實驗室檢測技術(shù)在肺結(jié)核活動性判斷中的應(yīng)用進(jìn)展

付亮 鄧國防

我國肺結(jié)核疫情依舊嚴(yán)峻，是全球第二大結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，2018年新發(fā)肺結(jié)核患者82.3萬例[1-2]。眾所周知，結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)檢測陽性是診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)[3]，但目前我國仍存在大量病原學(xué)陰性(包括抗酸染色涂片、核酸檢測、培養(yǎng)等方法)肺結(jié)核患者，因缺乏有效的生物學(xué)標(biāo)志物，使得實驗室檢測技術(shù)難以對此類患者的活動性判斷發(fā)揮有效作用，需要啟動規(guī)范的活動性判斷流程，即按照《肺結(jié)核活動性判斷及臨床應(yīng)用專家共識》(以下簡稱“《共識》”)[4]對肺結(jié)核活動性判斷的評價方法，包括應(yīng)用癥狀評價、治療史評價、實驗室評價、影像學(xué)評價和病理學(xué)評價工具，以指導(dǎo)臨床進(jìn)行綜合評價。但由于實驗室檢測技術(shù)具有方便快捷、體外檢測、無機體損傷等優(yōu)勢，進(jìn)一步評估及開發(fā)其在肺結(jié)核活動性判斷上的意義仍然非常重要，并且將具有廣泛的應(yīng)用前景?；诖?，筆者對國內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)行論述。

一、結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)檢測

目前，結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)檢測仍然是肺結(jié)核活動性判斷最重要的評價指標(biāo)。其中直接厚涂片、傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)檢測是常用的痰結(jié)核分枝桿菌檢測技術(shù)，而分子生物學(xué)技術(shù)因可明顯提高活動性肺結(jié)核痰液病原學(xué)的檢出率、獲得接近50%的患者痰液病原學(xué)診斷而得以被更廣泛地應(yīng)用。但對于經(jīng)上述檢測結(jié)果為痰液病原學(xué)陰性肺結(jié)核患者，還可以通過支氣管鏡肺泡灌洗液(BALF)和超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的經(jīng)支氣管針吸活檢(EBUS-TBNA)等深度病原學(xué)檢測技術(shù)獲得深部組織和分泌物，完成病原學(xué)檢查，進(jìn)一步提高病原學(xué)檢出率以明確診斷，如GeneXpert MTB/RIF對支氣管鏡肺泡灌洗液檢測較痰液具有較高的敏感度和特異度[5]。另外，隨著病理學(xué)和分子病理學(xué)技術(shù)的推廣和應(yīng)用，應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測石蠟組織中結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸(TB-DNA)，對提高肺結(jié)核活動性精準(zhǔn)判斷也起到了積極作用[6-7]。因此筆者建議，應(yīng)充分應(yīng)用上述檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上努力尋找病原學(xué)證據(jù)。

二、結(jié)核分枝桿菌抗原檢測

脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)是結(jié)核分枝桿菌重要的細(xì)胞壁組成成分，可作為靶抗原被側(cè)向流式檢測儀器(Alere Determine TB-LAM)在尿液標(biāo)本中檢測到，具有快速、價廉、無創(chuàng)、不需要實驗室或技術(shù)支撐，以及能在床邊開展等優(yōu)點。LAM檢測已被證明具有較高的準(zhǔn)確度，主要適用于診斷CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)水平低的HIV感染者是否并發(fā)結(jié)核病[8]，可提高此類患者的住院生存率[9]，已獲得WHO[10]認(rèn)可。有研究正在評估痰液LAM檢測作為抗結(jié)核療效監(jiān)測的效果，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)的方法取得了可喜的臨床試驗結(jié)果[11]。另一種有前途的方法是使用與質(zhì)譜聯(lián)用的納米盤(NanoDisk-MS)鑒定結(jié)核分枝桿菌特異性肽片段，可以快速量化血液中結(jié)核分枝桿菌抗原；例如，可以快速檢測出抗結(jié)核治療后患者血清中培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)和早期分泌性抗原靶標(biāo)6(ESAT-6)的下降水平[12]。但筆者認(rèn)為，目前LAM檢測僅是一種有前途的研究，能否作為肺結(jié)核活動性判斷的評價指標(biāo)仍需進(jìn)一步臨床驗證。

