代謝組學(xué)在植物多酚類物質(zhì)檢測分析中的應(yīng)用

于淼，王長遠(yuǎn),2，王霞*

1(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶，163319) 2(國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶，163319)

代謝組學(xué)(metabolomics)這一概念在20世紀(jì)70年代被DEVAUX第一次提出[1]，隨后在1999年英國倫敦大學(xué)NICHOLSON教授將其重新定義[2]。代謝組學(xué)又稱代謝物組學(xué)，是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)后出現(xiàn)的新興“組學(xué)”。它能夠?qū)ι矬w內(nèi)相對分子質(zhì)量1 000以內(nèi)的代謝物進行定性和定量的分析。代謝組學(xué)最主要的技術(shù)手段包括質(zhì)譜、氣相色譜、液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrograph，GC-MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)，而目前使用的分析手段多為組合式聯(lián)用型儀器，如超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS)、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)等。依靠其高通量、高靈敏度、檢測范圍廣的特點,可以對因各種外界因素刺激而引起的植物表型變化、生理活動變化以及代謝變化進行檢測分析，通過代謝物的變化探討引起植物出現(xiàn)差異的原因[3]。完整的代謝組學(xué)研究過程，包括樣品采集、代謝物提取、代謝物分離、代謝物檢測和數(shù)據(jù)分析，要求盡可能地保留代謝物信息。代謝組學(xué)的研究方法主要分為非靶向代謝組學(xué)分析和靶向代謝組學(xué)分析[4]。二者研究目的不同，各有特點。在實際運用中，通常在前者發(fā)現(xiàn)差異代謝物之后，再利用后者進行進一步的確證，常常結(jié)合使用，優(yōu)勢互補。

植物多酚是植物中一類化學(xué)物的總稱，其作為人體“第七類營養(yǎng)素”廣泛存在于植物性食物中，人體不能通過自身合成，需從食物中獲取[5]。多酚類化合物作為植物代謝過程中的次生代謝物，已經(jīng)被分離鑒定出八千多種，是自然界最常見的一大類植物活性物質(zhì)[6]。因其種類繁多，結(jié)構(gòu)不盡相同，通?？蓪⒍喾臃譃轭慄S酮類(flavonoids)、酚酸類(phenolic acids)、芪類(stilbenes)以及木脂素類(lignans)，這些結(jié)構(gòu)上的差異導(dǎo)致其生物利用率、功能活性也均存在差異。研究表明，多酚類物質(zhì)作用于人體的生理功能主要包括抗氧化[7]、抗炎[8]、抗癌[9]、降血脂[10]、降血糖[11]等。隨著人們對天然產(chǎn)物的開發(fā)利用，對多酚類物質(zhì)的研究也將更為深入，挖掘其更多的功能活性作用。

因植物中的多酚類物質(zhì)易受品種、種植條件、儲藏條件、加工過程等方面的影響，從而導(dǎo)致其功能活性也發(fā)生變化，所以依靠代謝組學(xué)技術(shù)對植物中多酚類物質(zhì)的檢測分析能夠幫助人們建立代謝物與功能活性變化的聯(lián)系。本文主要論述了代謝組學(xué)作為一種工具在植物多酚定性定量，植物食品質(zhì)量、種類篩選、加工貯藏及其功能活性方面的應(yīng)用研究。

