枯草芽孢桿菌生產(chǎn)β-丙氨酸的基因工程菌構(gòu)建及其優(yōu)化研究

周潔靜

（崇左市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧崇左 532200）

β-丙氨酸是非蛋白氨基酸[1]，不僅是一種醫(yī)藥中間體，可以作為維生素B5、泛酸鈣、胍基丙酸和肌肽等藥物的原材料，還可以作為食品添加劑，改善食物味道，提高產(chǎn)品質(zhì)量。β-丙氨酸在機體的糖酵解過程中參與輔酶A的合成，而輔酶A在機體中能夠起到激活機體免疫力的功能[2]，促進機體結(jié)締組織的修復(fù)和形成。β-丙氨酸一般采用化學(xué)方法合成，但這種方法生產(chǎn)的β-丙氨酸中含有大量的無機鹽雜質(zhì)，純度低，純化后去掉雜質(zhì)產(chǎn)量更低[3]。

β-丙氨酸的合成專利在國外，國內(nèi)使用β-丙氨酸時需要負擔一部分專利費用，在大量使用的情況下成本投入也高，運用構(gòu)建工程菌的方式生產(chǎn)β-丙氨酸，能夠降低污染，降低成本，雖前期構(gòu)建工程菌用時長，但工程菌構(gòu)建成功后，后期只需投入細菌生長所需要的營養(yǎng)，憑借細菌生命周期短但繁殖速度快的特點，就能夠得到源源不斷的目的產(chǎn)物。根據(jù)工程菌種的不斷優(yōu)化應(yīng)用，隨著產(chǎn)能的不斷提升，經(jīng)濟效益也能進一步的提高。

基因工程菌生產(chǎn)氨基酸有較多的優(yōu)勢，比如目的性強，工作量小，局限性不多。具體應(yīng)用時是利用DNA重組技術(shù)，對基因進行定向誘變，然后選擇和培育我們需要的基因工程菌。就目前來說，可以利用基因工程菌合成L-色氨酸及其衍生物， L-蘇氨酸， L-異亮氨酸等。

枯草芽孢桿菌可以在特定條件下產(chǎn)生芽孢，是革蘭氏陽性菌，菌落表面粗糙，繁殖速度快，具有鞭毛，顯微鏡下觀察有活動能力[4]。因為枯草芽孢桿菌可以在極端條件下，誘導(dǎo)產(chǎn)生芽孢，抗逆性很強，而且芽孢可以表達許多酶類和生長因子等多種蛋白，所以可應(yīng)用在基因工程菌方面。其作為基因工程受體菌，可表達出近200種原核和真核生物來源的蛋白基因，所以應(yīng)用比較廣泛。

1 材料與儀器

1.1 試劑

枯草芽孢桿菌，歐科拜克生物科技股份有限公司；大腸桿菌，上海魯微科技有限公司；質(zhì)粒，愛迪基因；載體和引物為自行設(shè)計，由上海生物工程公司合成發(fā)回；限制性核酸內(nèi)切酶，上海聯(lián)邁生物工程有限公司生產(chǎn)；熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，威海同豐海洋生物科技有限公司生產(chǎn)；T4DNA連接酶，北京百奧萊博科技有限公司；膠回收試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒Maker蛋白Maker和DNA檢測Maker，上海代軒生物科技有限公司；DNA提取試劑盒、buffer（Mg2+）和DNTp，上海生物工程公司生產(chǎn)；蛋白胨、營養(yǎng)瓊脂，分析純，廣東環(huán)凱微生物工程有限公司；酵母膏，分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；NaCl，分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司；蒸餾水。

1.2 培養(yǎng)基配方

蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化鈉10 g、瓊脂20 g，用可溶性淀粉調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，蒸餾水定容至1000 mL。

1.3 儀器

0.1 ～2.5 μL移液槍、0.5～10 μL移液槍，Eppendorf；ULPHW-I型ULPHW超低有機物（TOC）超純水機，四川優(yōu)普超純科技有限公司；LDZM-40KCS型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；veriti96PCR儀，美國ABI；DYCZ-24KF型四板垂直電泳儀，北京六一生物科技有限公司；HH-2恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；S-450D型細胞超聲波破碎儀，美國BRANSON；VM200型漩渦振蕩儀，托摩根生物科技有限公司；DCW-3510臥式低溫恒溫槽，上海左樂儀器有限公司。

2 工程菌構(gòu)建過程

2.1 引物設(shè)計與反應(yīng)體系

用primer5.0設(shè)計能夠擴增出panD基因的引物，用細菌DNA提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，反應(yīng)體系50 μL：模板2 μL、上下引物各1.5 μL、10 倍 Buffer（Mg2+）5.5 μL、dNTPs 2 μL、Taq 酶 0.5 μL、超純水 37 μL。

