煙草Myb轉(zhuǎn)錄因子NtBL1基因的克隆及其表達(dá)分析

劉雅潔，薛 翀，邱詩蕊，李 想，唐麗雯，曾淑華

( 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

腋生分生組織(Axillary meristem,AM)起源于莖頂端分生組織(Shoot apical meristem,SAM)旁的邊界區(qū)(Boundary zone)，為植物側(cè)枝的生長和發(fā)育提供細(xì)胞來源，對(duì)植物器官發(fā)育和形態(tài)的建成極為重要[1-4]。SAM旁的邊界區(qū)通常由一些小且低分裂速率的細(xì)胞組成，與SAM干細(xì)胞區(qū)不同，這些邊界區(qū)細(xì)胞處于分化狀態(tài)，但是在早期的邊界區(qū)發(fā)育過程中，所有的邊界區(qū)細(xì)胞都會(huì)低量表達(dá)標(biāo)記細(xì)胞分化狀態(tài)的SHOOTMERISTEMLESS(STM)基因，恢復(fù)未分化狀態(tài)，起始形成腋生分生組織[5]。已有研究表明，許多轉(zhuǎn)錄因子通過與激素的共同作用調(diào)節(jié)著腋芽分生組織的發(fā)育和形成。如GRAS轉(zhuǎn)錄因子中的LATERALSUPPRESSOR(LAS)/MOC/LS基因[6-8]、bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子ROX/LAX1/BA[9-13]和Myb家族轉(zhuǎn)錄因子Blind/RAXs[14-17]等都被證實(shí)影響腋生分生組織的發(fā)育。

番茄中的Blind基因是最早用于研究腋生分生組織發(fā)育的空間標(biāo)記之一，它是R2R3Myb家族的一員，Blind基因在SAM旁的邊界區(qū)域內(nèi)的中央部分表達(dá)，調(diào)節(jié)腋生分生組織的形成和維持[15,17]。擬南芥中，Blind的同源基因RAX1、RAX2和RAX3的功能缺失突變體呈現(xiàn)出不同程度的側(cè)芽缺失的表型，結(jié)合rax突變體中SHOOTMERISTEMLESS(STM)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測結(jié)果表明，AtRAXs基因控制了腋生分生組織生長的很早的一個(gè)階段，RAX1、RAX2和RAX3在側(cè)枝發(fā)育的不同時(shí)期發(fā)揮作用，且具有部分功能冗余[14,16]。前人研究表明，番茄和擬南芥中分別有9，6個(gè)Blind同源基因，這些基因大部分與分枝發(fā)育和葉型發(fā)育相關(guān)，Blind同源基因的前118個(gè)氨基酸具有高度的保守性，C端的同源性卻較低，但是不同的物種中部分Blind同源基因的C端間卻保持了特有的同源性[17]。

盡管高等植物中腋生分生組織維持相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被大量發(fā)現(xiàn)和系統(tǒng)研究，但是煙草屬中只有少數(shù)的側(cè)生分生組織維持相關(guān)基因被報(bào)道[18-22]。由于普通煙草為異源四倍體，相對(duì)擬南芥等二倍體植物，其同源基因的數(shù)量通常加倍，同時(shí)存在功能冗余，只有發(fā)現(xiàn)更多相關(guān)基因才能解釋同一通路或者多個(gè)通路共同影響下的腋生分生組織形成。本研究利用同源比對(duì)法在煙草的公開測序數(shù)據(jù)中克隆煙草Blind基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和非生物脅迫下的表達(dá)分析，為后續(xù)基因功能驗(yàn)證、創(chuàng)建煙草腋芽缺失植株打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

