人體微生物組研究進(jìn)展

朱家輝

(陜西省西安中學(xué) 陜西西安 710018)

1990年啟動(dòng)的人類基因組計(jì)劃于2003年完成測序工作，隨后圍繞測序成果開展了進(jìn)一步的研究工作，這項(xiàng)計(jì)劃除了發(fā)現(xiàn)全部人類基因組約有2.6萬個(gè)基因外，還發(fā)現(xiàn)人類基因組中大約有200多個(gè)基因來自于人祖先基因組中的細(xì)菌基因，提示了寄生于人體的細(xì)菌可能與寄主人體之間發(fā)生了遺傳信息的交流。另外，人體微生物的數(shù)量及基因組數(shù)目遠(yuǎn)超過人體自身。人們通過多年的臨床觀察及研究發(fā)現(xiàn)，人體微生物對(duì)人的健康和疾病的發(fā)展有重大影響，很多疾病的發(fā)病機(jī)制涉及多種微生物。由于人體微生物對(duì)人類生命活動(dòng)的影響巨大，將人體微生物的基因組稱為人的“第二基因組”，它與人類自身的基因組共同作用，參與人體的發(fā)育、營養(yǎng)、代謝、免疫等過程，影響人類健康。

人體微生物組是人體所有微生物群及其遺傳物質(zhì)的總和。2005年，13個(gè)國家的科學(xué)家在巴黎召開了第一屆國際微生物組大會(huì)，組建了“國際人體微生物組聯(lián)盟”，共同協(xié)作，助力人類微生物組研究。美國啟動(dòng)了人體微生物組計(jì)劃(HMP)，產(chǎn)生了超過14.23tb的數(shù)據(jù)，到2016年，HMP已經(jīng)發(fā)布了超過800個(gè)參照微生物基因組序列、超過3萬億bp的微生物宏基因組測序數(shù)據(jù)、7000多萬個(gè)16SrRNA序列數(shù)據(jù)、500多萬個(gè)特異預(yù)測基因。2017年發(fā)表在《Nature》上的一項(xiàng)研究工作介紹了HMP的第二波數(shù)據(jù)，包括1631個(gè)新的宏基因組數(shù)據(jù)，使用更新的分析和組裝方法對(duì)身體不同部位和時(shí)間進(jìn)行分析[1]。HMP之后，美國國立衛(wèi)生研究院啟動(dòng)了艾滋病人肺部微生物組計(jì)劃，隨后其他國家也相繼開展人體微生物組的大規(guī)模項(xiàng)目，包括岡比亞腸道微生物組計(jì)劃、INRA法國/中國MicroObes項(xiàng)目、加拿大人體微生物組項(xiàng)目、澳大利亞人體微生物組快速啟動(dòng)計(jì)劃和韓國雙胞胎群組微生物組多樣性計(jì)劃。2008年，國際人類微生物組研究聯(lián)盟(IHMC)成立，全世界都在蓬勃開展人體微生物組相關(guān)的研究。這個(gè)學(xué)科的潛力正在被不斷發(fā)掘。

本文在總結(jié)眾多研究成果的基礎(chǔ)上，從人體微生物組研究對(duì)象的多樣性、科學(xué)的研究方法及技術(shù)、人體微生物組的功能以及人們對(duì)微生物組研究成果的應(yīng)用方面入手，綜述這一領(lǐng)域的研究進(jìn)展，希望能為該領(lǐng)域的研究人員提供較為全面的資料，同時(shí)也能幫助有興趣進(jìn)行此類研究的科研人員快速了解行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)。

一、人體微生物組的多樣性

HMP計(jì)劃從健康人體的五大主要部位(口腔、皮膚、呼吸道、腸道、生殖道)采樣并提取DNA后發(fā)現(xiàn)不同身體部位的DNA提取量差別很大，序列分析表明不同身體部位的微生物結(jié)構(gòu)組成也有差別。我們將重點(diǎn)從人體三個(gè)主要部位的微生物結(jié)構(gòu)組成及定植規(guī)律等方面分析人體微生物組的生態(tài)及多樣性。

