• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小花棘豆Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因的Southern blot檢測(cè)分析

    2020-01-06 07:29:48珠麗盧萍席領(lǐng)軍高峰李玉玲姜?jiǎng)P
    生物化工 2019年6期
    關(guān)鍵詞:泳道內(nèi)生探針

    珠麗,盧萍,席領(lǐng)軍,高峰,李玉玲,姜?jiǎng)P

    (內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010022)

    小花棘豆(Oxytropis glabra DC.)是豆科棘豆屬多年生草本植物,許多植株內(nèi)含生物堿苦馬豆素(swainsonine,SW),國(guó)際上將含SW的棘豆屬(Oxytropis)、黃芪屬(Astragalus)等有毒植物統(tǒng)稱(chēng)為瘋草,而SW是引起動(dòng)物瘋草病的唯一毒素[1]。SW陽(yáng)離子半椅式構(gòu)象與甘露糖陽(yáng)離子構(gòu)象類(lèi)似,可與甘露糖苷競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制α-甘露糖苷酶Ⅰ和高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性[2],造成細(xì)胞功能紊亂,使牲畜出現(xiàn)中毒癥狀,嚴(yán)重時(shí)致死。通過(guò)對(duì)小花棘豆的研究發(fā)現(xiàn),凡能夠分離或檢測(cè)到Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌的植株均含SW,且體外培養(yǎng)該內(nèi)生真菌合成了SW,從而提出小花棘豆的SW毒性由該內(nèi)生真菌引起。

    瘋草內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因(saccharopine reductase gene,sac)編碼酵母氨酸還原酶[3-4]催化賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)化為酵母氨酸后,生成的α-氨基己二酸半醛是內(nèi)生真菌合成SW的一個(gè)重要前體[5]。前期實(shí)驗(yàn)中克隆到A.oxytropis的sac cDNA(KJ944635)和基因(KY052048),獲得sac缺失突變體M1,發(fā)現(xiàn)酵母氨酸還原酶促進(jìn)真菌SW的合成。

    Southern blot由Southern[6]于1975年創(chuàng)建,是分析基因結(jié)構(gòu)和檢測(cè)特定DNA片段的經(jīng)典技術(shù),可檢測(cè)外源目的基因是否已轉(zhuǎn)入并整合到生物染色DNA上,同時(shí)可對(duì)外源片段拷貝數(shù)進(jìn)行分析。Southern blot中使用的標(biāo)記探針有放射性同位素和非放射性?xún)深?lèi),其中放射性探針靈敏度較高,但半衰期短,且有放射性輻射;非放射性標(biāo)記又分為生物素標(biāo)記和地高辛標(biāo)記,非同位素標(biāo)記探針可避免放射性危害,且由于生物體內(nèi)沒(méi)有地高辛,可更好地消除內(nèi)源背景,應(yīng)用效果更好[7]。

    Southern blot操作程序繁瑣,對(duì)基因組DNA的提取、純化、酶切等均有較高要求,要獲得理想雜交結(jié)果需反復(fù)摸索,雖可使用相關(guān)試劑盒,但需根據(jù)具體情況優(yōu)化雜交方案。本研究利用PCR制備地高辛(DIG)標(biāo)記探針,并對(duì)Southern blot方法進(jìn)行了探索和優(yōu)化。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

    供試菌種:小花棘豆A.oxytropis內(nèi)生真菌野生株OW7.8和sac缺失突變株M1由本實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.1.2 主要試劑

    質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒,購(gòu)自Axygen;真菌基因DNA 提取試劑盒、核酸共沉劑、限制性酶、6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker,購(gòu)自Takara;核酸染料購(gòu)自Bio TAQ;DIG標(biāo)記試劑盒、Hyb高效雜交液,購(gòu)自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技;氨芐青霉素、潮霉素 B,購(gòu)自sigma;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