煙草種子K326(Nicotianatabacumcv. K326)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。TRNzol總RNA提取試劑(DP405)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒 TIANScript Ⅱ RT Kit(KR107)購自天根生化科技有限公司；EasyTaq DNA polymerase購自全式金生物科技公司；PCR引物合成和測序均由北京擎科新業(yè)生物有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草幼苗的脅迫處理 用5%次氯酸鈉對(duì)煙草K326的種子進(jìn)行表面消毒并播種于MS培養(yǎng)基上，播種后的培養(yǎng)基置于25 ℃的光照培養(yǎng)室內(nèi)豎直培養(yǎng)14 d，然后轉(zhuǎn)入MS液體培養(yǎng)基(無糖)中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，繼而進(jìn)行模擬干旱(20% PEG-6000)、1 μmol/L ABA、200 mmol/L NaCl的非生物脅迫處理，處理的時(shí)間間隔均為0，8，16，24 h,每個(gè)處理在4個(gè)取樣點(diǎn)取100 mg煙苗全株用于RNA提取。

1.2.2 煙草NtBL1基因的克隆 提取K326苗期全株的總RNA，方法參照TRNzol(DP405)試劑的產(chǎn)品說明書；分別取2 μg總RNA合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物采用oligo dT18,方法參照TIANScript Ⅱ RT Kit(KR107)的產(chǎn)品說明。以K326根部cDNA為模板,NtBL14F和NtBL1442R為引物，用EasyTaq DNA polymerase擴(kuò)增NtBL1的CDS序列，采用普通三步法的PCR程序，瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物送出測序。

1.2.3NtBL1的半定量和qRT-PCR表達(dá)分析NtBL1基因的半定量分析。提取24 d苗期的根、全株、開花期的莖、葉、花等組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，方法同1.2.2中cDNA的合成方法。以cDNA為模板，NtBL1-qF和NtBL1-qR為引物擴(kuò)增NtBL1的部分CDS序列，PCR產(chǎn)物大小約為150 bp,且引物設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子，采用煙草的ACTIN2為對(duì)照(引物為NtActinqF/R，序列見表1)，瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。

NtBL1基因的qRT-PCR表達(dá)分析。提取非生物脅迫處理后的K326幼苗RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此cDNA為模板，NtBL1-qF/qR為引物進(jìn)行相對(duì)定量分析，對(duì)照采用煙草ACTIN2為對(duì)照(引物為NtActinqF/R,序列見表1)，表達(dá)差異的計(jì)算方法采用2-ΔΔCt法。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 NtBL1的生物信息學(xué)分析 從Sol Genomics Network、TAIR、NCBI網(wǎng)站下載煙草、擬南芥、番茄Blind同源基因的蛋白質(zhì)序列，序列號(hào)分別為：絨毛狀煙草mRNA_79528_cds(N.tomBL)、林煙草mRNA_10368_cds(N.sylBL)、本生煙Niben101Scf04560g07009.1(N.benBL1)、Niben101Scf01693g01004.1(N.benBl2)、漸狹葉煙草NIATv7_g13170.t1(N.attBL)、番茄Solyc11g069030.1(blind)、Solyc06g074910.2(blind-like2)、Solyc06g074920.1(blind-like6)、Solyc09g-008250.2(blind-like1)、Solyc04g077260.2(blind-like3)、Solyc02g091980.1(blind-like7)、Solyc07g-006750.2(blind-like8)、Solyc12g008670.1(blind-like4)、Solyc08g065910.1(blind-like5)、擬南芥AT5G57620.1(MYB36)、AT5G65790.1(MYB68)、AT3G49690.1(RAX3/MYB84)、AT2G36890.2(RAX2/MYB38)、AT2G36890.1(RAX2/MYB38)、AT5G23000.1(MYB37)、AT4G37780.1(MYB87)，僅以番茄Blind、擬南芥RAX1、RAX2、RAX3 4個(gè)蛋白序列的前118個(gè)氨基酸為模板構(gòu)建參考數(shù)據(jù)的隱馬爾可科夫模型，然后利用Hmmer(Hmmsearch)軟件在茄科基因組網(wǎng)站的煙草K326全基因組數(shù)據(jù)庫中檢索，獲得包括NtBL1在內(nèi)的14條氨基酸序列,序列號(hào)分別為：Nitab4.5_0001442g0010/NtBL1、Nitab4.5_0004993g0020/NtBL2、Nitab4.5_0001163g-0150、Nitab4.5_0001050g0010、Nitab4.5_0000578g-0120、Nitab4.5_0007679g0010、Nitab4.5_0003478g-0050、Nitab4.5_0006804g0010、Nitab4.5_0012173g-0010、Nitab4.5_0000063g0150、Nitab4.5_0000244g-0260、Nitab4.5_0001074g0040、Nitab4.5_0003781g-0060、Nitab4.5_0004621g0030。

