棉花2個(gè)胚胎發(fā)育晚期富集蛋白基因的克隆與表達(dá)分析

甄軍波，劉 迪，宋世佳，劉琳琳，蔡 肖，張 曦，李海山，遲吉娜

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 棉花研究所，農(nóng)業(yè)部黃淮海半干旱區(qū)棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050051； 2.河北省農(nóng)林科學(xué)院，河北 石家莊 050051)

胚胎發(fā)育晚期富集蛋白(Late embryogenesis abundant proteins, LEA)最早在棉花中發(fā)現(xiàn)，是在棉花種子成熟后期大量積累的一類(lèi)親水蛋白，在水稻、大麥、小麥、玉米和擬南芥等植物中均有LEA家族基因的報(bào)道。根據(jù)LEA家族基因氨基酸的序列特征，可以將LEA蛋白家族分為L(zhǎng)EA1、LEA2、LEA3、LEA4、LEA5、LEA6、SMPS和dehydrins 8個(gè)亞組，每一個(gè)亞組都具有獨(dú)特的氨基酸保守區(qū)域[1]。研究表明，LEA家族基因不僅存在于植物的種子中，在幼苗、芽和根等部位也能檢測(cè)到該基因家族的存在[2-6]。同時(shí)，在細(xì)菌和無(wú)脊椎動(dòng)物中也檢測(cè)到了LEA蛋白的存在。LEA家族基因廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成和衰老等生物學(xué)過(guò)程，在高鹽、干旱等非生物脅迫下，LEA蛋白還能夠?qū)χ仓昶鸬疥P(guān)鍵的保護(hù)作用[6-7]。Wang等[8]從丹參中分離得到LEA2家族的SmLEA2基因，該基因能顯著提高轉(zhuǎn)基因丹參的耐旱性和耐鹽性。Lü等[9]從百慕大草中克隆得到了2個(gè)dehydrins亞家族基因，CdDHN4-L和CdDHN4-S，2個(gè)基因編碼的氨基酸序列相差1個(gè)φ片段，均能夠顯著提高擬南芥對(duì)于高鹽脅迫的抗性以及大腸桿菌對(duì)于高鹽和極端溫度的耐性，并且轉(zhuǎn)CdDHN4-L比轉(zhuǎn)CdDHN4-S的效果更加明顯。LEA蛋白家族在植物應(yīng)答生物脅迫中也發(fā)揮重要作用，玉米LEA3亞組成員在煙草中過(guò)表達(dá)后，提高了對(duì)假單胞致病菌的耐性[10]，在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)擬南芥LEA2和LEA4亞組成員能顯著抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[11]。

研究人員最早從棉花中發(fā)現(xiàn)LEA蛋白家族，并對(duì)LEA基因家族的序列特征和表達(dá)模式進(jìn)行了初步的研究[4, 12-14]。Luo等[15-16]從棉花中分離得到LEA4亞組的D113基因的啟動(dòng)子片段，啟動(dòng)子序列中含有與LEA蛋白特異表達(dá)相關(guān)的順式作用元件，并能夠受ABA、高鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。劉峰等[17]從棉花新陸早33中分離得到了D34基因啟動(dòng)子的同源序列，并驗(yàn)證了其表達(dá)模式。Magwanga等[6]利用公布的棉花基因組數(shù)據(jù)，分別從陸地棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉中分離得到242，136和142個(gè)LEA家族基因，并將這些家族成員分為8個(gè)亞組，大多數(shù)LEA家族成員與棉花耐旱性有關(guān)，LEA基因家族成員在耐旱材料夏威夷棉中的表達(dá)量明顯高于干旱敏感的陸地棉材料。Magwanga等[18]的研究表明，陸地棉LEA2家族成員，CotAD_20020、CotAD_21924和CotAD_59405能顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長(zhǎng)和耐旱性?？梢?jiàn)，棉花中LEA基因家族在棉花逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。本研究從棉花均一化cDNA文庫(kù)中篩選得到2個(gè)棉花LEA家族的基因，命名為GhLEA和GhLEAG1，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和非生物脅迫條件下的表達(dá)模式分析，旨在為進(jìn)一步研究棉花LEA家族基因的功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試陸地棉品種冀228為生物技術(shù)課題組保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脅迫處理方法 參照Z(yǔ)hang等[19]、甄軍波等[20-21]的方法種植冀228水培苗，并對(duì)幼苗進(jìn)行NaCl處理(150 mmol/L)、ABA(100 μmol/L)處理和17% PEG6000處理，對(duì)照和脅迫處理的根、莖和葉分別于脅迫處理后0，1，2，3，6，24 h取樣；纖維取樣：棉花開(kāi)花后8DPA、12DPA、16DPA、20DPA、24DPA、30DPA和35DPA樣品分別取樣。所有樣品均液氮速凍，用于RNA提取。