    1.1.3 主要儀器

    超凈工作臺(tái)ZHJH-1109 型,上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn);真菌培養(yǎng)箱MGC-350BP-2型,上海一恒科技有限公司生產(chǎn);冷凍離心機(jī)3-18K/D-37520 型,德國(guó) SIGMA生產(chǎn);超微量測(cè)濃儀Q5000型,美國(guó) Quawell生產(chǎn);PCR 擴(kuò)增儀050-810Tgradient48 型,德國(guó)Biometra-grandien生產(chǎn);全自動(dòng)高壓滅菌鍋HVE-50 型,日本 HIRAYAMA生產(chǎn);電泳儀BG-Power 600型,北京百晶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);凝膠成像系統(tǒng)BG-gds AUTO,北京百晶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);超聲波清洗器PS-20,潔康超聲波設(shè)備有限公司生產(chǎn);Hybridization oven OV4000,德國(guó)耶拿分析儀器公司生產(chǎn);隔水培養(yǎng)箱GH6000,天津泰斯特儀器生產(chǎn)。

    1.2 方法

    1.2.1 PCR法制備DIG標(biāo)記探針

    根據(jù)內(nèi)生真菌sac中間序列設(shè)計(jì)特異性引物DSF/DSR和SEMF/SEMR,以pTOPO-sac1(含內(nèi)生真菌sac)為模板制備野生型探針。PCR反應(yīng)體系為:pTOPO-sac11.0 μg,10×PCR Buffer 2.0 μL,DigdUTP 1.0 μL,rTaq酶1.0 μL,上下游引物各1.0 μL(10 μmol/L),ddH2O補(bǔ)足至20 μL。引物DSF/DSR的PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s; 57 ℃30 s;72 ℃ 1 min,30次循環(huán);72 ℃ 10 min。引物SEMF/SEMR的PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,(95 ℃30s,62 ℃ 30s,72 ℃ 30s)×30,72 ℃ 10 min。

    根據(jù)pCB1003(含hph)質(zhì)粒上的hph序列設(shè)計(jì)特異性引物HGF/YGR,以質(zhì)粒為模板制備突變型探針。PCR反應(yīng)體系除模板其余與上面體系相同。PCR反應(yīng)條件與DSF/DSR的相同。引物序列見(jiàn)表1。

    在做標(biāo)記反應(yīng)的同時(shí),做一個(gè)相同體系非標(biāo)記PCR。反應(yīng)結(jié)束后取標(biāo)記和非標(biāo)記PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)(1%瓊脂糖),剩余探針保存于-20 ℃,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    表1 PCR引物序列

    1.2.2 基因組DNA提取、酶切與轉(zhuǎn)膜

    (1)真菌基因組DNA提取

    將OW7.8和M1接種于PDA培養(yǎng)基上,M1培養(yǎng)基含潮霉素B(終濃度為50 μg/mL),接種后置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。

    刮取50 mg菌絲體放入預(yù)冷研缽中,加液氮迅速研磨至粉末,后置離心管中,加500 μL 4×CTAB提取液(含1% β-巰基乙醇)、4 μL RNase(100 mg /mL)充分搖勻,65 ℃水浴保溫40 min,再加等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)混勻,4 ℃12000r/min離心5 min。在上清液中加2.5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇,4℃12000r/min離心15 min,棄上清液。70%乙醇離心洗滌兩次,4℃12000r/min離心5 min,棄上清液,80℃烘10 min,加100μL ddH2O,37 ℃水浴1 min,測(cè)定DNA濃度及OD值,取5μL進(jìn)行電泳檢測(cè)。

    (2)基因組DNA限制酶切反應(yīng)

    選擇限制性?xún)?nèi)切酶Eco RⅤ、Pst Ⅰ、Pci Ⅰ、PvuⅡ進(jìn)行酶切反應(yīng),總體積50 μL,反應(yīng)體系見(jiàn)表2和表3。基因組DNA終濃度調(diào)至20 ng,于37 ℃酶切12 h,視情況延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至完全酶切,65 ℃保溫10 min,停止反應(yīng)。使用核酸共沉劑進(jìn)行酶切產(chǎn)物的純化和濃縮,用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(0.8%)。