1 代謝組學(xué)技術(shù)在多酚定性定量檢測中的應(yīng)用

代謝組學(xué)技術(shù)在植物多酚定性定量分析方面占據(jù)主導(dǎo)地位，目前主要應(yīng)用在果蔬、雜糧、茶葉、油脂等植物源性食品方面[12-17]，通過高通量的檢測和開放式數(shù)據(jù)庫，可以對植物中多酚類物質(zhì)進行定性和定量，還可以發(fā)現(xiàn)新型多酚類物質(zhì)，有助于對植物多酚領(lǐng)域的深入研究。謝佳函等[18]利用HPLC技術(shù)將經(jīng)過超聲輔助提取的紅豆皮多酚進行定性分析，通過與各標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時間相比對，最終定性了金絲桃苷、沒食子酸、蘆丁等13種單體酚，其中主成分峰對應(yīng)的物質(zhì)是金絲桃苷。胡會剛等[19]采用液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜(liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，LC-Q-TOF-MS)對經(jīng)過分離純化的芒果皮渣多酚組分進行初步定性分析，共檢測出與已知數(shù)據(jù)庫相對應(yīng)的17個色譜峰，其中正離子模式下為槐角苷等3種多酚化合物，負(fù)離子模式下為6-O-沒食子酰葡萄糖等14種多酚化合物。鄒夢瑜等[20]進行了葡萄酒中多酚類化合物的體內(nèi)外成分分析，使用了高效液相色譜-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry，HPLC-FT-ICR MS)和超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)鑒定了葡萄酒多酚提取物中的41種酚類化合物和灌胃入血后的9種多酚原型及代謝物，并利用UPLC快速、靈敏的特點，對這9種潛在活性物質(zhì)基礎(chǔ)成分進行了含量測定，但具體探究其功能活性的機制還有待研究。張云[21]和焦陽[22]分別研究了獼猴桃果實及其種植中的副產(chǎn)物獼猴桃疏果，分別運用高速逆流色譜(high-speed countercurrent chromatography, HSCCC)與制備型高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)聯(lián)用技術(shù)和超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-QQQ-MS/MS)。前者通過篩選建立的HSCCC溶劑體系對純化后獼猴桃多酚提取物具有較好的分離效果，基于此分離出一種非常罕見的酚酸類結(jié)構(gòu)：2-O-咖啡?；K糖酸；后者成功實現(xiàn)了在22 min運行時間內(nèi)對15種酚類化合物進行有效的分離和精確定量，從而確定表兒茶酸是獼猴桃疏果中含量最高的多酚化合物，此類方法顯著縮短了測量時間，高效且靈敏。潘匯[23]將荷葉在2種溶劑系統(tǒng)中分離純化的3種多酚進行HPLC檢測分析，結(jié)果表明這3種多酚物質(zhì)分別為紫云英苷、異槲皮苷和槲皮素。

代謝組學(xué)技術(shù)在植物多酚定性定量分析中的應(yīng)用逐漸增多，相比于氣相色譜和液相色譜靈敏度更高，對于多酚物質(zhì)的定性更準(zhǔn)確。通過組學(xué)平臺雖然可以對多酚類物質(zhì)進行檢測，但多樣化的檢測儀器所得到的檢測結(jié)果也是不同的，而且對于植物樣本的前處理也沒有規(guī)范的方法，所以目前急需建立系統(tǒng)性的多酚高通量檢測平臺，規(guī)范植物樣本前處理的方法，形成完整檢測分析體系。

2 代謝組學(xué)技術(shù)定性定量多酚的應(yīng)用

2.1 定性定量多酚在不同加工方式研究中的應(yīng)用

日常生活中植物性食品通常會經(jīng)過不同方式的處理被加工成食物，以提升其食用品質(zhì)。多酚類物質(zhì)不穩(wěn)定，如加熱可導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)受到破壞，降低其功能性質(zhì)。而在發(fā)酵中多酚可促進有益菌的生長，抑制有害菌的繁殖等，此過程中多酚的含量會發(fā)生變化或被轉(zhuǎn)化成其他類物質(zhì)等。植物食品在不同加工過程中多酚物質(zhì)的含量和結(jié)構(gòu)均會發(fā)生改變，進而影響其功能作用。通過代謝組學(xué)手段可以對多酚物質(zhì)進行檢測，從而分析不同處理方式下多酚的變化情況。ZHAO等[24]將光電二極管陣列檢測器(photo-diode array, PDA)和質(zhì)譜儀與超高效液相色譜結(jié)合使用，研究了烘烤，煮沸和微波處理方法對藍(lán)莓中多酚的影響。在藍(lán)莓中發(fā)現(xiàn)了28個特征峰，其中25個峰受烹飪的影響很大，咖啡酰奎尼酸、兒茶素和槲皮素糖苷在加工中最穩(wěn)定，該研究比較得出微波烹飪對多酚類物質(zhì)的影響最大。LONG等[25]為研究堆發(fā)酵過程中茶葉活性物質(zhì)的變化，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)，通過非靶向代謝組學(xué)分析表明，堆發(fā)酵的第一階段使黃酮-3-醇和沒食子酸的含量降低。靶向代謝組學(xué)分析表明，在堆發(fā)酵第一階段之后，葛根素(N-乙基-2-吡咯烷酮取代的沒食子兒茶素和兒茶素)的含量顯著增加，但是長期的堆發(fā)酵會使黃酮糖苷，原花青素和沒食子酸的水平明顯降低。姜麗等[26]的研究采用氣相-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(GC-TOF-MS)對傳統(tǒng)曲和新基質(zhì)曲釀造的黑糯米酒進行差異代謝物的分析，并對發(fā)酵72 h內(nèi)的黑糯米酒進行了跟蹤研究，發(fā)現(xiàn)苯酚為2種曲釀酒后差異最大的物質(zhì)，并在發(fā)酵60 h時，代謝物積累量最大且差異代謝物數(shù)目最多。ERICA等[27]利用核磁共振對酵母菌發(fā)酵的蘋果酒的生產(chǎn)過程進行實時監(jiān)測，代謝譜的研究中發(fā)現(xiàn)酵母菌種類不同對表兒茶素、兒茶素等酚類物質(zhì)的種類及含量均有影響，為蘋果酒生產(chǎn)中涉及的酵母種類之間的代謝差異提供了初步見解。張靈敏等[28]利用HPLC建立了快速有效的多酚定量分析方法，確定了3個釀酒葡萄品種中的16種單體酚含量，從多酚成分含量角度對釀酒葡萄進行評價提供了依據(jù)。PINTO等[29]將頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜(HS-SPME-GC/MS)相結(jié)合和質(zhì)子核磁共振(1H NMR)光譜研究了霞多麗葡萄在橡木桶中儲存時間對多酚類物質(zhì)變化的影響，發(fā)現(xiàn)了多酚變化與葡萄酒褐變的關(guān)系。