1.2.2 棉花RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 采用天根試劑盒(DP441)提取棉花RNA；采用TaKaRa (RR0037A)試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.2.3 LEA基因的克隆和序列分析 在對(duì)文庫(kù)測(cè)序結(jié)果的分析過(guò)程中，從中篩選得到59號(hào)和378號(hào)2個(gè)克隆，用ORFfinder 對(duì)59號(hào)和378號(hào)克隆包含完整的開(kāi)放閱讀框進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用BlastX進(jìn)行基因的同源性比對(duì)，用ClustalX和MEGA 4.0進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用DANMAN預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì)，NetPhos 3.1預(yù)測(cè)氨基酸序列磷酸化位點(diǎn)，SOMPA和Phyre2分別預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，MEME預(yù)測(cè)氨基酸序列的保守motif，并用TBtools繪制motif組成圖[21]。

1.2.4 棉花LEA基因表達(dá)分析 用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)LEA基因的熒光定量PCR引物(表1)，選取Histone3為內(nèi)參基因，qRT-PCR反應(yīng)參照TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說(shuō)明書(shū)：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析，采用Bio-rad熒光定量PCR儀，試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。用Bio-Rad CFX Manager(2-ΔΔCT法)和Origin 6.0分析處理試驗(yàn)結(jié)果[21]。

表1 試驗(yàn)中所用的引物Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花LEA基因的克隆和序列分析

通過(guò)對(duì)本研究室前期構(gòu)建的cDNA文庫(kù)進(jìn)行分析，59號(hào)克隆和378號(hào)克隆均包含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框。PCR擴(kuò)增2個(gè)基因的全長(zhǎng)，與cDNA文庫(kù)測(cè)序結(jié)果完全一致。在NCBI網(wǎng)站，利用BlastX程序進(jìn)行分析比對(duì)，59號(hào)克隆和378號(hào)克隆分別編碼一個(gè)棉花胚胎發(fā)育晚期富集蛋白家族基因成員，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，將其命名為GhLEA和GhLEAG1，登錄號(hào)分別為KF906314和KF906316。GhLEA全長(zhǎng)948 bp，編碼315個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)4.4，分子質(zhì)量為35 ku，GhLEAG1全長(zhǎng)756 bp，編碼251個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)10.76，分子質(zhì)量27 ku，2個(gè)基因DNA序列相似度為36.93%，氨基酸序列相似度為10.44%。

2.2 棉花GhLEA和GhLEAG1基因進(jìn)化樹(shù)及保守基序分析

選取GhLEA、GhLEAG1、SmLEA(AAU29064.3)、SmLEA2(HQ676610)和部分?jǐn)M南芥LEA家族成員構(gòu)建了氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)(圖1)，結(jié)果表明，GhLEA、SmLEA和SmLEA2同屬于LEA2家族，GhLEA和SmLEA2具有更近的親緣關(guān)系，其與At2G44060和SmLEA2的motif組成模式一致，均包含了motif1/2/6/7，motif6在LEA2家族中高度保守。GhLEAG1與擬南芥LEA3家族的成員劃分在一個(gè)亞組，但分支成員之間的motif組成不完全相同，GhLEAG1由motif3/9組成，AT3G53770和AT4G15910由motif3/10組成，GhLEA5-D、AT4G02380和AT1G02820則由motif3/8組成，可見(jiàn)motif3在LEA3家族成員中高度保守。