    表2 OW7.8基因組DNA酶切反應(yīng)體系

    (3)轉(zhuǎn)膜和固定

    向上毛細(xì)管轉(zhuǎn)移20 h以上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)效果。取膜,切右上角標(biāo)示方向。將尼龍膜浸入6×SSC溶液中5 min,80 ℃烘烤2 h,進(jìn)行膜固定,固定后用于雜交。

    表3 突變株株基因組DNA酶切反應(yīng)體系

    1.2.3 Southern blot

    加Hyb高效雜交液50 ℃預(yù)雜交3 h(15 r/min)以封閉非特異性位點(diǎn)。標(biāo)記好的探針(25 ng/mL)沸水浴10 min后立即冰浴10 min備用。倒掉預(yù)雜交液,加入50 ℃ 5 mL Hyb高效雜交液及變性地高辛標(biāo)記探針(1~3 μL/膜,5~20 ng探針/mL Hyg雜交液)混勻,50 ℃雜交過(guò)夜。

    取出尼龍膜50 ℃水浴震蕩洗滌,室溫封阻尼龍膜30 min、結(jié)合抗體30 min、洗抗體兩次(15 min/次),加300μL NBT/BCIP顯色底物于37 ℃培養(yǎng)箱中避光顯色20 h后,短時(shí)間暴露于光下用50 mL ddH2O洗膜5 min,停止顯色,拍照記錄[8-12]。

    2 結(jié)果

    2.1 PCR法制備地高辛(DIG)標(biāo)記探針

    內(nèi)生真菌sac探針電泳結(jié)果如圖1所示,泳道1為非標(biāo)記sac PCR反應(yīng)產(chǎn)物,泳道2為DIG標(biāo)記的sac探針,其電泳條帶約709 bp,與預(yù)期結(jié)果相同。hph探針電泳結(jié)果如圖2所示,泳道1為DIG標(biāo)記的hph探針,泳道2為同樣條件下的非標(biāo)記PCR反應(yīng)產(chǎn)物,電泳條帶約879 bp,與預(yù)期結(jié)果相同。標(biāo)記反應(yīng)PCR產(chǎn)物中帶非同位素的配體(生物素、地高辛等),其電泳遷移率慢于非標(biāo)記PCR產(chǎn)物。

    圖1 OW7.8探針DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

    圖2 M1探針DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

    2.2 OW7.8及M1基因組DNA限制性酶切與轉(zhuǎn)膜

    將提取的OW7.8和M1基因組DNA(終濃度為20.75±7.64 μg)用Eco RⅤ、Pst Ⅰ、Pci Ⅰ和Pvu Ⅱ限制酶進(jìn)行切割,酶切產(chǎn)物濃度為202.6±13.8 ng/μL,OD 260/OD 280在1.88~2.01,電泳結(jié)果如圖3所示。其中泳道1為野生株基因組DNA,泳道2、3為用限制酶Eco RⅤ、Pst Ⅰ酶切OW7.8基因組DNA后產(chǎn)物,由圖可見(jiàn)酶切后泳道呈彌散狀,無(wú)明顯條帶,說(shuō)明酶切效果較好。泳道4、5為使用限制酶為Pci Ⅰ、Pvu Ⅱ酶切M1基因組DNA后的產(chǎn)物,結(jié)果顯示泳道4酶切反應(yīng)不完全,泳道5酶切反應(yīng)完全。分別將OW7.8基因組用限制酶Eco RⅤ再進(jìn)行酶切,將M1基因組用限制酶PciⅠ再進(jìn)行酶切,結(jié)果如圖4,可看到酶切反應(yīng)進(jìn)行徹底。轉(zhuǎn)膜后觀察凝膠結(jié)果如圖5,凝膠上沒(méi)有任何殘留DNA,說(shuō)明酶切產(chǎn)物已全部移至尼龍膜。