將混合體系放入PCR擴增儀中進行擴增，溫度設(shè)置為：預(yù)變性95℃，5min；變形94 ℃，30 s；退火58 ℃，30 s，30個循環(huán)；延伸72 ℃，30 s；終延伸72 ℃，10 min；保存 4 ℃；

2.2 檢測回收與篩選

進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒回收panD片段，將回收的片段與3種載體分別連接，并制備好大腸桿菌的感受態(tài)細胞。為了將3種重組構(gòu)建載體和片段的連接物成功轉(zhuǎn)移至大腸桿菌內(nèi)，需提前制備好LB培養(yǎng)基滅菌冷卻后，在無菌條件下最大程度上接種2%的菌液，經(jīng)過培養(yǎng)箱培養(yǎng)后通過藍白斑篩選法篩選出成功轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落，挑取菌落，再次進行PCR驗證，用試劑盒提取其中的質(zhì)粒進行測序[5]。

2.3 工程菌構(gòu)建

實驗中選取Hind Ⅲ和EcoR I兩個酶切位點分別對質(zhì)粒和表達載體進行雙酶切，使表達載體和細菌質(zhì)粒具有相同的末端，并用T4噬菌體連接酶連接[6]。將構(gòu)建好的基因表達載體導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi)，得到能夠產(chǎn)生β-丙氨酸蛋白的工程菌。

2.4 工程菌優(yōu)化

對枯草芽孢桿菌中提取的目的基因進行優(yōu)化，主要針對其密碼子panD進行序列優(yōu)化，提高目的片段和大腸桿菌的融合度[7]。相應(yīng)提升目的基因的表達和擴增速度，PCR擴增時設(shè)計程序由40 s改為30 s，隨著試劑和儀器的更新，縮短反應(yīng)體系時間也不會對反映效果造成影響[8]。一套反應(yīng)結(jié)束能有15 min的結(jié)余，節(jié)省了時間，提高了工作效率。

2.5 蛋白表達

得到工程菌后應(yīng)立即檢驗β-丙氨酸是否能夠進行正常表達，菌液接種培養(yǎng)基后，37 ℃條件下，設(shè)置搖床以180 r/min的速度對菌液進行搖床震蕩培養(yǎng)。每隔一段時間對菌液進行檢測，當菌液檢測OD值達到0.5左右時停止培養(yǎng)，向培養(yǎng)基中加入IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)隔夜。收集繁殖后的菌體，用超聲破碎儀進行細菌的細胞破碎，隨后通過超速離心得到上清液和沉淀物，用SDS-PAGE進行目的蛋白的檢測。也可以選擇將重組菌液直接接種于自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30 ℃左右培養(yǎng)過夜。經(jīng)過誘導(dǎo)之后的菌液中加入10 mL L型天冬氨酸在相同的條件下進行培養(yǎng)和全細胞轉(zhuǎn)化，1 h后取1 mL菌樣加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液0.1 mL終止反應(yīng)。

3 結(jié)果與分析

取800 μL樣品，根據(jù)試劑說明書要求，加入A、B衍生劑，旋渦震蕩儀震蕩3 min，靜置45～60 min，用等體積的正丁醇對轉(zhuǎn)化的菌液進行萃取，萃取后的液體用HPLC的方法檢測β-丙氨酸。

本實驗通過上述方法一共構(gòu)建了3種工程菌，3種工程菌進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)一號重組工程菌的表達量最差，可溶性最低；2號重組工程菌可溶性最好，表達量較差；3號工程菌可溶性一般，表達量最高。從三種工程菌的表達量和可溶性的差異性來分析原因可能是：（1）不同載體和枯草芽孢桿菌的目的基因親和力有差異。（2）某些載體上自帶的蛋白標簽對重組蛋白的表達途徑產(chǎn)生阻礙作用。（3）工程菌受體和構(gòu)建的基因表達載體融合度不夠，導(dǎo)致表達量較少。

本實驗對工程菌的最初構(gòu)造目的就是能夠得到大量的β-丙氨酸,故在做篩選時目的蛋白的表達量是首要考量，雖然3號菌種的可溶性稍差一些，但是綜合考量下，目前情況下第三種工程菌為最優(yōu)選擇。

4 結(jié)論

本實驗通過構(gòu)建工程菌的方式來生產(chǎn)β-丙氨酸，在降低了污染，保護了環(huán)境的同時也降低了投入成本。雖然前期構(gòu)建工程菌時的篩選選育等過程用時長，但工程菌構(gòu)建成功后，后期只需投入細菌生長所需要的營養(yǎng)，憑借細菌生命周期短但繁殖速度快的特點，就能夠得到源源不斷的目的產(chǎn)物。這種產(chǎn)能方式能夠與機械化流程相結(jié)合，節(jié)省人工成本，高效獲得目的產(chǎn)物，根據(jù)工程菌種的不斷優(yōu)化應(yīng)用，產(chǎn)能不斷提升，經(jīng)濟效益能夠有進一步的提高。