A.棉花GhLEA、GhLEAG1和部分?jǐn)M南芥LEA氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)分析; B.棉花GhLEA、GhLEAG1和部分?jǐn)M南芥LEA蛋白保守基序組成。 A. Phylogenetic tree analysis of GhLEA, GhLEAG1 and closely related Arabidopsis LEA proteins; B. Motif analysis of GhLEA, GhLEAG1 and closely related Arabidopsis LEA proteins.

2.3 棉花LEA基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

參考甄軍波等[21]的方法，利用NetPhos分析GhLEA和GhLEAG1的磷酸化位點(diǎn)(圖2)，GhLEA肽鏈具有較多的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)較少，GhLEAG1肽鏈中蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)明顯增多，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)較少。用SOPM法分析GhLEA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，GhLEA蛋白包括22.22%的α-螺旋，25.71%的延伸鏈，6.03%的β-轉(zhuǎn)角和46.03%的無(wú)規(guī)則卷曲，GhLEAG1蛋白包括18.33%的α-螺旋，33.07%的延伸鏈，3.59%的β-轉(zhuǎn)角和45.02%的無(wú)規(guī)則卷曲，通過(guò)預(yù)測(cè)2個(gè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)可以看出(圖3)，兩者在三級(jí)結(jié)構(gòu)上也存在明顯的差別。

2.4 棉花LEA基因表達(dá)模式分析

分別研究了GhLEA和GhLEAG12個(gè)基因在纖維中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，GhLEA在棉纖維發(fā)育20DPA時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，同時(shí)，在根、莖和葉片中，GhLEA在根中的表達(dá)量最高，在葉片中的表達(dá)量最低(圖4-A)。GhLEAG1在棉纖維中的表達(dá)量峰值同樣出現(xiàn)在20DPA，在莖中的表達(dá)量最高(圖4-B)。GhLEA可能只在棉纖維發(fā)育時(shí)期中的伸長(zhǎng)期發(fā)揮作用，而GhLEAG1在伸長(zhǎng)期及次生壁加厚期均可能發(fā)揮比較重要的作用。

A.GhLEA; B.GhLEAG1。

A.GhLEA三維結(jié)構(gòu); B.GhLEAG1三維結(jié)構(gòu)。 A.Predicted 3D structure of GhLEA; B. Predicted 3D structure of GhLEAG1.

誤差線(xiàn)上的不同大寫(xiě)字母表示0.01水平差異顯著(P<0.01)。 A. GhLEA基因在不同組織中的表達(dá)模式; B.GhLEAG1基因在不同組織中的表達(dá)模式。 Bars superscripted by different capital letters mean significant difference(P<0.01). A.Tissue expression analysis of GhLEA; B.Tissue expression analysis of GhLEAG1.

分別驗(yàn)證了GhLEA和GhLEAG1在NaCl、PEG和ABA非生物脅迫條件下的表達(dá)模式。在NaCl處理?xiàng)l件下，GhLEA在根、莖和葉片中的表達(dá)量均有升高，在莖和葉片中的表達(dá)量峰值現(xiàn)在處理后3 h，在根中的表達(dá)量峰值則出現(xiàn)在處理后6 h。在PEG處理?xiàng)l件下，GhLEA在根的表達(dá)量逐漸下降，在莖中的表達(dá)量呈先降后升的趨勢(shì)，在處理后6 h表達(dá)量達(dá)到最低，24 h后表達(dá)量恢復(fù)至對(duì)照水平。葉片中的表達(dá)量則呈上升趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在處理后3 h。在棉花幼苗受到ABA處理?xiàng)l件下，GhLEA的表達(dá)量峰值出現(xiàn)在處理后3 h(圖5-A)。通過(guò)圖5-B可以看出，GhLEAG1的表達(dá)模式同GhLEA具有明顯的區(qū)別。在高鹽脅迫條件下，GhLEAG1在根中的表達(dá)量迅速下降，在莖中的表達(dá)量則是輕微的波動(dòng)，而在葉片中的表達(dá)量則是顯著提高，并且在處理后3 h達(dá)到峰值。在受到PEG處理時(shí)，GhLEAG1在根中的表達(dá)量同樣是迅速下降，在莖中的表達(dá)量在6 h開(kāi)始下降，在葉片中的表達(dá)量則出現(xiàn)在處理后6 h達(dá)到峰值。GhLEAG1同樣受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量在處理后6 h達(dá)到峰值。