    圖3 基因組DNA酶切產(chǎn)物

    圖4 基因組DNA酶切產(chǎn)物

    圖5 轉(zhuǎn)膜后的凝膠

    2.3 Southern blot

    由內(nèi)生真菌sac特異性探針與M1基因組DNA和OW7.8基因組DNA酶切產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot試驗(yàn),結(jié)果如圖6所示。泳道1表示sac探針與Pvu Ⅱ切割M1基因組DNA雜交,雜交結(jié)果呈陰性,表明M1中sac已被敲除;泳道2和3分別用Eco RⅤ和Pst Ⅰ切割OW7.8基因組DNA進(jìn)行雜交,雜交結(jié)果呈陽(yáng)性,說(shuō)明野生株有sac,且基因的拷貝數(shù)為1。

    由hph特異性探針與M1基因組DNA和OW7.8基因組DNA酶切產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot試驗(yàn),結(jié)果如圖7所示。泳道1表示hph探針與Pvu Ⅱ切割M1基因組DNA雜交,發(fā)現(xiàn)M1雜交結(jié)果呈陽(yáng)性,說(shuō)明標(biāo)記基因hph成功整合到M1基因組中;泳道2和泳道3分別用hph特異性探針與Eco RⅤ和Pst Ⅰ切割的OW7.8基因組DNA雜交,結(jié)果呈陰性,OW7.8基因組中無(wú)hph,M1中sac已被敲除,且標(biāo)記基因hph已整合到基因組上。

    圖6 野生型探針雜交

    圖7 突變型探針雜交

    3 討論與結(jié)論

    Southern blot過(guò)程較繁瑣,需注意細(xì)節(jié)頗多,本研究用PCR法制備DIG標(biāo)記探針時(shí)設(shè)計(jì)了6對(duì)特異性引物,經(jīng)優(yōu)化選擇出兩對(duì)特異性高且擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度適宜的引物,發(fā)現(xiàn)若擴(kuò)增產(chǎn)物低于300 bp,則DIG摻入較少,而探針過(guò)長(zhǎng)則DIG摻入過(guò)多,導(dǎo)致非特異性雜交。張明琴等[8]用900 bp探針進(jìn)行雜交,雜交信號(hào)較強(qiáng)。另外,在探針標(biāo)記前要優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,包括引物、退火溫度、延伸時(shí)間、模板量等,減少非特異性擴(kuò)增,從而降低雜交背景值,避免出現(xiàn)假陽(yáng)性。

    Southern blot對(duì)基因組DNA的質(zhì)量要求高,本研究在CTAB法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)[9],菌絲研磨要充分快速(2 min內(nèi)),避免降解;渦旋振蕩使菌絲與裂解液混勻,使DNA充分釋放。對(duì)裂解時(shí)間也進(jìn)行了探索,發(fā)現(xiàn)40 min利于基因組DNA釋放。

    實(shí)驗(yàn)中在45~65 ℃范圍內(nèi)設(shè)置了5個(gè)溫度,發(fā)現(xiàn)50 ℃時(shí)雜交效果最好。雜交膜的選擇也相當(dāng)重要,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用尼龍膜比硝酸素纖維膜的雜交信號(hào)強(qiáng)。雜交液純度也會(huì)影響雜交結(jié)果,分別用過(guò)濾前后的雜交液進(jìn)行雜交,發(fā)現(xiàn)過(guò)濾后的雜交背景低、無(wú)假陽(yáng)性、雜交信號(hào)較強(qiáng),而未過(guò)濾雜交液則背景值高、無(wú)雜交信號(hào)。雜交膜用TE漂洗2次后封存,膜干燥或久置后,信號(hào)將會(huì)有所減弱或褪色,但經(jīng)TE潤(rùn)濕后仍然會(huì)重現(xiàn)原有的雜交信號(hào)[10]。

