丹參注射液對腦損傷大鼠神經元的影響及其與Persephin表達的關系Δ

黃 微，王 瑩，吳 鍵

(1.昆明醫(yī)科大學海源學院，云南 昆明 650106； 2.云南省第二人民醫(yī)院神經外科，云南 昆明 650000)

腦損傷是指由各種因素導致的機體腦組織出現(xiàn)的器質性損傷，繼而引發(fā)機體神經功能受損，神經元細胞出現(xiàn)功能性障礙和死亡[1]；會導致腦部的缺血缺氧和血流不暢等，嚴重威脅腦部正常功能的運轉，對于機體的生命維持產生嚴重的負面影響。目前，如何通過藥物手段來預防或治療腦損傷造成的神經元功能障礙已成為臨床上的重點研究方向。近年來，中醫(yī)藥的發(fā)展得到了較高的認可。丹參注射液是臨床常用的中藥注射劑，具有活血化瘀、通脈養(yǎng)心的功效，常用于冠心病、胸悶及心絞痛等心腦血管疾病的治療[2]。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)丹參對于腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用，在腦部神經功能的保護方面有一定的優(yōu)勢[3-4]。為此，本研究總結了近年來研究實踐的經驗，以腦損傷大鼠為研究對象，以大鼠的神經元功能性指標來評估丹參注射液對大鼠神經元的影響及其與Persephin的關系，現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 儀器

BX-51型光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；MDF-40型超低溫冰箱(中科美菱公司)；TDL-5T型高速冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；YZ-250DB型超聲波清洗儀(上海越眾儀器設備有限公司)；ICR-15型電子分析天平(梅特勒托利多公司)；Multiskan Sky型多功能全波段酶標儀(賽默飛世爾科技中國有限公司)；Leica BOND型全自動免疫組化分析儀(德國徠卡公司)。

1.2 實驗動物

SD大鼠100只，雌雄各半，購于昆明醫(yī)科大學海源學院實驗動物中心，鼠齡8～10周，體質量180～250 g，平均體質量(203.21±21.97)g。

1.3 藥品與試劑

丹參注射液(四川升和藥業(yè)股份有限公司，批準文號為國藥準字Z51021303，規(guī)格為10 ml)；0.9%氯化鈉注射液(安徽豐源藥業(yè)有限公司)；相關檢測試劑盒購于上海羅氏診斷試劑公司。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

將100只大鼠分為健康對照組、空白對照組和丹參組(低劑量組、中劑量組及高劑量組)，每組20只；每組大鼠雌雄各半，鼠齡、體質量相似，具有可比性。健康對照組大鼠自由喂食，不做特殊處理。將空白對照組、丹參組大鼠進行腦損傷造模操作，麻醉后對其頸總動脈進行結扎處理，然后置于2 000 ml容器中，以2 L/min速度輸入10%氧氣+90%氮氣持續(xù)2 h完成腦損傷的造模。將待造模完成后，空白對照組大鼠給予0.9%氯化鈉注射液；高、中及低劑量組大鼠分別給予丹參含量1、5及10 mg/ml的丹參注射液。大鼠的注射方式為腹腔注射，液體量均為5 ml，1日1次，連續(xù)治療7 d。

2.2 觀察指標

在治療7 d后穿刺心臟采集各組大鼠的血液樣本約2 ml，離心分離得到血清樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測各組大鼠的神經元指標神經元特異性烯醇化酶(NSE)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白水平進行統(tǒng)計對比。采用免疫組化分析法對各組大鼠Persephin水平進行檢測統(tǒng)計對比。并以Pearson檢驗對大鼠神經元指標NSE、MDA、SOD、Bcl-2與Persephin相關性進行分析探討。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠神經元指標水平比較

與健康對照組大鼠相比，空白對照組、丹參組大鼠的NSE、MDA及SOD水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低；且丹參組大鼠NSE、MDA及SOD水平明顯低于空白對照組，Bcl-2蛋白水平明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著丹參注射液劑量的升高，丹參組大鼠NSE、MDA及SOD水平依次降低，Bcl-2蛋白水平依次升高，組間比較的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

3.2 各組大鼠Persephin水平比較

空白對照組、丹參組大鼠Persephin水平明顯低于健康對照組，丹參組大鼠Persephin水平明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著丹參注射液劑量的升高，丹參組大鼠Persephin水平依次升高，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 各組大鼠神經元指標水平對比分析Tab 1 Comparison of neuron index levels among three

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，&P<0.05；與中劑量組比較，^P<0.05

Note: vs. the healthy control group,*P<0.05; vs. the blank control group,#P<0.05; vs. the low-dose group,&P<0.05; vs. the medium-dose group,^P<0.05