(一)腸道微生物群落

在HMP進(jìn)行過程中的研究發(fā)現(xiàn)，人腸道樣本DNA含量為各部位之首，是DNA含量最少的皮膚樣本的百倍以上。人腸道微生物種類和數(shù)量可占到人體微生物總量的90%。新生兒的腸道微生物菌群主要來自于母體產(chǎn)道、糞便及體表微生物菌群的垂直傳遞[2，3]。這些微生物的定殖與發(fā)展呈動(dòng)態(tài)變化[4]，一些兼性厭氧微生物，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等在腸道中增殖逐漸形成厭氧的腸道環(huán)境。嬰兒腸道微生物受多種因素影響，出生第一個(gè)月腸道環(huán)境發(fā)生大的變化會(huì)導(dǎo)致某些種類微生物消失，那些到成年階段仍然存在的微生物成為腸道固有菌群。出生后三年內(nèi)嬰兒的腸道微生物種類不斷增加，擬桿菌門逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群，腸道微生物的結(jié)構(gòu)組成也逐漸達(dá)到成年人水平。由于環(huán)境、種族和生活習(xí)慣等因素差異，中國人腸道菌群可能有獨(dú)特的特征。2017年趙立平等人在中國科學(xué)院院刊上建議啟動(dòng)“國際華族健康微生物組研究計(jì)劃”，希望借助從對(duì)遺傳背景相對(duì)穩(wěn)定，飲食、生活方式不同的人群菌群結(jié)構(gòu)的研究深入揭示慢性病的發(fā)病機(jī)制[5]。Zhang等人以居住在三個(gè)城市的健康成年人糞便為樣本，使用宏基因組學(xué)方法研究了健康中國人群腸道微生物群落特征，發(fā)現(xiàn)了11個(gè)核心細(xì)菌種屬，研究了疾病相關(guān)的微生物的分布模式，為中國人群健康腸道微生物組成提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)[6]。

(二)呼吸道微生物群落

曾經(jīng)，人們以為健康的肺部是無菌的，但下呼吸道纖支鏡刷樣本中檢測到了擬桿菌、厚壁菌、變形桿菌、梭桿菌，并且發(fā)現(xiàn)健康肺部與哮喘病人肺內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)組成不同[7]。呼吸道微生物組守衛(wèi)著人體健康的大門[8]。Charlson等人從6名健康個(gè)體的多個(gè)部位采集呼吸道菌群，通過16S rDNA Q-PCR和深度測序分析細(xì)菌豐度和組成，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門的veillonellaceae、擬桿菌門中的prevotellaceae和厚壁菌門鏈球菌科的微生物是呼吸道中的優(yōu)勢(shì)菌群，呼吸道微生物群生物量呈現(xiàn)從上到下減少的趨勢(shì)，肺部微生物群與上呼吸道菌群無法明確區(qū)分[9]。Morris等人為檢查健康個(gè)體下呼吸道微生物組成，收集口腔洗液和支氣管鏡下肺泡灌洗液后基于16S RNA進(jìn)行序列分析，利用群落生態(tài)學(xué)的中性模型確定肺微生物最可能的存在的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)鑒定的細(xì)菌大部分也在口腔出現(xiàn)，但在幾個(gè)物種中存在差異[10]。新生兒由母嬰垂直傳遞已建立起呼吸道微生物微環(huán)境但是并不穩(wěn)定。健康人體可通過肺部的固有免疫機(jī)制比如黏膜纖毛清除、巨噬細(xì)胞吞噬、呼吸道表面可溶性液體的抑制作用，預(yù)防吸入的微生物造成感染。

