOA抑制雙孢蘑菇菌絲ACC合成酶活性，菌絲表面定殖的惡臭假單胞菌數(shù)量顯著減少。惡臭假單胞菌ACC脫氨酶基因突變株喪失了對(duì)ACC的趨化，其在雙孢蘑菇菌絲表面的定殖量同樣顯著減少。ACC可誘導(dǎo)惡臭假單胞菌趨化蛋白和少數(shù)趨化受體蛋白的高表達(dá)及大部分趨化受體蛋白的下調(diào)表達(dá)。因此，ACC可能是惡臭假單胞菌趨化雙孢蘑菇菌絲的強(qiáng)趨化物或關(guān)鍵趨化物。

雙孢蘑菇菌渣是良好的有機(jī)肥源[41]，其覆土中形成的豐富的FBB也將成為FBB接種劑的一個(gè)簡便高效的來源。ACC在假單胞菌趨化雙孢蘑菇菌絲中作用機(jī)制的解析將為開發(fā)新型高效生物膜肥料提供新的思路和方向。