三、炎性和急性期反應(yīng)標(biāo)志物

一系列活動性生物標(biāo)記物可以用于診斷結(jié)核病和預(yù)測對抗結(jié)核藥品治療的反應(yīng)，例如γ-干擾素(IFN-γ)誘導(dǎo)蛋白10(IFN-γ inducible protein 10，IP-10)[13]是多種細(xì)胞(包括單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)應(yīng)答γ-干擾素而分泌的趨化因子，是單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的趨化劑，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞黏附[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，活動性結(jié)核病患者血清中可溶性IP-10的濃度明顯升高[16]，但在抗結(jié)核藥品進(jìn)行治療后明顯下降，提示IP-10可能作為活動性判定的指標(biāo)。另外，IP-10對診斷免疫抑制者并發(fā)結(jié)核病方面具有一定的優(yōu)勢，可作為其診斷的輔助指標(biāo)。C-反應(yīng)蛋白(CRP)和血紅細(xì)胞沉降率(ESR)已被應(yīng)用于判斷結(jié)核病的嚴(yán)重程度，預(yù)測治療后的影像學(xué)改善情況[17-18]。也有研究把7種可溶性血清標(biāo)志物(包括IP-10、CRP、IFN-γ、血清淀粉樣蛋白A、補體因子H、載脂蛋白A1和甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白)的相對水平作為一個整合的結(jié)核病診斷包[19-20]，用于區(qū)分結(jié)核潛伏感染和活動性結(jié)核病，但其應(yīng)用價值還需進(jìn)行多中心、大樣本研究以進(jìn)一步證實。因此，目前檢測炎性和急性期反應(yīng)標(biāo)志物可作為活動性判斷評價的參考指標(biāo)，但臨床價值仍然有限。

四、免疫學(xué)標(biāo)志物檢測

盡管尚未完全闡明機體在結(jié)核感染后的免疫應(yīng)答機制，但免疫應(yīng)答相關(guān)指標(biāo)對于診斷疾病和預(yù)測療效至關(guān)重要，尤其是T淋巴細(xì)胞的表型和功能性特征[21]。

1.T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物：T淋巴細(xì)胞經(jīng)歷了抗原驅(qū)動分化的若干階段(早期、晚期和終末分化的效應(yīng)細(xì)胞)，表現(xiàn)為一組細(xì)胞表面標(biāo)志物的變化，這些標(biāo)志物可作為結(jié)核分枝桿菌復(fù)制或抗原負(fù)荷的指標(biāo)。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，CD27、IFN-γ、CD4+T淋巴細(xì)胞的水平與肺部組織的破壞程度高度相關(guān)[22]。而T淋巴細(xì)胞活化標(biāo)志物，如CD38、人白細(xì)胞抗原DR(HLA-DR)和細(xì)胞增殖抗原(Ki67)，也有希望成為結(jié)核病活動性判斷的指標(biāo)[21]。

2.T淋巴細(xì)胞反應(yīng)標(biāo)志物：γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay，IGRA)檢測的原理是結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌INF-γ。但I(xiàn)GRA與T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物相關(guān)檢測的優(yōu)劣還需要更多的研究證實。

與結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)相比較，IGRA與TST檢測均可用于結(jié)核潛伏感染的判斷[4]，但I(xiàn)GRA準(zhǔn)確度高、假陽性少，且不受卡介苗和大多數(shù)非致病分枝桿菌的影響，尤其對于像中國這樣普遍接種卡介苗的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，IGRA具有更重要的意義。由于IGRA與TST檢測均無法準(zhǔn)確預(yù)測結(jié)核潛伏感染個體是否會發(fā)展為活動性結(jié)核病，故均不得用于活動性結(jié)核病的診斷[23]；近期，出現(xiàn)了應(yīng)用IGRA評估抗結(jié)核療效反應(yīng)的研究，即從結(jié)核分枝桿菌特異性免疫應(yīng)答的角度來評價抗結(jié)核療效，此領(lǐng)域的研究數(shù)量正在迅速增加。研究表明，結(jié)核病患者初診和治愈后的IFN-γ水平無明顯差異[24-26]。但也有一些研究結(jié)果顯示，活動性肺結(jié)核IFN-γ水平在抗結(jié)核藥品進(jìn)行治療期間和治療后可以出現(xiàn)下降或轉(zhuǎn)陰，但也出現(xiàn)部分患者的免疫應(yīng)答表現(xiàn)為持續(xù)上升的趨勢[27-28]。Pourakbari等[29]對IGRA[包括γ-干擾素釋放試驗中的Quanti FERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)、結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞斑點試驗(T-SPOT.TB)、結(jié)核感染T細(xì)胞檢測試劑盒(QFT-Plus)等三種商業(yè)化檢測技術(shù)]在評估抗結(jié)核治療反應(yīng)中的效果進(jìn)行了系統(tǒng)綜述和Meta分析，結(jié)果表明：在抗結(jié)核治療期間監(jiān)測QFT-GIT和T-SPOT.TB反應(yīng)的變化可能對評估治療效果十分有限，而QFT-Plus的變化則有希望用于確定治療效果或進(jìn)行治療監(jiān)測。還有研究關(guān)注了T-SPOT.TB中結(jié)核特異性抗原孔(TBAg)斑點形成細(xì)胞數(shù)與陽性對照孔植物血凝素(PHA)形成斑點數(shù)的比值(TBAg/PHA ratio)，發(fā)現(xiàn)活動性結(jié)核病患者的TBAg/PHA比值明顯高于結(jié)核潛伏感染者，且在抗結(jié)核藥品治療過程中TBAg/PHA的比值會下降，提示該指標(biāo)或可用于監(jiān)測治療效果[30]。綜上，筆者認(rèn)為目前IGRA在結(jié)核病活動性判斷中價值有限，有待進(jìn)一步研究。