(三)口腔微生物群落

口腔內(nèi)有舌、咽喉、齒齦及口腔黏膜等黏膜表面和牙釉質(zhì)表面，以及含有抗菌物質(zhì)的唾液，為微生物的定殖提供復(fù)雜的環(huán)境條件?？谇恢杏猩习俜N微生物，包括細(xì)菌、真菌、病毒、原生動(dòng)物[11]。胎兒出生的時(shí)候由產(chǎn)道獲得原始菌群，在從新生兒到成人的成長過程中原始菌群經(jīng)過初始附著、代謝相互作用、信息交換等途徑進(jìn)行定殖并演替。健康口腔定殖菌群如果轉(zhuǎn)移到人體其它環(huán)境中具有誘發(fā)感染的風(fēng)險(xiǎn)。

二、人體微生物組研究方法及策略

傳統(tǒng)的研究方法主要包括分離培養(yǎng)、染色分析及血清學(xué)試驗(yàn)等檢測手段，由于微生物群落中各微生物豐度不同以及培養(yǎng)條件的不適宜會(huì)導(dǎo)致部分低豐度或難培養(yǎng)微生物培養(yǎng)失敗而被漏檢。微生物的培養(yǎng)是研究個(gè)體及群落生理生化特征及功能的必要手段。因此，不斷有研究組投入大量精力致力于微生物培養(yǎng)條件的研究優(yōu)化。根據(jù)“盡可能模擬微生物自然生長條件”的培養(yǎng)原則，人們發(fā)展出了許多現(xiàn)代、高通量的培養(yǎng)方法，如向培養(yǎng)體系中加入生長環(huán)境的成份、加入群落中其它微生物代謝物、加入微生物生長因子、制作“細(xì)菌陷阱”等，成功培養(yǎng)了許多難培養(yǎng)微生物。

事實(shí)上，由于人們對(duì)一些微生物生存條件及代謝情況的不了解，目前仍然存在許多不可培養(yǎng)的微生物。為獲得這部分微生物的信息，人們發(fā)展了一系列的免培養(yǎng)技術(shù)來研究微生物群落結(jié)構(gòu)及基因組信息，如16SrRNA測序[4，12]和宏基因組學(xué)等技術(shù)[13-16]。

三、人體微生物組的功能

隨著經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展和社會(huì)進(jìn)步，人類的疾病譜發(fā)生了急劇變化，從以傳染病為主逐漸變?yōu)閭魅静『吐圆〔⒅?，甚至是慢性病更多地威脅著人類健康。這與人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化有很大關(guān)系。如何防治慢性病，維護(hù)人類健康是急需解決的重大科技問題。研究證明，與人體共生的微生物菌群對(duì)人體健康狀態(tài)作用重大，其結(jié)構(gòu)失調(diào)與多種慢性病的發(fā)生相關(guān)。2012年華大基因發(fā)表了糖尿病人和健康人腸道菌群差異的大規(guī)模測序結(jié)果；2014年浙江大學(xué)的Qin等人發(fā)表了肝硬化病人腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征[17]；王婷婷等人研究了結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中腸道菌群的變化規(guī)律[18]。這些研究結(jié)果都說明腸道微生物結(jié)構(gòu)的變化和失調(diào)影響人體健康。

(一)與人體代謝的關(guān)系

隨著宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，人體微生物的功能基因逐漸被發(fā)掘出來。2006年Steven等人[19]采用鳥槍測序法對(duì)人體腸道微生物組進(jìn)行宏基因組測序分析，與同源基因信息庫(COG)對(duì)比結(jié)果表明，腸道微生物基因組中富含許多人體自身不具備但卻是生命活動(dòng)所需的參與碳水代合物、甲烷生成、氨基酸、維生素和短鏈脂肪酸代謝有關(guān)的基因。一項(xiàng)基于多組學(xué)的系統(tǒng)分析表明腸道菌群失調(diào)對(duì)兒童遺傳和單純性肥胖都有重要的病因貢獻(xiàn)[20]。Gosalbes等人[21]采用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)10名健康志愿者的腸道微生物進(jìn)行功能探索，發(fā)現(xiàn)腸道功能活性微生物的主要菌種的功能主要包括了碳水化合物代謝、能量轉(zhuǎn)換及細(xì)胞組分的合成。這些研究都表明了腸道微生物是人體代謝的重要參與者。

