兩種技術(shù)對(duì)不同手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)診斷胸壁結(jié)核的價(jià)值

任航空 段李明 鄭琴芳

胸壁結(jié)核是胸外科的常見疾病，對(duì)此病的臨床診斷除了手術(shù)標(biāo)本的病理學(xué)檢查之外，還包括對(duì)術(shù)后藥物治療有指導(dǎo)性的病原學(xué)檢測(cè)。胸壁病灶的手術(shù)標(biāo)本形態(tài)差異性較大，臨床常見的手術(shù)標(biāo)本包括膿液、干酪樣壞死組織、肉芽組織。對(duì)GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“GeneXpert”)和BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“MGIT 960”)在體液的研究較多見[1-2]，但對(duì)其在胸壁手術(shù)標(biāo)本的檢測(cè)篩選卻鮮有報(bào)道。本研究將GeneXpert和MGIT 960分別作為分子生物學(xué)和細(xì)菌學(xué)的典型代表應(yīng)用于胸壁疾病的手術(shù)標(biāo)本檢測(cè)，研究?jī)煞N技術(shù)對(duì)胸壁結(jié)核的診斷價(jià)值，同時(shí)篩選陽性率高的手術(shù)標(biāo)本類型，以期指導(dǎo)臨床有效利用衛(wèi)生資源。

資料和方法

一、一般資料

搜集2016年6月至2019年7月西安市胸科醫(yī)院外科收治的214例疑似胸壁結(jié)核患者的臨床資料。214例患者中，男117例(54.7%)，女97例(45.3%)；年齡6～81歲，平均(45.8±17.5)歲。其中肋骨破壞114例(53.3%)，并發(fā)結(jié)核性胸膜炎42例(19.6%)，并發(fā)肺結(jié)核27例(12.6%)，并發(fā)脊柱結(jié)核8例(3.7%)，并發(fā)高血壓25例(11.7%)，并發(fā)糖尿病13例(6.1%)。通過臨床綜合診斷、病理學(xué)檢查確診胸壁結(jié)核174例，非結(jié)核性胸壁疾病40例。將外科手術(shù)獲取胸壁病灶中的膿液、干酪樣壞死組織及肉芽組織標(biāo)本分別取部分組織送病理學(xué)檢查后，對(duì)3種類型手術(shù)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行GeneXpert和MGIT 960檢測(cè)。

二、胸壁結(jié)核臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)

參考英國(guó)國(guó)家衛(wèi)生與臨床優(yōu)化署2016年制定的結(jié)核病診斷指南中的關(guān)于肺外結(jié)核診斷的指導(dǎo)意見[3]，本研究臨床診斷為胸壁結(jié)核的標(biāo)準(zhǔn)為：癥狀體征與影像學(xué)(包括B超、X線及CT檢查)發(fā)現(xiàn)的局部結(jié)核病灶的膿腫、肋骨破壞相符；(2)病灶標(biāo)本的病理學(xué)檢查提示為干酪樣壞死并朗格漢斯肉芽腫；(3)病灶標(biāo)本的微生物學(xué)或分子生物學(xué)檢查證實(shí)為結(jié)核分枝桿菌感染；(4)規(guī)律抗結(jié)核藥物治療6個(gè)月以上，結(jié)核毒性癥狀及局部癥狀消失。符合以上任意2條即診斷為胸壁結(jié)核。

三、標(biāo)本的制備

手術(shù)過程中，以20 ml滅菌注射器抽取膿液，封裝后快速送檢，避免滲出血液污染膿液及生理鹽水稀釋膿液；留取干酪樣壞死組織、肉芽組織于滅菌彎盤中，用生理鹽水沖洗干凈，封裝于滅菌標(biāo)本藍(lán)盒中快速送檢，避免膿液、干酪樣壞死組織、肉芽組織混雜送檢。共制備152份膿液標(biāo)本、128份干酪樣壞死組織標(biāo)本、138份肉芽組織標(biāo)本。對(duì)3種類型標(biāo)本均進(jìn)行GeneXpert和MGIT 960檢測(cè)。

四、結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

1.標(biāo)本處理：膿液標(biāo)本依照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[4]，采用N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-氫氧化鈉法進(jìn)行標(biāo)本處理。 肉芽組織及干酪樣壞死組織在加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS， pH 7.0)后，應(yīng)用微型研磨器Fast-24(美國(guó)MP Biomeidcals公司)進(jìn)行勻漿，之后直接接種或進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。