利用ProtParam(ExPASy)在線分析軟件分析NtBL1蛋白的理化性質(zhì)；運(yùn)用TMHMM和TMpred(ExpASy)進(jìn)行基因的跨膜結(jié)構(gòu)分析；利用PROSITE(ExPASy)對(duì)NtBL1進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析；利用Sopma和Swissmodel分別預(yù)測蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；用MEME軟件對(duì)NtBL1及其同源蛋白分別進(jìn)行了蛋白結(jié)構(gòu)分析；利用ClustralW和DNAMan軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)與分析，采用Mega 7.0 軟件Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)置1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草NtBL1的克隆

以煙草K326的24 d苗期根部cDNA為模板，NtBL14F/NtBL1442R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示在1 000 bp附近擴(kuò)增得到目的大小的條帶(圖1)，將PCR產(chǎn)物送出測序獲得1 014 bp的測序序列，將測序結(jié)果與茄科基因組網(wǎng)站(http://www.Solgenomics.net//)上下載的NtBL1(序列號(hào)：Nitab4.5_0001442g0010)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示序列一致。

M.1 kb DNA Marker.

2.2 煙草NtBL1基因及其同源基因的表達(dá)分析

對(duì)茄科基因組網(wǎng)站(Sol Genomics Network)上的煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，表明NtBL1基因在52 d的煙苗地上部分、根和莖頂端中均有表達(dá)，但在根中的表達(dá)量顯著高于地上部分和莖頂端(圖2)；同時(shí)，對(duì)不同部位的煙株進(jìn)行半定量PCR的結(jié)果同樣顯示，NtBL1基因在24 d苗期全株、苗期根、成熟期的花序、葉、莖中均有表達(dá)，但苗期全株和根中NtBL1的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量明顯高于花和葉(圖3)。綜合結(jié)果表明，NtBL1基因在普通煙草的多個(gè)時(shí)期和部位普遍表達(dá)，且在根中的表達(dá)量較高。

不同小寫字母表示差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。 Different lowercase letter show significant difference(P<0.05).

2.3 煙草NtBL1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析

2.3.1 NtBL1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)分析 用ProtParam(ExPASy)在線分析了煙草NtBL1蛋白的理化性質(zhì)，該蛋白含有337個(gè)氨基酸，其中天冬酰胺(Asn)含量最高，占比12.8%，其分子質(zhì)量為3.8 ku， pI值為8.46，有 29個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基和33個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)和平均總親水性系數(shù)分別為52.96和-0.84，屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白。利用TMHMM和TMpred(ExpASy)進(jìn)行基因的跨膜結(jié)構(gòu)分析均表明NtBL1不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

圖3 NtBL1在不同組織中的表達(dá)分析Fig.3 Analysis of relative expression of NtBL1 in different tissues

2.3.2 NtBL1蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用PROSITE(ExPASy)和DNAMan進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)NtBL1的氨基酸序列包含2個(gè)Myb-type HTH DNA-binding domian，分別位于9-62，63-117的氨基酸區(qū)段，DNA結(jié)合區(qū)分別位于38-61和90-113的2個(gè)區(qū)段(圖4)。利用Sopma進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，62.61%的氨基酸組成了無規(guī)則卷曲(Random coil)，21.07%的氨基酸組成了α-螺旋(Alpha helix)，13.35%的氨基酸參與組成延伸鏈(Extended strand)，2.97%的氨基酸參與組成β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)(圖5-A)。利用Swissmodel預(yù)測得到NtBL1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5-B)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果較為一致，表明NtBL1蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋組成。