    Hyb高效雜交液適合在帶正電荷尼龍膜上進(jìn)行Southern和Northern雜交分析,其獨(dú)特配方和操作規(guī)程僅需雜交6~12 h,而常規(guī)雜交則需要12~24 h。另外,Hyb高效雜交液能明顯降低背景,使Southern膜上單拷貝基因和Northern膜上低拷貝RNA得以檢出,也適于各類(lèi)cDNA表達(dá)芯片雜交和探針標(biāo)記。

    設(shè)計(jì)DIG標(biāo)記探針,利用Southern blot技術(shù)檢測(cè)了小花棘豆內(nèi)生真菌OW7.8和M1菌株,結(jié)果表明OW7.8中有sac中間序列,而在M1中被hph替換,說(shuō)明sac已被敲除。sac基因以單拷貝形式存在于OW7.8基因組中。

    猜你喜歡
    泳道內(nèi)生探針
    得分一瞬
    睿士(2023年9期)2023-09-20 05:47:07
    植物內(nèi)生菌在植物病害中的生物防治
    內(nèi)生微生物和其在作物管理中的潛在應(yīng)用
    “黨建+”激活鄉(xiāng)村發(fā)展內(nèi)生動(dòng)力
    家蠶色氨酸羥化酶 (TRH) 基因的克隆及表達(dá)特性分析
    授人以漁 激活脫貧內(nèi)生動(dòng)力
    多通道Taqman-探針熒光定量PCR鑒定MRSA方法的建立
    游泳池里的航母
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    透射電子顯微鏡中的掃描探針裝置
    久99久视频精品免费| 国产精品永久免费网站| 国产色婷婷99| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲内射少妇av| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲五月天丁香| 搡老岳熟女国产| 麻豆国产av国片精品| 舔av片在线| 好男人电影高清在线观看| 国产乱人伦免费视频| 免费观看精品视频网站| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲乱码一区二区免费版| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 搡老妇女老女人老熟妇| 九色成人免费人妻av| 国产高潮美女av| 在线观看舔阴道视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 变态另类丝袜制服| 婷婷亚洲欧美| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 欧美另类亚洲清纯唯美| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 看黄色毛片网站| 久久九九热精品免费| 成人无遮挡网站| 色哟哟·www| 一级av片app| 国产三级在线视频| 在线观看免费视频日本深夜| 在线a可以看的网站| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品不卡视频一区二区 | 色视频www国产| 天天躁日日操中文字幕| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产成人影院久久av| 日本a在线网址| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产主播在线观看一区二区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲,欧美精品.| 亚洲片人在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品久久国产蜜桃| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产高清有码在线观看视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 熟女电影av网| 国产精品亚洲美女久久久| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 男女视频在线观看网站免费| 观看美女的网站| 欧美午夜高清在线| 亚洲中文字幕日韩| 51国产日韩欧美| 精品午夜福利在线看| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 免费在线观看日本一区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 村上凉子中文字幕在线| 白带黄色成豆腐渣| 老司机福利观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 禁无遮挡网站| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 一级黄片播放器| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久久久国内视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久久6这里有精品| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产黄a三级三级三级人| avwww免费| 日韩免费av在线播放| 99久久99久久久精品蜜桃| 99热这里只有是精品50| 窝窝影院91人妻| 国产伦精品一区二区三区四那| 日日夜夜操网爽| 九色国产91popny在线| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 成人精品一区二区免费| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产v大片淫在线免费观看| 男女之事视频高清在线观看| 两个人的视频大全免费| 香蕉av资源在线| 99久久九九国产精品国产免费| 久久精品国产自在天天线| 好男人电影高清在线观看| 国产成人aa在线观看| 亚洲av二区三区四区| 欧美潮喷喷水| 久久久久久久久中文| 在线国产一区二区在线| 精品久久久久久成人av| 一级av片app| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 免费看a级黄色片| 