基于可注射泊洛沙姆原位凝膠的響應面法制備研究

許寧俠，班滕，邢凱，徐明宇

（西安外事學院醫(yī)學院，陜西西安 710077）

原位凝膠作為一種新型的藥物載體，以其優(yōu)良的環(huán)境響應性、生物相容性及藥物負載特性而廣泛應用于生物醫(yī)學、臨床醫(yī)學、智能農(nóng)業(yè)等多種領域[1-2]。泊洛沙姆是研究較為深入的一種制備材料，其主要機制是在臨界膠束溫度下，疏水性嵌段脫水，在水溶液中相互纏結(jié)而發(fā)生膠凝作用。但單純的泊洛沙姆凝膠響應溫度較寬、機械強度較小，不能滿足實際需要。目前可采取將泊洛沙姆P407和P188合用的方法，制備高響應性凝膠[3]。原位水凝膠因具有環(huán)境響應，與作用部位具有較優(yōu)良的形態(tài)契合性，如治療老年性膝關(guān)節(jié)炎時，將原位溫度敏感性凝膠作為治療材料，在關(guān)節(jié)部位形成契合度較高的人工軟骨，既能起到支撐作用，還能作為關(guān)節(jié)炎疾病治療藥物的載體。原位溫敏性水凝膠的凝膠化時間是影響其臨床應用的關(guān)鍵特性，而制備材料的濃度及組成是凝膠時間的主要因素。本實驗利用泊洛沙姆P407和P188為基材，同時以卡波姆941為粘附劑，通過響應面設計方法，以凝膠時間為目標，對3種制備材料的濃度進行優(yōu)化研究，以期獲得較為敏感的凝膠化時間。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

泊洛沙姆P188和P407（巴斯夫股份公司，批號：WPAK592B）；卡波姆941（科瑞醫(yī)藥化工有限公司，批號：7514）；其余試劑均為分析純。

SHZ-82恒溫振蕩器（常州國華儀器有限公司）；HJ-3恒溫磁力攪拌器（金壇市新航儀器廠）。

1.2 原位凝膠的制備

稱取泊洛沙姆P407（5 g，8 g，12 g，15 g，18 g，20 g，25 g）和P188(0.5 g，1.0 g，2.0 g，3.0 g，4.0 g，5.0 g，6.0 g)，分別溶于100 mL去離子水中，靜置24 h至充分溶解，配制成不同濃度的溶液；稱取卡波姆941(0.1 g，0.5 g，0.8 g，1.2 g，1.5 g，1.8 g，2.0 g)，溶于100 mL去離子水中于4 ℃攪拌至完全溶解，配制成不同濃度的溶液，完全溶解后，置冰箱中靜置24 h備用。

1.3 凝膠化時間測定

采用倒置法檢測凝膠時間。將泊洛沙姆P407、P188和卡波姆941溶液按不同的比例進行充分混合。將裝有2 mL混合溶液的西林管置于37 ℃恒溫水浴中，觀察混合液的變化。當試管倒置后，溶液不再流動，則認為該溶液已凝膠化，所需的最短時間為此凝膠的凝膠化時間。

1.4 單因素實驗

在進行響應面設計前，先分別考察P407、P188與卡波姆941的濃度改變對膠凝時間的影響。

1.5 響應面設計

以單因素實驗結(jié)果為依據(jù)，根據(jù)Box-Benhnke的中心組合實驗設計原理，采用響應面法[4]，以凝膠化時間為響應值，在三因素三水平上對原位溫敏性凝膠的制備材料濃度進行優(yōu)化。實驗因子和水平見表1。

表1 響應面分析因子及水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

相轉(zhuǎn)變后的凝膠形態(tài)與原位凝膠的應用部位有關(guān)。以泊洛沙姆P407和P188為基本材料，以卡波姆為粘合劑，三種溶液混合后在37 ℃條件下進行膠凝。

2.1.1 P407濃度對凝膠化時間的影響

P407濃度設置為5%、8%、12%、15%、18%、20%和25%，實驗結(jié)果如圖1a所示。隨著P407濃度的增大，凝膠化所需時間減小。當P407濃度為20%，其凝膠時間為120 s左右，而濃度為25%時，其凝膠時間大約為100 s。雖然隨著P407的濃度增加，凝膠的凝膠化時間縮短，但由于凝膠時間過短，影響實驗操作過程，且實驗誤差會增加，因此響應面實驗選擇P407濃度范圍為10%～20%。

2.1.2 P188濃度對凝膠時間的影響

設置P188濃度分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%和6.0%，實驗結(jié)果如圖1b所示。凝膠化時間呈現(xiàn)雙重變化趨勢，即膠凝時間先逐漸減小后又緩慢增加，在濃度為3.5%時，凝膠時間最短，約為420 s。綜合考慮，響應面實驗選擇P188濃度范圍為3%～5%。

2.1.3 卡波姆941濃度對凝膠時間的影響

設置卡波姆941濃度為0.1%、0.5%、0.8%、1.2%、1.5%、1.8%和2.0%，實驗結(jié)果如圖2c所示。凝膠化時間隨著濃度的增加而增加，在濃度為2.0%時，凝膠時間約為200s，而濃度為0.1%時，凝膠化時間約為150 s左右，因此后繼實驗選擇卡波姆941濃度為0.0%～0.2%。

2.2 響應面實驗結(jié)果

按Box-Benhnke設計各水平因素組合及不同濃度下的混合水凝膠的制備方案，以其在37 ℃溫度下凝膠化時間為響應值,結(jié)果如表1所示。

表1 響應面實驗設計及結(jié)果

對實驗數(shù)據(jù)進行ANOVA分析，結(jié)果如表2所示。從表2分析可知，模型的R2為0.002 4，小于0.05，說明本實驗方法是可行的。同時由p-value可知，P407濃度對混合膠的凝膠化時間影響顯著（p＜0.000 1）。二次項對響應值的影響較小，說明因素之間的交互作用較小。圖1為各個因素的交互作用響應面圖的等高線，從響應面的最高點和等高線可以看出，3個因素在所選范圍中均存在極值，其對應的最佳條件為：泊洛沙姆P407濃度20%，泊洛沙姆P188濃度4%，卡波姆941濃度0.15%，凝膠化響應時間為317 s。

圖1 制備材料濃度變化對凝膠化時間的影響

2.3 方法可行性檢驗

為了檢驗方法的可行性，利用響應面分析法所得到的最佳條件進行制備原位凝膠，在37 ℃下測定其凝膠化時間，3次實驗的平均值為300 s，與理論值相差0.56%，說明此響應分析方法對于泊洛沙姆P407、P188及卡波姆941的組成濃度在制備溫度敏感性原位水凝膠的方法是可行的。

表2 響應面ANOVA分析結(jié)果

圖2 各個因子的交互作用響應面圖及等高線

3 結(jié)論

隨著溫度的升高，聚合物鏈中疏水鏈段間的疏水作用增強，而氫鍵作用減弱，聚合物鏈段締合，形成凝膠。本文通過響應面法優(yōu)化了泊洛沙姆P407、P188及卡波姆941的組成濃度，得出制備混合凝膠的最佳濃度，為后續(xù)膝關(guān)節(jié)炎的治療研究提供了理論基礎。