圖4 部分煙草屬、番茄和擬南芥中Blind同源基因的多序列比對(duì)Fig.4 Multiple sequences alignment of Blind homologues in several Nicotiana species,Tomato and Arabidopsis

2.3.3 NtBL1蛋白的同源性分析 從茄科基因組網(wǎng)站(Sol Genomics Network)和擬南芥網(wǎng)站(TAIR)上分別下載番茄、普通煙草K326和擬南芥的Blind/RAX同源蛋白序列，通過ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)，然后用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，同時(shí)利用MEME網(wǎng)站分析上述序列的模體結(jié)構(gòu)(圖6)。結(jié)果顯示，NtBL1序列與番茄中的BL、Blind-like2、Blind-like6聚合在一起，且這些序列共同含有模體1,2,3,15，大部分含有模體5,8,9,11,12，相似的模體結(jié)構(gòu)預(yù)示著番茄和煙草中BL同源基因可能擁有類似的功能，如NtBL1基因可能在煙草分支發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用。

A.NtBL1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖；B.NtBL1的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。 A.Secondary structure of NtBL1；B.Tertiary structure of NtBL1.

利用DNAMan軟件計(jì)算NtBL1與番茄、擬南芥和部分煙屬Blind同源序列間的氨基酸相似度發(fā)現(xiàn)(圖4)，NtBL1基因與林煙草、絨毛煙草BL同源基因的蛋白序列同源性分別高達(dá)99.7%和97.3%,說明NtBL1來源于林煙草基因組；NtBL1基因與本生煙和漸狹葉煙草中3個(gè)Blind同源基因的全長氨基酸序列同源性為95.85%～96.13%，前118個(gè)氨基酸的同源性為98.28%～99.14%，證明Blind基因在煙屬植物中普遍存在且序列保守程度高；NtBL1與番茄Blind的前118個(gè)氨基酸序列(Myb結(jié)構(gòu)域)同源性為92.31%，與擬南芥RAXs的前118個(gè)氨基酸序列的同源性為82.05%～86.32%，進(jìn)一步證實(shí)了NtBL1是番茄Blind基因在普通煙草中的同源基因之一。

圖6 NtBL1系統(tǒng)進(jìn)化樹和模體分析Fig.6 The phylogenetic tree analysis and Motif prediction of NtBL1

2.4 非生物脅迫下NtBL1基因的表達(dá)分析

用qRT-PCR檢測3種非生物脅迫處理下NtBL1基因的表達(dá)情況(圖7)，在ABA處理后，NtBL1基因的表達(dá)量在8 h時(shí)下調(diào)至對(duì)照的0.25倍，但是在隨后的24 h內(nèi)表達(dá)量隨著時(shí)間延長而增加，最大值在24 h時(shí)出現(xiàn)，為對(duì)照的3.57倍。在NaCl處理后，NtBL1基因的表達(dá)量24 h內(nèi)出現(xiàn)下調(diào)，最低值在24 h時(shí)出現(xiàn)，為對(duì)照的0.19倍。在PEG-6000處理后，NtBL1基因的表達(dá)量在24 h內(nèi)與對(duì)照相比并未出現(xiàn)顯著性差異。結(jié)果表明，NtBL1基因的表達(dá)受ABA處理的誘導(dǎo)，受NaCl處理的抑制，但是不受PEG-6000處理的影響。

圖7 NtBL1在3種非生物脅迫下的相對(duì)表達(dá)量分析Fig.7 Analysis of relative expression of NtBL1 under three abiotic stresses