2.GeneXpert檢測(cè)：按照GeneXpert MTB/RIF操作說明進(jìn)行。取1 ml經(jīng)過上述第一步處理的標(biāo)本于有螺旋蓋的無菌管中，然后加入2 ml標(biāo)本處理液，放置于渦旋振蕩器上渦旋振蕩10 s，室溫靜置10 min，重置于渦旋振蕩器上振蕩10 s，室溫靜置5 min，使標(biāo)本充分液化。吸取2 ml液化標(biāo)本至GeneXpert反應(yīng)試劑盒，然后將反應(yīng)試劑盒放置到檢測(cè)模塊，儀器開始進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。反應(yīng)完成后，在檢測(cè)系統(tǒng)窗口下可直接查看測(cè)試結(jié)果。

3.MGIT 960培養(yǎng)：將肉芽組織或壞死組織勻漿后，使用NALC-氫氧化鈉消化15 min,然后加入無菌PBS，3000×g離心15 min，將沉淀重新懸浮于2 ml的PBS中。將0.5 ml處理后標(biāo)本接種在BACTEC MGIT 960分枝桿菌生長(zhǎng)指示管，進(jìn)行混勻，室溫靜置30 min。然后在37 ℃條件下放置在BACTEC MGIT 960儀器中進(jìn)行孵育，最長(zhǎng)時(shí)間為42 d，并定期進(jìn)行監(jiān)控。培養(yǎng)陽性標(biāo)本經(jīng)萋-尼抗酸染色確認(rèn)，并進(jìn)一步用MPB64單克隆抗體(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)進(jìn)行檢測(cè)，鑒定為結(jié)核分枝桿菌。膿液標(biāo)本直接加消化液進(jìn)行操作。以空白管作為陰性對(duì)照。

4.試劑：GeneXpert MTB/RIF試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cepheid公司， BACTEC MGIT 960含藥培養(yǎng)基購(gòu)自珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、GeneXpert和MGIT 960對(duì)3種類型手術(shù)標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果

在152份膿液標(biāo)本檢測(cè)中，GeneXpert和MGIT 960檢測(cè)結(jié)果均陽性47份，總的陽性份數(shù)為68份，陽性率44.7%；在128份干酪樣壞死組織標(biāo)本中，兩種方法檢測(cè)結(jié)果均陽性51份，總的陽性份數(shù)為88份，陽性率68.8%；在肉芽組織檢測(cè)中，兩種方法檢測(cè)結(jié)果均陽性86份，總的陽性份數(shù)為113份,陽性率81.9%。將膿液、干酪樣壞死組織、肉芽組織的檢出陽性率兩兩比較，P值均<0.05。具體見表1。

二、以臨床診斷結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)GeneXpert和MGIT 960兩種方法的診斷效能

1.臨床診斷：214例疑似胸壁結(jié)核患者通過術(shù)前血液化驗(yàn)、影像學(xué)資料及術(shù)后病理結(jié)果臨床最終診斷為胸壁結(jié)核174例，非結(jié)核性胸壁疾病40例(其中化膿性胸壁膿腫18例，胸壁囊腫并發(fā)普通細(xì)菌感染9例，軟組織腫瘤8例，肋骨骨髓炎3例，胸壁放線菌病2例)。

2.兩種方法的診斷效能評(píng)價(jià)：本研究共收集疑似胸壁結(jié)核214例，GeneXpert對(duì)疑似胸壁結(jié)核的診斷鑒定結(jié)果顯示有144例為陽性，70例為陰性。GeneXpert和臨床診斷的共同陽性結(jié)果為143例，共同陰性結(jié)果為39例；以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert鑒定胸壁結(jié)核的敏感度為82.18%(143/174)，特異度為97.50%(39/40)，陽性預(yù)測(cè)值為99.31%(143/144)，陰性預(yù)測(cè)值為55.71%(39/70)，Kappa值為0.618。MGIT 960培養(yǎng)對(duì)疑似胸壁結(jié)核的診斷鑒定結(jié)果顯示有94例為陽性，采用對(duì)硝基苯甲酸(PNB)進(jìn)行菌種鑒定，培養(yǎng)陽性的標(biāo)本中有3例為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，因此，最終確認(rèn)為培養(yǎng)陽性的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)本為91例，陰性樣本為123例。MGIT 960和臨床診斷的共同陽性結(jié)果為91例，共同陰性結(jié)果為40例；以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，MGIT 960鑒定胸壁結(jié)核的敏感度為52.30%(91/174)，特異度為100.00%(40/40)，陽性預(yù)測(cè)值為100.00%(91/91)，陰性預(yù)測(cè)值為32.52%(40/123)，Kappa值為0.291。具體見表2。