(二)對(duì)人體生理功能的調(diào)控

人體微生物是人體代謝的重要參與者，不但能為人體的代謝提供底物、酶和能量，還參與維生素的合成[22]、將難消化的食物成分發(fā)酵成可吸收的代謝物、去除有毒化合物，其產(chǎn)生的代謝物還能促進(jìn)人上皮細(xì)胞的生長和分化。微生物代謝物，如短鏈脂肪酸除了為人提供能源外，還能促進(jìn)血管舒張和腸道蠕動(dòng)、幫助上皮組織傷口愈合、作用于中性粒細(xì)胞等抑制炎癥的產(chǎn)生[23]，或作用于分泌細(xì)胞來增加胰島素的分泌。微生物的代謝物還能間接影響大腦的認(rèn)知功能[24，25]。研究人員在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物與先天免疫系統(tǒng)的相互作用是影響I型糖尿病的發(fā)生的關(guān)鍵表觀遺傳因素[26]；腸道微生物還可以改變膽汁酸在人體的循環(huán)過程，調(diào)節(jié)脂肪和葡萄糖代謝，影響人體血清代謝組和胰島素敏感性[27]，影響II型糖尿病的發(fā)病。

(三)對(duì)人體免疫能力的作用

人們的免疫系統(tǒng)能識(shí)別和消滅外來病原菌，但卻允許體內(nèi)共生微生物的存在。微生物在與人體共同進(jìn)化的幾百萬年時(shí)間里已經(jīng)與人體的免疫系統(tǒng)形成了密切關(guān)系，能通過對(duì)有限營養(yǎng)物質(zhì)的直接競爭和宿主免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)等機(jī)制保護(hù)人體免受外來病原體和潛在有害的體內(nèi)微生物的定殖[28]。MBL缺乏的慢性阻塞性肺病患者的肺微生物群多樣化程度高，更不容易被嗜血桿菌定植，氣道炎癥水平較低[29]。腸道微生物與腸黏膜免疫系統(tǒng)的形成有關(guān)。研究表明，嬰兒早期共生微生物定殖能促進(jìn)上皮內(nèi)淋巴T細(xì)胞的發(fā)育[30]，微生物菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)異常[31-33]，增加患食物過敏、腸道炎癥性疾病(IBD)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或I型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。

四、人體微生物組的應(yīng)用

(一)人體微生物群落重建

大量的研究表明，腸炎癥性疾病患者腸道微生物群與健康個(gè)體相比發(fā)生了顯著變化。人們通過對(duì)人體微生物組及功能的研究和臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，特定的細(xì)菌能影響宿主多種代謝通路的發(fā)育，包括炎癥和抗炎反應(yīng)。不同的共生微生物定殖會(huì)影響宿主患感染或自身免疫病的可能，共生微生物種群組成對(duì)維持宿主健康狀態(tài)很重要，一些共生菌群有防止炎性腸病的作用[31，34]。尋找合適的共生微生物組合，幫助它們?cè)谌松砩线M(jìn)行定植是治療某些目前無法治愈的多種疾病的新思路。通過確定在宿主出生時(shí)定植的共生菌組合，可以提高宿主早期抗感染的能力并可以防止自身免疫病的發(fā)生[35]。