亚洲专区国产一区二区| 在线播放无遮挡| netflix在线观看网站| 国产精品电影一区二区三区| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲av一区综合| 深夜精品福利| 91久久精品电影网| 国产成人av教育| 久久中文看片网| 国产av在哪里看| 亚洲色图av天堂| 久久精品国产亚洲av天美| 别揉我奶头 嗯啊视频| 看片在线看免费视频| 久久久精品大字幕| 小说图片视频综合网站| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 欧美中文日本在线观看视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲人成网站高清观看| av在线天堂中文字幕| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 怎么达到女性高潮| 亚洲,欧美,日韩| 淫妇啪啪啪对白视频| 1024手机看黄色片| 国产精品综合久久久久久久免费| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产高清视频在线播放一区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产亚洲精品av在线| 亚洲无线在线观看| 久久中文看片网| 国产一区二区在线av高清观看| 我的女老师完整版在线观看| 国产成年人精品一区二区| eeuss影院久久| 成年女人看的毛片在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 88av欧美| 亚洲国产欧美人成| 欧美日韩乱码在线| 日韩欧美免费精品| 日韩欧美免费精品| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 最近视频中文字幕2019在线8| 18美女黄网站色大片免费观看| 两人在一起打扑克的视频| 可以在线观看毛片的网站| 成年版毛片免费区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产精品日韩av在线免费观看| 九九热线精品视视频播放| 一级毛片久久久久久久久女| 99国产综合亚洲精品| 精品久久国产蜜桃| 极品教师在线免费播放| 亚洲av电影在线进入| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国内精品久久久久久久电影| 国产欧美日韩一区二区精品| 偷拍熟女少妇极品色| 久久久久久久久久黄片| 国产不卡一卡二| 日本 av在线| 黄片小视频在线播放| 亚洲av成人av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲熟妇熟女久久| АⅤ资源中文在线天堂| 国内揄拍国产精品人妻在线| 在线观看一区二区三区| 十八禁网站免费在线| 在线免费观看的www视频| 成年女人永久免费观看视频| 偷拍熟女少妇极品色| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲内射少妇av| 日韩欧美免费精品| 日韩欧美精品免费久久 | 国产成人欧美在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国内精品久久久久久久电影| 久久久国产成人精品二区| 国产色爽女视频免费观看| 成人永久免费在线观看视频| 全区人妻精品视频| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲精品在线美女| 亚洲精品在线观看二区| 91久久精品电影网| 91av网一区二区| 99在线人妻在线中文字幕| 国产成人福利小说| 欧美黑人巨大hd| 可以在线观看的亚洲视频| 桃红色精品国产亚洲av| www.999成人在线观看| 美女黄网站色视频| 淫秽高清视频在线观看| 久久久国产成人免费| 亚洲精品456在线播放app | 乱人视频在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲无线在线观看| 18禁在线播放成人免费| 夜夜爽天天搞| 1024手机看黄色片| 亚洲av不卡在线观看| 国产综合懂色| 午夜久久久久精精品| 能在线免费观看的黄片| 亚洲人成电影免费在线| 欧美黄色淫秽网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲精品在线观看二区| 久久99热这里只有精品18| 国内揄拍国产精品人妻在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 精品久久久久久久久av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产亚洲av嫩草精品影院| 桃色一区二区三区在线观看| 国产成人欧美在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 色吧在线观看| 国产三级黄色录像| 午夜福利在线观看吧| 久久人妻av系列| 在线观看舔阴道视频| 久久精品91蜜桃| 久久这里只有精品中国| 日韩欧美三级三区| avwww免费| 床上黄色一级片| 两个人视频免费观看高清| 亚洲人与动物交配视频| 天堂网av新在线| 一个人看的www免费观看视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 18禁黄网站禁片免费观看直播| www.999成人在线观看| av视频在线观看入口| 无人区码免费观看不卡| 91九色精品人成在线观看| 国产av在哪里看| 有码 亚洲区| 久9热在线精品视频| 99久国产av精品| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲色图av天堂| av天堂在线播放| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美激情在线99| 性色avwww在线观看| 免费在线观看成人毛片| 一本精品99久久精品77| 永久网站在线| 宅男免费午夜| 毛片女人毛片| 观看免费一级毛片| 人人妻人人看人人澡| 精品国产亚洲在线| 草草在线视频免费看| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美激情在线99| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 