3 討論

普通煙草是一種重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，為了收獲高品質(zhì)的煙葉制品，生產(chǎn)中通常采用人工打頂抹杈或者化學(xué)抑芽劑的方法去除腋芽，但是前者勞動(dòng)強(qiáng)度大，后者對(duì)煙葉質(zhì)量和環(huán)境均有不良影響，生物技術(shù)抑芽被公認(rèn)為一條重要的探索途徑，因此，對(duì)腋芽分化相關(guān)基因的克隆和功能研究極為重要。但是長期以來，普通煙草中相關(guān)遺傳機(jī)制研究進(jìn)展較慢。

本研究從普通煙草K326中克隆得到1個(gè)NtBL1基因的CDS序列，該基因全長1 014 bp,編碼337個(gè)氨基酸。NtBL1蛋白與林煙草、絨毛狀煙草、本生煙和漸狹葉煙草中的BL的同源性較高，說明其在煙草屬中的進(jìn)化相對(duì)保守。Blind基因在高等植物中普遍存在，且其N端具有高度保守的118個(gè)氨基酸殘基，但是C端的序列卻按結(jié)構(gòu)和功能的不同而分別聚類[17]，本研究中對(duì)番茄、擬南芥和煙草的Blind同源序列的蛋白結(jié)構(gòu)分析驗(yàn)證了這種保守性以及不同進(jìn)化分支在C端蛋白模體結(jié)構(gòu)上的高度一致性。NtBL1蛋白前118個(gè)氨基酸序列與擬南芥和番茄中的Blind/RAX蛋白的同源性高達(dá)82.05%～92.31%，且與番茄Blind及其同源蛋白Blind-like2/C、Blind-like6有相似的蛋白模體結(jié)構(gòu)和較近的進(jìn)化距離，Blind和Blind-like2/C分別調(diào)控番茄的分枝發(fā)育和葉型結(jié)構(gòu)，均參與到的分生組織的邊界區(qū)域建立相關(guān)的通路中[17]，預(yù)示著NtBL1基因可能也參與了分生組織邊界區(qū)建立相關(guān)的進(jìn)程。

本研究利用半定量PCR分析NtBL1在煙草苗期和成熟期不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示了其在多時(shí)期各部位均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最高，這與前人研究中擬南芥RAX2和RAX3的表達(dá)模式類似，但與番茄Blind的表達(dá)模式不完全相同，提示四倍體煙草基因組的復(fù)雜性，二倍體番茄和擬南芥中Blind/RAX基因在煙草中的同源基因可能存在多個(gè)，部分可能如番茄中Blind-like6基因一樣，為無功能的假基因[17]，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果部分驗(yàn)證了這個(gè)猜想，與番茄Blind、Blind-like2、Blind-like6基因聚合在同一分支上的普通煙草Blind同源序列共計(jì)4個(gè)，其中包括NtBL1。在后續(xù)研究過程中，應(yīng)該對(duì)煙草中剩余的13個(gè)Blind同源序列進(jìn)行克隆，全面描述煙草Blind同源基因在腋芽分化過程中的功能。

部分與分支發(fā)育相關(guān)的基因同時(shí)參與植物非生物脅迫下的抗逆性，如AtRAX1/MYB37的超表達(dá)會(huì)影響一系列ABA應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)超表達(dá)轉(zhuǎn)化植株對(duì)外源ABA表現(xiàn)出超敏感表型，但是卻能提高其耐旱性[23]。因此，本研究采用了3種非生物脅迫處理以研究NtBL1在脅迫處理下的應(yīng)答，在不同的脅迫處理下，該基因的表達(dá)情況不同，推測NtBL1基因在不同的逆境條件下應(yīng)答機(jī)制不同，同樣仍不能排除NtBL1在對(duì)不同脅迫處理下是否存在翻譯水平的不同響應(yīng)，或者蛋白間的互作。因此，為了進(jìn)一步明確NtBL1在腋芽分化和對(duì)抗非生物脅迫逆境的具體機(jī)制，預(yù)計(jì)構(gòu)建NtBL1基因敲除和超表達(dá)載體，繼而對(duì)林煙草和普通煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株，通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的遺傳分析進(jìn)一步明確NtBL1的功能。