表1 3種類型標(biāo)本采用GeneXpert及MGIT 960的檢測(cè)結(jié)果(陽性率差異)比較

注在膿液檢測(cè)中，兩種方法檢測(cè)結(jié)果均陽性47份，MGIT 960培養(yǎng)陽性47份，GeneXpert檢測(cè)陽性68份；在干酪樣壞死組織中，兩種方法檢測(cè)結(jié)果均陽性51份，其中MGIT 960培養(yǎng)陽性53份，GeneXpert檢測(cè)陽性86份；在肉芽組織檢測(cè)中，兩種方法檢測(cè)結(jié)果均陽性86份，其中MGIT 960培養(yǎng)陽性89份，GeneXpert檢測(cè)陽性110份。MGIT 960培養(yǎng)陽性者經(jīng)菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌，非結(jié)核分枝桿菌已剔除。a:膿液與干酪樣壞死組織2種標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果之間的陽性率比較，通過Bonferroni方法校正P值，0.05/3=0.017，P<0.001<0.017。b:干酪樣壞死組織和肉芽組織2種標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果之間的陽性率比較，P=0.013<0.017。c:肉芽組織和膿液2種標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果之間的陽性率比較，P<0.001<0.017

表2 GeneXpert與MGIT 960以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)胸壁結(jié)核的效能

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%=a/(a+c)×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%=d/(b+d)×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%=a/(a+b)×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%=d/(c+d)×100%

GeneXpert檢測(cè)胸壁結(jié)核的曲線下面積(AUC)值為0.898， 95%的置信區(qū)間(95%CI值)為0.853～0.944；MGIT 960檢測(cè)胸壁結(jié)核的AUC值為0.761，95%CI值為0.697～0.826，GeneXpert的診斷價(jià)值高于MGIT 960(圖1)。

討 論

一、GeneXpert與MGIT 960對(duì)胸壁結(jié)核不同形態(tài)類型病灶標(biāo)本檢測(cè)陽性率的比較

GeneXpert與MGIT 960是目前臨床上常用的檢測(cè)方法，在獲得病原學(xué)依據(jù)及判斷結(jié)核分枝桿菌是否耐藥方面起著重要作用。膿液標(biāo)本容易獲得，但膿液中的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率較低[5]；而肉芽組織的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率高于膿液，但總體的病原學(xué)陽性檢出率仍不高，僅為36.8%[6]。而唐亮等[7]應(yīng)用GeneXpert和細(xì)菌培養(yǎng)法對(duì)脊柱結(jié)核的不同類型病灶的檢測(cè)結(jié)果顯示，膿液陽性率較高[(73.02±6.33) %；(44.44±7.08) %]，肉芽組織次之[(73.02±6.33) %；(43.86±7.44) %]，干酪壞死物最低[(39.87±7.76) %；(30.72±7.31) %]，GeneXpert的檢測(cè)陽性率明顯高于細(xì)菌培養(yǎng)。林慶璽等[8]用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法檢測(cè)活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核不同的病理材料，結(jié)果為肉芽組織的陽性率為74.42%(32/43)，明顯高于干酪樣壞死組織[58.14%(25/43)]和膿液[37.21%(16/43)]。本研究顯示，GeneXpert聯(lián)合MGIT 960檢測(cè)3種類型胸壁結(jié)核病灶標(biāo)本，肉芽組織的陽性率為[81.9%(113/138)]，明顯高于干酪樣壞死組織[68.8%(88/128)]和膿液[44.7%(68/152)]。膿液與干酪樣壞死組織兩組之間的陽性率比較，通過Bonferroni方法校正P值，P<0.017，干酪樣壞死組織和肉芽組織兩組之間的陽性率比較，P=0.013<0.017，肉芽組織和膿液兩組之間的陽性率比較，P<0.017；表明2種方法對(duì)肉芽組織檢測(cè)陽性率明顯高于膿液和干酪樣壞死組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與林慶璽等[8]單用PCR檢測(cè)活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核不同病理材料的研究結(jié)果一致。因此，術(shù)中留取標(biāo)本的過程中，肉芽組織應(yīng)作為首選的檢測(cè)材料。為了節(jié)約醫(yī)療資源，可聯(lián)合GeneXpert與MGIT 960僅對(duì)肉芽組織進(jìn)行檢測(cè)，以獲得更優(yōu)的檢測(cè)結(jié)果。