(二)開發(fā)以腸道菌群為靶點(diǎn)的醫(yī)藥、食品及保健品

中醫(yī)有以糞便入藥的作法，2015年Xu等人通過隨機(jī)雙盲及安慰劑對(duì)照的臨床試驗(yàn)證實(shí)“葛根芩連湯”對(duì)糖尿病有顯著療效，并提供分子水平的證據(jù)證明該中藥可能是通過調(diào)整菌群結(jié)構(gòu)發(fā)揮藥效[36]。從人體微生物組定殖規(guī)律的研究中不難發(fā)現(xiàn)，人們微生物組的結(jié)構(gòu)與寄主代謝密切相關(guān)。人的年齡、生活和飲食習(xí)慣[37]、健康狀態(tài)、遺傳因素、情緒狀態(tài)及是否接受抗菌治療都會(huì)對(duì)共生的微生物群落產(chǎn)生影響，微生物群落結(jié)構(gòu)又影響宿主健康狀態(tài)。微生物與宿主間存在相互作用關(guān)系[23，38，39]，雖然微生物之間以及微生物與人體之間的許多相互作用關(guān)系還不明確，但是基于目前研究，人們發(fā)現(xiàn)菌群的構(gòu)成和代謝可被飲食調(diào)控，科學(xué)和臨床實(shí)驗(yàn)有大量證據(jù)表明，一些益生菌[40]、益生元和合生元對(duì)人體健康有很大作用。一種被稱為VSL3的多益生菌制劑具有治療結(jié)腸炎的效果。益生元是一種食品級(jí)的非生物材料，能促進(jìn)人體內(nèi)益生菌的增殖。在一種toll樣受體7依賴的系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型上的實(shí)驗(yàn)表明，飲食抗性淀粉可以改善由羅伊乳桿菌引起的自身免疫病[41]。一項(xiàng)針對(duì)Prader-Willi綜合癥(PWS)和單純性肥胖兒童的住院干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，富含非消化性碳水化合物的飲食可顯著減輕體重并伴隨腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變，同時(shí)減輕炎癥[20]?；ㄇ嗨豰alvidin 3-葡萄糖苷可以通過調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞完整性、腸道微生物群以及主要炎癥介質(zhì)而改善腸道炎癥。合生元是益生菌和益生元的組合，F(xiàn)urrie等人對(duì)18名潰瘍性結(jié)腸炎患者進(jìn)行為期1個(gè)月的聯(lián)合使用益生菌，和益生元治療潰瘍性結(jié)腸炎的隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn)，證明合生元的使用減輕了炎癥，健康的上皮組織再生明顯[42]。

五、討論和展望

人體微生物組對(duì)共生菌群的分析使疾病模式能夠緊密地與特定微生物或微生物群相聯(lián)系。我們可以通過對(duì)微生物的調(diào)控來影響機(jī)體生理和免疫狀態(tài)，從而對(duì)疾病進(jìn)行有效治療，改善人類健康，延長人類壽命。例如，基于利用微生物組的癌癥免疫療法[43]。近年來，大規(guī)模的宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組、宏代謝組學(xué)研究提供了人體微生物組結(jié)構(gòu)和功能的信息，但對(duì)人體生理代謝重要的微生物功能基因在很大程度上尚未被揭示。就像Lynch等人在一篇綜述中提到的，目前許多工作集中在探索微生物菌群與疾病的因果關(guān)系以及由微生物介導(dǎo)的疾病的致病機(jī)理[44]。如何利用大量的組學(xué)方法獲得的數(shù)據(jù)集提出功能性微生物組的合理假設(shè)，還需要開發(fā)并合理使用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察研究潛在功能基因所產(chǎn)生的效應(yīng)，促進(jìn)功能微生物基因的發(fā)現(xiàn)。我們?cè)趯?duì)特殊部位微生物組進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)，應(yīng)發(fā)展相應(yīng)的微擾方法避免影響關(guān)鍵的生物學(xué)功能。另外，在小鼠上進(jìn)行的一項(xiàng)有關(guān)可溶性膳食纖維的研究結(jié)果表明，在腸道微生物生態(tài)失調(diào)時(shí)進(jìn)補(bǔ)這種傳統(tǒng)意義上的益生元會(huì)增加肝癌風(fēng)險(xiǎn)，提示人們嘗試將微生物組研究知識(shí)和成果應(yīng)用于實(shí)踐的過程中應(yīng)謹(jǐn)慎操作[45]。