誤差線(xiàn)上的不同大寫(xiě)字母表示0.01水平差異顯著(P<0.01)。A.GhLEA基因表達(dá)模式分析; B.GhLEAG1基因表達(dá)模式分析。 Bars superscripted by different capital letters mean significant difference(P<0.01).A. Expression analysis of GhLEA; B.Expression analysis of GhLEAG1.

3 討論

棉花中前期已經(jīng)報(bào)道了GhD-7、GhD11、GhD-19、GhD-29、GhLEA14-A、GhLEA5-D、GhLEAD-113、GhLEAD-34等8個(gè)LEA蛋白家族成員，根據(jù)其氨基酸序列的相似度和motif組成，這8個(gè)家族成員分別屬于LEA1-5及Dehydrin家族成員[8]。陸地棉LEA2蛋白家族成員最多，有157個(gè)家族成員，根據(jù)其序列和motif結(jié)構(gòu)組成可以將其分為6個(gè)亞組[18]。

本研究從棉花均一化cDNA文庫(kù)中的2個(gè)LEA蛋白家族成員GhLEA和GhLEAG1，分別編碼315，251個(gè)氨基酸，與棉花中已報(bào)道的8個(gè)LEA蛋白家族成員分析比對(duì)，GhLEA和GhLEAG1屬于新的LEA家族成員。研究結(jié)果表明，GhLEA屬于棉花LEA2中的一員，GhLEAG1則屬于LEA3亞組，qRT-PCR結(jié)果表明，兩者在棉花纖維、根、莖和葉片中均有表達(dá)，兩者均受高鹽、PEG和ABA等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，但是GhLEA和GhLEAG1可能在棉纖維發(fā)育的伸長(zhǎng)期和次生壁加厚期分別發(fā)揮作用，兩者在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)上也具有比較明顯的差異。Gao等[22]研究結(jié)果表明，即使在同一個(gè)亞組中，不同成員由于其motif組成及表達(dá)模式的差異，在功能上也會(huì)有所差異。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出，GhLEA與丹參SmLEA和SmLEA2具有較近的親緣關(guān)系，都屬于LEA2家族成員，但是由于SmLEA由motif4/5/6組成，GhLEA、SmLEA2和SmLEA分別在不同的分支上。Hundertmark和Hincha[3]研究表明，At2G44060能夠受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。Wang等[8]和Wu等[23]的研究結(jié)果也表明，SmLEA和SmLEA2均能夠提高大腸桿菌和轉(zhuǎn)基因丹參的耐鹽性，但是其組織部位表達(dá)特異性存在差異，可能與其motif組成有關(guān)。GhLEA也能受到高鹽等非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，且GhLEA與At2G44060和SmLEA2的motif組成模式完全一致，推測(cè)其可能與SmLEA2具有相似的功能。植物L(fēng)EA3家族成員也可能參與生物和非生物脅迫應(yīng)答[5]。GhLEAG1則屬于棉花LEA3家族，與棉花中已經(jīng)克隆的GhLEA5-D同在一個(gè)亞組，但是motif組成模式具有一定的差別，可能屬于LEA3亞家族中的一個(gè)小分支，與GhLEA5-D等基因發(fā)揮不同的作用。