99久久99久久久精品蜜桃| 伦理电影大哥的女人| 看十八女毛片水多多多| 精品福利观看| 免费黄网站久久成人精品 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲综合色惰| 性色avwww在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 不卡一级毛片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 一本一本综合久久| 欧美黄色淫秽网站| 18+在线观看网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 香蕉av资源在线| 一进一出好大好爽视频| 日本免费a在线| 1024手机看黄色片| 黄色丝袜av网址大全| 欧美乱色亚洲激情| 美女大奶头视频| av在线天堂中文字幕| 欧美黄色淫秽网站| 欧美高清成人免费视频www| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 99在线人妻在线中文字幕| 69av精品久久久久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久久九九精品二区国产| 久久精品综合一区二区三区| 成人性生交大片免费视频hd| 中文字幕高清在线视频| 99国产精品一区二区三区| 成年女人看的毛片在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 天堂√8在线中文| 嫩草影院入口| 成熟少妇高潮喷水视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 又紧又爽又黄一区二区| av欧美777| 一夜夜www| 国产在视频线在精品| 全区人妻精品视频| 久久精品综合一区二区三区| 午夜精品久久久久久毛片777| 波多野结衣巨乳人妻| eeuss影院久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 少妇高潮的动态图| 少妇的逼好多水| 首页视频小说图片口味搜索| 99精品在免费线老司机午夜| 免费看光身美女| 1000部很黄的大片| 欧美午夜高清在线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美乱色亚洲激情| 国产欧美日韩一区二区三| 久久久久九九精品影院| 免费观看精品视频网站| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲激情在线av| 丝袜美腿在线中文| 一级av片app| 国产欧美日韩精品一区二区| 国内精品美女久久久久久| 十八禁网站免费在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| av在线老鸭窝| 中文字幕av成人在线电影| 欧美午夜高清在线| 男女视频在线观看网站免费| 毛片女人毛片| 乱码一卡2卡4卡精品| 午夜久久久久精精品| 国产伦精品一区二区三区四那| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 婷婷精品国产亚洲av在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 看免费av毛片| 午夜免费成人在线视频| 一个人免费在线观看电影| 99久久精品国产亚洲精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 91av网一区二区| 最近最新免费中文字幕在线| 天堂影院成人在线观看| 小说图片视频综合网站| 一区福利在线观看| 日本 欧美在线| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲无线观看免费| 成人av一区二区三区在线看| 宅男免费午夜| 亚洲欧美清纯卡通| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲成人中文字幕在线播放| 毛片一级片免费看久久久久 | 亚洲自偷自拍三级| 欧美成人a在线观看| av黄色大香蕉| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产高清视频在线观看网站| 成人av在线播放网站| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲片人在线观看| 国产精华一区二区三区| 看免费av毛片| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 美女 人体艺术 gogo| 日日夜夜操网爽| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 性欧美人与动物交配| 看十八女毛片水多多多| 精品一区二区免费观看| 亚洲国产色片| 国产午夜精品论理片| 男人舔女人下体高潮全视频| 嫩草影院入口| 免费在线观看日本一区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲国产欧美人成| aaaaa片日本免费| 国产精品国产高清国产av| 亚洲内射少妇av| 国产v大片淫在线免费观看| 在线a可以看的网站| 国产高清视频在线观看网站| 日本黄色片子视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 精品国产亚洲在线| 精品一区二区免费观看| 嫩草影院入口| 久久草成人影院| 亚洲电影在线观看av| 日本免费a在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 我要搜黄色片| 亚洲美女搞黄在线观看 | 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲人与动物交配视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产主播在线观看一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 波多野结衣巨乳人妻| 日本与韩国留学比较| 99久久无色码亚洲精品果冻| 午夜视频国产福利| 国产精品免费一区二区三区在线| 成年人黄色毛片网站| 亚洲av五月六月丁香网| 有码 亚洲区| 别揉我奶头 嗯啊视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 