2.2 定性定量多酚在品種、產(chǎn)地區(qū)分中的應(yīng)用

每種植物都有不同的品種，而且種植范圍廣，不同的品種和產(chǎn)地導(dǎo)致植物中多酚類物質(zhì)產(chǎn)生差異。如市售的不同品種的蘋果，顏色外觀，口味營養(yǎng)各不相同，這些差異與多酚的種類與含量密不可分。通過代謝組學(xué)手段可以對多酚物質(zhì)進行檢測，從而分析不同品種、產(chǎn)地的植物產(chǎn)品中多酚的差異情況。FRANCINI等[30]利用1H NMR技術(shù)結(jié)合主成分分析(principal component analysis, PCA)，對不同品種的蘋果干中的多酚類物質(zhì)進行研究分析，發(fā)現(xiàn)了蘋果干中兒茶素、表兒茶素、綠原酸等活性物質(zhì)及其抗氧化能力是區(qū)別其品種的判斷依據(jù)。ALESSIO等[31]為區(qū)別不同產(chǎn)地的特級初榨橄欖油，對多個樣品進行了分析目標(biāo)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和綜合二維氣相色譜-質(zhì)譜(GC/GC-TOF-MS)的非目標(biāo)譜分析，發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)地的橄欖油之間在多酚的特征方面的差異是顯著的。對不同產(chǎn)地植物性食品中的多酚類物質(zhì)進行代謝組學(xué)分析有助于建立成熟的食品溯源體系[32-33]。KASHIF等[34]使用PCA和偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)等相關(guān)多元數(shù)據(jù)分析與1H NMR相聯(lián)系對3個品種的葡萄的4個發(fā)育階段進行多變量數(shù)據(jù)分析以識別總體代謝差異，發(fā)現(xiàn)“Trincadeira”較其他2個品種酚類含量低，并且此類葡萄發(fā)育初始階段顯示出較高的酚類含量，這在生理學(xué)上增加了人們對葡萄生長發(fā)育的理解。