二、GeneXpert與MGIT 960檢測(cè)診斷胸壁結(jié)核的效能分析

GeneXpert檢測(cè)可最短在手術(shù)標(biāo)本送檢后2 h獲得結(jié)果，能夠?qū)π乇诮Y(jié)核進(jìn)行早期診斷。GeneXpert檢測(cè)過程在全自動(dòng)全封閉的狀態(tài)下進(jìn)行，能夠有效避免標(biāo)本處理過程中的污染問題，單從操作技術(shù)層面考慮，GeneXpert便捷、自動(dòng)化、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)更宜在外科手術(shù)標(biāo)本檢測(cè)中應(yīng)用。本研究納入的疑似胸壁結(jié)核患者中，從術(shù)后普通細(xì)菌培養(yǎng)及病理結(jié)果來看，普通細(xì)菌感染占非結(jié)核性胸壁疾病的67.50%(27/40),其中包括化膿性胸壁膿腫18例，胸壁囊腫并發(fā)普通細(xì)菌感染9例，值得在外科工作中引起警惕。在診斷胸壁結(jié)核方面，GeneXpert的敏感度和特異度分別為82.18%和97.50%，與國(guó)內(nèi)近4年的骨關(guān)節(jié)結(jié)核研究結(jié)果基本一致[9-11]。本研究中，GeneXpert鑒定胸壁結(jié)核的結(jié)果與臨床診斷結(jié)果的一致性較好(Kappa=0.618)，而MGIT 960鑒定胸壁結(jié)核的結(jié)果與臨床診斷結(jié)果的一致性較差(Kappa=0.291)，表明GeneXpert對(duì)疑似胸壁結(jié)核手術(shù)標(biāo)本的檢測(cè)效能高于MGIT 960。本研究結(jié)果與范國(guó)萍等[12]對(duì)可疑肺結(jié)核痰液標(biāo)本的研究結(jié)果一致；而MGIT 960對(duì)送檢標(biāo)本的檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需要14～40 d不等。與GeneXpert相比，MGIT 960檢測(cè)的敏感度僅為52.30%，原因可能如下：一方面因?yàn)镸GIT 960液體培養(yǎng)時(shí)只檢測(cè)標(biāo)本中的活菌；而GeneXpert檢測(cè)的是結(jié)核分枝桿菌的DNA片段，即使為死菌，也可獲得陽性檢測(cè)結(jié)果；另一方面，可能與實(shí)驗(yàn)操作人員的操作規(guī)范、操作污染等因素有關(guān)[13-14]。MGIT 960的優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)檢測(cè)陽性標(biāo)本進(jìn)一步做一線、二線抗結(jié)核藥物的藥物敏感性試驗(yàn)，從而較全面地判斷耐藥情況，而GeneXpert僅能判斷菌株對(duì)利福平是否耐藥。

三、本研究的不足之處及展望

本研究對(duì)于干酪樣壞死組織和肉芽組織僅憑肉眼分辨，后續(xù)如能篩選一些經(jīng)濟(jì)情況好的患者，對(duì)送檢標(biāo)本做一個(gè)病理學(xué)預(yù)判，研究所得結(jié)果將更具說服力。

綜上所述，胸壁結(jié)核不同形態(tài)的病灶中，肉芽組織是獲得病原學(xué)依據(jù)的重要標(biāo)本形式；而檢測(cè)方法上，GeneXpert與MGIT 960聯(lián)合檢測(cè)，能夠提高手術(shù)標(biāo)本陽性檢出率，對(duì)胸壁結(jié)核的早期診斷及后續(xù)用藥意義重大。