表2 各組大鼠Persephin水平比較Tab 2 Comparison of levels of Persephin among three

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，&P<0.05；與中劑量組比較，○P<0.05

Note: vs. the healthy control group,*P<0.05; vs. the blank control group,#P<0.05; vs. the low-dose group,&P<0.05; vs. the medium-dose group,○P<0.05

3.3 大鼠神經元指標水平與Persephin水平的相關性分析

經Pearson相關性檢驗分析，Persephin與NSE、MDA、SOD呈負相關性，與Bcl-2蛋白呈正相關性(P<0.05)，見表3。

表3 大鼠神經元指標水平與Persephin水平的相關性分析Tab 3 Correlation between neuron index levels and Persephin in rats

4 討論

腦損傷是臨床常見的顱腦損傷性疾病，在外力的刺激作用下出現(xiàn)腦部組織和功能的異常，其中機體神經元的損傷是造成腦部功能和機體全身活動調節(jié)異常的主要因素[5]。在腦損傷的病情進展過程中，鈣超載是神經元損傷的決定性因素；鈣超載后可激活一系列鈣依賴性酶，增加花生四烯酸的代謝，激活黃嘌呤氧化酶系，從而產生大量的氧化自由基，引起細胞損傷；因此，在腦損傷過程中，氧化應激反應起到促進作用[6]。NSE是腦損傷的敏感性指標，是參與糖酵解途徑的烯醇化酶中的一種，存在于神經組織和神經內分泌組織中。當機體出現(xiàn)缺血缺氧性腦損傷時，NSE水平顯著升高并迅速達到峰值，且與機體腦損傷程度呈現(xiàn)關聯(lián)性[7-9]。Bcl-2是重要的凋亡抑制基因，主要通過阻止細胞凋亡的早期環(huán)節(jié)而發(fā)揮作用，其阻止或降低細胞皺縮、染色質DNA裂解的發(fā)生。Bcl-2蛋白是一種膜結合蛋白，存在于細胞中的線粒體、核膜等處，主要生理功能是抑制細胞凋亡，延長細胞壽命，可抑制受損細胞發(fā)生壞死，在腦損傷及神經元功能調控中發(fā)揮重要作用[10]。Persephin屬于膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子家族中的一員，是神經營養(yǎng)因子，對于腦部神經系統(tǒng)的發(fā)育和維持及神經元功能運轉發(fā)揮重要的保護作用[11]。

丹參注射液的主要成分為丹參酮類物質，具有抑制血小板聚集、黏附和釋放的作用，能夠抑制機體的腺苷環(huán)化酶水平，抑制前列腺素的合成，進而發(fā)揮清除氧自由基的功能，產生抗脂質過氧化的效果，可對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用[12-13]。本研究以腦損傷大鼠為研究對象，考察了丹參注射液對大鼠神經元指標的改善情況，結果顯示，與健康對照組大鼠相比，空白對照組、丹參組大鼠的NSE、MDA及SOD水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低；且丹參組大鼠NSE、MDA及SOD水平明顯低于空白對照組，Bcl-2蛋白水平明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著丹參注射液劑量的升高，丹參組大鼠NSE、MDA及SOD水平依次降低，Bcl-2蛋白水平依次升高，組間比較的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明丹參注射液對于腦損傷大鼠的神經元指標水平有一定的改善作用，并隨著丹參給藥劑量的增加，改善效果更為顯著。在Persephin水平比較中，空白對照組、丹參組大鼠Persephin水平明顯低于健康對照組，丹參組大鼠Persephin水平明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著丹參注射液劑量的升高，丹參組大鼠Persephin水平依次升高，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明丹參注射液可提高腦損傷大鼠體內的Persephin水平。Persephin對體外培養(yǎng)的大鼠胚胎多巴胺能神經元的存活具有積極作用，并可促進多巴胺的攝取。經Pearson相關性檢驗分析，Persephin與NSE、MDA、SOD呈負相關性，與Bcl-2蛋白呈正相關性。提示丹參注射液通過促進Bcl-2蛋白和Persephin的高表達，改善大鼠的神經元指標水平，進而發(fā)揮治療腦損傷的作用。

綜上所述，丹參注射液能夠降低腦損傷對大鼠神經元的影響，降低NSE、MDA及SOD水平，升高Bcl-2蛋白、Persephin水平。丹參注射液發(fā)揮腦保護的作用機制可能與抗脂質過氧化、清除自由基，促進Bel-2蛋白和Persephin的高表達有關。本研究結果可為今后腦損傷的治療和丹參注射液的臨床應用提供新的思路。