2.3 定性定量多酚在品質(zhì)、等級區(qū)分中的應(yīng)用

多酚類物質(zhì)的種類和含量對植物性食品的風(fēng)味和品質(zhì)具有重要影響，也逐漸成為評價和衡量植物食品等級的重要指標(biāo)之一。通過代謝組學(xué)手段可以對多酚物質(zhì)進行檢測，從而分析不同品質(zhì)、等級下多酚的變化情況。在茶葉中，人們通常會忽略除兒茶素和黃酮醇以外的多酚對茶澀性的影響。ZHUANG等[35]使用液相色譜-質(zhì)譜法,通過靶向代謝譜分析評估了多酚的貢獻，從47種綠茶樣品中鑒定出86種多酚，其澀味評分各不相同，結(jié)果表明，多酚的單羥基黃酮醇和?；苌锱c除沒食子酸和兒茶素以外的多酚呈負(fù)相關(guān)，與其他多酚呈現(xiàn)明顯的分離，反映出此類物質(zhì)多茶澀味的獨特作用。郭雪梅[36]采用HPLC對8個不同等級的祁門紅茶進行多酚定量分析，發(fā)現(xiàn)高等級紅茶中,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)明顯高于低等級，同時通過高分辨質(zhì)譜(LC-LTQ-Orbitrap)對不同等級紅茶樣品進行非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析，在多元統(tǒng)計分析方法下從不同等級的紅茶中共篩選出17個差異代謝物，通過相關(guān)性分析最終確定3個代謝物作為判斷紅茶等級的標(biāo)準(zhǔn)物。

通過代謝組學(xué)的方法可對加工后的植物食品中的多酚物質(zhì)進行檢測，探討不同處理對多酚含量和結(jié)構(gòu)的影響。品種和產(chǎn)地的不同，導(dǎo)致植物中多酚含量存在差異，反之通過對多酚物質(zhì)的檢測分析，可將不同品種和不同產(chǎn)地的植物產(chǎn)品進行區(qū)分。對于品質(zhì)的差異也可以用多酚的含量與種類進行區(qū)分。但目前這些研究僅停留在代謝物含量的分析上，對于出現(xiàn)差異的機理研究并不多，關(guān)于代謝通路的分析也較少，代謝途徑的分析將更全面的解釋這些現(xiàn)象。

2.4 定性定量多酚在多酚功能活性研究中的應(yīng)用

植物多酚具有較好的功能活性，對于疾病的預(yù)防和治療有很好的功效，目前多酚的功能活性主要體現(xiàn)在抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂方面。通過動物實驗對多酚功能活性的研究較多，體內(nèi)實驗的研究將多酚在臨床治療、保健藥品、食品的推廣趨向于安全化、可應(yīng)用化,也提升了多酚的應(yīng)用價值。SEVERINA等[37]對來自意大利坎帕尼亞地區(qū)的鼠尾草葉應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS)進行定性和定量分析，并首次發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素寡聚物，此類物質(zhì)對抑制AChE酶能力較強，為評估“坎帕尼亞”鼠尾草在動物模型中預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了可能性。與此類似的還有漿果多酚對人體代謝的貢獻[38]。蘇天霞等[39]通過高效液相色譜法,在獼猴桃皮多酚中發(fā)現(xiàn)了原兒茶酸、表兒茶素、七葉亭等多酚類物質(zhì)，并對脂代謝紊亂的小鼠進行代謝分析，發(fā)現(xiàn)此類多酚物質(zhì)具有正向調(diào)控的作用。CHANG等[40]通過代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黑豆種皮中的花青素可以降低PGE2、NO以及抑制大鼠中COX-2和iNOS基因的表達而發(fā)揮抗炎癥活性。MA等[41]利用LC-MS/MS技術(shù)分析了假木霉和黑根霉混合培養(yǎng)發(fā)酵液對獼猴桃根際土壤處理后,對其貨架期和果實品質(zhì)的影響。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，在采摘后室溫(25℃)儲藏條件下,0、10、15 d不同程度地提高了總酚含量，混合培養(yǎng)發(fā)酵液處理改變了幾種類黃酮代謝物，對延長保質(zhì)期和改善水果質(zhì)量有幫助。湯小芳[42]利用超高液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)代謝組學(xué)分析手段，對EGCG干預(yù)下的衰老小鼠的血清、尿液、腸道、腦組織進行代謝組學(xué)研究，通過差異代謝物的篩選及代謝通路的分析，最終發(fā)現(xiàn)了與EGCG抗衰老作用有關(guān)的代謝通路及相應(yīng)代謝物。

目前研究已經(jīng)證實了植物多酚的許多功能活性，通過代謝組學(xué)的方法可以對不同功能活性的多酚進行檢測分析，探究關(guān)鍵代謝物及其作用機理，證實多酚單體具有的功能活性，但仍然需要利用尖端的儀器設(shè)備進行解析，并逐漸完善分析體系。另外，由于植物多酚中的結(jié)合態(tài)酚的提取和鑒定操作繁瑣，在研究多酚功能活性中，代謝組學(xué)技術(shù)主要集中在對游離酚的檢測分析上。未來應(yīng)進一步研究不同多酚單體的功能評價，以更好地提升多酚的應(yīng)用價值。