国产一区二区激情短视频| 一级av片app| 国产极品精品免费视频能看的| 90打野战视频偷拍视频| 国产成人啪精品午夜网站| 嫩草影视91久久| 久久午夜福利片| 亚洲,欧美,日韩| 精品午夜福利在线看| 一个人免费在线观看的高清视频| 精华霜和精华液先用哪个| www.www免费av| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品久久久久久精品电影| 俺也久久电影网| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 深爱激情五月婷婷| 国产探花在线观看一区二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 大码成人一级视频| 99热6这里只有精品| 国产精品一区二区在线观看99| 超碰av人人做人人爽久久| 国产淫语在线视频| 久久久久久久久大av| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产av码专区亚洲av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久久久久久久久久成人| 欧美一区二区亚洲| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产亚洲91精品色在线| 干丝袜人妻中文字幕| 国产永久视频网站| 国产精品久久久久久av不卡| 久热这里只有精品99| 欧美日韩精品成人综合77777| 午夜爱爱视频在线播放| 网址你懂的国产日韩在线| 一级二级三级毛片免费看| 成人一区二区视频在线观看| 又大又黄又爽视频免费| 一级av片app| 亚洲av国产av综合av卡| 老司机影院成人| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久影院123| 国产成人a区在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品国产三级国产专区5o| 永久网站在线| 毛片一级片免费看久久久久| 国产毛片在线视频| 青青草视频在线视频观看| 18+在线观看网站| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲av在线观看美女高潮| 黄片wwwwww| 美女视频免费永久观看网站| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产亚洲av嫩草精品影院| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美少妇被猛烈插入视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美日韩在线观看h| 水蜜桃什么品种好| 在线观看av片永久免费下载| 色婷婷久久久亚洲欧美| 永久免费av网站大全| 国产精品一区www在线观看| 欧美精品一区二区大全| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 免费黄色在线免费观看| 中文欧美无线码| 国产69精品久久久久777片| 在线观看av片永久免费下载| 男人和女人高潮做爰伦理| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲性久久影院| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲熟女精品中文字幕| 51国产日韩欧美| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲精品日本国产第一区| 我的老师免费观看完整版| 亚洲va在线va天堂va国产| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲精品影视一区二区三区av| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 青春草亚洲视频在线观看| 日韩电影二区| 久久人人爽人人爽人人片va| 涩涩av久久男人的天堂| 男女下面进入的视频免费午夜| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲真实伦在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲精品自拍成人| 狂野欧美激情性bbbbbb| 1000部很黄的大片| 一本久久精品| 色网站视频免费| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲经典国产精华液单| 最近中文字幕高清免费大全6| 91精品一卡2卡3卡4卡| 激情五月婷婷亚洲| av专区在线播放| 亚洲精品色激情综合| av在线app专区| 免费电影在线观看免费观看| 国产探花在线观看一区二区| 国产亚洲91精品色在线| 秋霞伦理黄片| 国产亚洲最大av| 免费av观看视频| 激情 狠狠 欧美| 国产毛片在线视频| 视频中文字幕在线观看| 尾随美女入室| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 亚洲不卡免费看| 国产精品久久久久久精品电影| 99久久人妻综合| 成人国产av品久久久| 少妇 在线观看| 久久热精品热| 国产成人aa在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 免费在线观看成人毛片| 日本色播在线视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 99热网站在线观看| 久久这里有精品视频免费| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 人妻一区二区av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| h日本视频在线播放| videossex国产| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日本欧美国产在线视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 热re99久久精品国产66热6| 亚洲熟女精品中文字幕| 晚上一个人看的免费电影| 日韩伦理黄色片| 日日啪夜夜爽|