五、血液轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物檢測

Wang等[31]使用全基因組RNA測序方法，發(fā)現(xiàn)含腫瘤壞死因子受體超家族成員10C(TNFRSF 10C)、早期b細(xì)胞因子3(EBF 3)和a2-巨球蛋白樣蛋白 1(A2ML 1)的三基因集可對91.5%的肺結(jié)核個體進(jìn)行正確分類，可將活動性肺結(jié)核與結(jié)核潛伏感染者區(qū)分開，敏感度和特異度分別為82.4%和92.4%。還有研究表明，Ⅰ/Ⅱ型IFN基因或IFN刺激基因的mRNA轉(zhuǎn)錄的全血白細(xì)胞表達(dá)升高與活動性結(jié)核病有關(guān)；且在結(jié)核感染患者中發(fā)現(xiàn)了幾種轉(zhuǎn)錄組特征性改變，并在抗結(jié)核藥品治療后下降[32]，提示這些標(biāo)志物與結(jié)核病活動性相關(guān)。但這些檢測技術(shù)還未能獲得臨床大量研究，臨床意義有限，尚需進(jìn)一步研究。

六、代謝組學(xué)檢測

宿主代謝產(chǎn)物的來源包括：(1)外源性代謝產(chǎn)物來自外部環(huán)境，并通過呼吸吸入或物質(zhì)攝入(例如食物或藥物)。(2)體內(nèi)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可以是宿主生理代謝過程中的產(chǎn)物，也可以是微生物病原體代謝過程中的產(chǎn)物，或者是宿主對諸如感染或炎癥等過程中的病理反應(yīng)性產(chǎn)物[33]。因此，宿主或病原微生物的新陳代謝變化可能會影響代謝產(chǎn)物組分。不同微生物種屬在人體組織微環(huán)境中生長代謝時產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物種類不同，使得檢測其代謝譜和特異性物質(zhì)成為可能。目前，代謝組學(xué)檢測的標(biāo)本主要為血清、血漿、尿液、糞便[34]和呼出氣[35]。在結(jié)核病診斷方面，有研究使用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法，鑒定健康人和患者呼出氣中與結(jié)核病有關(guān)的揮發(fā)性有機化合物(volatile organic compounds，VOCs)，但其檢測準(zhǔn)確度較低(80%～85%)[36-37]。Nakhleh等[38]進(jìn)行了一項病例對照研究，認(rèn)為基于納米材料的呼出氣診斷方法可能是診斷結(jié)核病的有用工具(準(zhǔn)確度為92%)，但仍需更大的隊列研究以驗證結(jié)果?？梢?，代謝組學(xué)檢測目前不具備用于肺結(jié)核活動性判斷的意義。

七、 展望

目前，病原學(xué)陰性肺結(jié)核活動性判斷仍是臨床醫(yī)療實踐中的熱點及難點問題，其評價指標(biāo)主要包括實驗室指標(biāo)(結(jié)核分枝桿菌抗原、炎性和急性期反應(yīng)標(biāo)志物、免疫學(xué)指標(biāo)、血液轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物等)、影像學(xué)指標(biāo)(胸部X線、CT、MR、PET/CT)、病理學(xué)指標(biāo)等。對于痰液病原學(xué)陰性的患者，推薦使用支氣管鏡下肺活檢、BALF、分子生物學(xué)檢測獲得病理學(xué)和病原學(xué)診斷依據(jù)；如仍不能明確，可通過觀察經(jīng)驗性抗結(jié)核藥品治療(一般2個月療程)效果來評價其活動性。其中實驗室指標(biāo)是最重要的評價依據(jù)，因此筆者結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)評價了實驗室檢測技術(shù)用于肺結(jié)核活動性判斷的臨床應(yīng)用價值和前景，為臨床醫(yī)生提供了基本評價原則和方向。但仍有許多問題亟待解決：一是研發(fā)高效的生物標(biāo)志物應(yīng)用于肺結(jié)核活動性判斷，不斷提升其判斷準(zhǔn)確度。二是開展活動性肺結(jié)核的臨床轉(zhuǎn)歸隨機對照研究，探索科學(xué)的實驗室檢測技術(shù)在活動性判斷體系中的評價作用。三是肺結(jié)核患者的并發(fā)癥、殘留損壞和結(jié)構(gòu)性肺病也不容忽視，不僅可影響肺結(jié)核活動性的判斷，還可能影響實驗室檢測技術(shù)的敏感度和特異度。總之，在肺結(jié)核活動性判斷中需應(yīng)用多種實驗室檢測技術(shù)綜合評估，才能解決患者精準(zhǔn)治療和精準(zhǔn)停藥的臨床問題。