3 多組學(xué)技術(shù)在多酚功能活性研究中的應(yīng)用

在對多酚功能活性的研究中，一些植物多酚如白藜蘆醇、EGCG、迷迭香多酚、姜黃素等所表達的抗腫瘤活性逐漸引起人們的注意[43]。代謝組學(xué)技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)多酚類物質(zhì)的更多功能活性成分，但對多酚類物質(zhì)的抗腫瘤活性的研究則需要其他組學(xué)技術(shù)和細(xì)胞實驗技術(shù)的支撐，所以應(yīng)用多組學(xué)技術(shù)對多酚類物質(zhì)功能活性的研究正在逐漸展開。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以從腫瘤信號傳導(dǎo)途徑、腫瘤細(xì)胞凋亡等多方面闡明這些活性的產(chǎn)生與癌細(xì)胞體內(nèi)蛋白的差異表達之間的關(guān)系，在多酚的功能活性研究中同樣發(fā)揮著重要的作用。ZHANG等[44]的研究為確定EGCG對人體肝細(xì)胞癌的作用及其分子機制，通過二維凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)分析得知，EGCG有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制人體肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力，其抗轉(zhuǎn)移作用與抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9活性有關(guān)。MENORET等[45]經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)、LC-MS/MS分析發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的細(xì)胞周期的作用，肌動蛋白、Hsp60等均受到白藜蘆醇的影響。也有研究者將代謝組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合使用，利用GC-MS及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測分析手段研究了迷迭香多酚提取物和鼠尾草酸對HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和膽固醇代謝的影響。研究表明在迷迭香多酚和鼠尾草酸處理下，HT-29細(xì)胞激活了調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄活性，在脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用。迷迭香多酚處理可誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞中以活性氧產(chǎn)生和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下UPR信號通路協(xié)調(diào)為主導(dǎo)的相關(guān)代謝和轉(zhuǎn)錄變化[46]。

單一的組學(xué)技術(shù)因其本身技術(shù)的局限，只能從特定的角度分析植物多酚的作用機理，目前多組學(xué)聯(lián)用在植物多酚研究中仍鮮有報道，且均為多酚類物質(zhì)抗腫瘤活性的研究。對于多酚類物質(zhì)更多功能活性的研究必須進行體外細(xì)胞實驗和小鼠等模型的體內(nèi)實驗，代謝組學(xué)僅是眾多研究平臺中的一部分，多組學(xué)平臺聯(lián)用將會對植物多酚功能活性的具體、清晰、完整的作用機制研究提供更多可能。

4 總結(jié)與展望

隨著組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，代謝組學(xué)技術(shù)將在植物多酚檢測分析中發(fā)揮越來越重要的作用，此類技術(shù)在幫助人們了解植物中化學(xué)成分，并在動態(tài)中把握成分變化及其帶來的影響等方面具有重要指導(dǎo)意義。在研究植物性食品的不同品種產(chǎn)地、加工貯藏方式下，可以找出關(guān)鍵的代謝物質(zhì)及代謝途徑中的關(guān)鍵節(jié)點，可以從更深的角度去闡明代謝物的變化，以及此變化對功能活性、感官品質(zhì)、機體健康所帶來的影響。目前對于植物多酚類物質(zhì)的功能活性研究大多是在宏觀意義上的，鮮有對具體多酚物質(zhì)的研究。利用代謝組學(xué)技術(shù)可以在探究植物的功能活性上準(zhǔn)確找出關(guān)鍵的多酚類物質(zhì)。目前代謝組學(xué)仍屬于一種具備潛力、尚待開發(fā)的新興學(xué)科領(lǐng)域，同時也有很多因素制約了代謝組學(xué)在食品科學(xué)方面的應(yīng)用。同時，因其發(fā)展時間較短，存在著樣品分析結(jié)果不穩(wěn)定、儀器分析范圍有局限等問題，又因數(shù)據(jù)庫不完善等原因，導(dǎo)致僅有一部分的代謝產(chǎn)物能夠被識別，未識別的代謝產(chǎn)物仍占比巨大。如何將各種實驗技術(shù)和多組學(xué)平臺結(jié)合起來，對多酚類物質(zhì)的功能活性進行深入研究，以上述存在的問題。