基于網(wǎng)絡藥理學探討人參的免疫調節(jié)機制Δ

鄭厚勝，王英平，鄭斯文，白玉潔1,，唐玲玲

(1.吉林農業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118； 2.中國農業(yè)科學院特產(chǎn)研究所藥用植物資源與育種科技創(chuàng)新團隊，吉林 長春 130112； 3.吉林省電力醫(yī)院體驗科，吉林 長春 130021)

人參是世界上使用廣泛的草藥之一，自古以來，其在東亞地區(qū)都有廣泛的應用，我國從唐朝開始就有種植人參以作藥用的記載，因此積累了大量的人參藥用經(jīng)驗。在《神農本草經(jīng)》《傷寒論》和《本草綱目》等諸多著作中均有人參藥用記載，本草綱目認為人參“治男、婦一切虛癥”。人參的化學成分包括人參皂苷、多糖、黃酮類及揮發(fā)油等，其主要的藥理活性成分為人參皂苷和多糖，具有抗炎、提高機體免疫功能[1-3]、抗腫瘤[4-5]和抗病毒[6]等作用。盡管大量學者已經(jīng)努力研究了人參的分子機制，但仍不清楚人參多種成分組合如何發(fā)揮協(xié)同作用而產(chǎn)生臨床效果。運用傳統(tǒng)的西方藥理學研究方法難以對擁有復雜化學成分的系統(tǒng)性機制進行研究。因此，需要新穎的方法。近年來，網(wǎng)絡藥物學的出現(xiàn)填補了系統(tǒng)性闡明草藥機制的空白。網(wǎng)絡藥理學在分析草藥在人體內的作用時，側重于多種組分共同作用，多途徑、多靶點發(fā)揮作用[7]。本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法，探討了人參調節(jié)免疫的靶點和信號通路等。

1 資料與方法

1.1 人參有效成分、靶點的查詢與篩選

將人參輸入中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)，以TCMSP的默認閾值口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18作為有效成分的篩選條件，查詢并篩選該數(shù)據(jù)庫中所包含的人參有效活性成分及作用靶點，刪除無靶點蛋白的成分、重復靶點，制作成Excel表格。在Uniprot數(shù)據(jù)庫(http：//www.Uniprot.org/)中將篩選所得靶點轉化為基因名，種屬為：Homo sapiens(Human)，制作人參“成分-靶點”基因數(shù)據(jù)表格。

1.2 人參“成分-靶點”網(wǎng)絡的構建

將人參“成分-靶點”基因數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.6.1軟件，對數(shù)據(jù)進行分析，并將數(shù)據(jù)圖形化以網(wǎng)絡圖形式進行展示，以不同的節(jié)點表示數(shù)據(jù)類型，以連線表示相互作用關系。并通過該軟件插件CytoNCA[8]進行拓撲分析，根據(jù)節(jié)點度值(Degree)，篩選出人參的核心靶點。Degree越高，表示節(jié)點在該網(wǎng)絡中的作用越重要[9]。

1.3 疾病靶點的確定

通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)、治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)(https：//db.idrblab.org/ttd/)以及遺傳關聯(lián)數(shù)據(jù)庫(genetic association database，GAD)(http：//geneticassociationdb.nih.gov/)，檢索免疫相關靶點，刪除重復靶點，將獲取信息錄入Excel軟件中。將人參有效成分作用靶點與免疫相關靶點進行交集對比，最終獲得人參調節(jié)免疫的潛在作用靶點[10]。

1.4 基因通路與功能分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)，對人參調節(jié)免疫的潛在作用靶點進行基因本體(gene ontology，GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，Select Identifier設置為“()OFFICIAL_GENE_ SYMBOL”，List設置為“Homo sapiens”，確定“Current Background”為“Homo sapiens”，上傳數(shù)據(jù)，保存“Gene_Ontology”中的“GOTERM_ BP_DIRECT”(生物學過程)、“GOTERM_CC_DIRECT”(細胞組分)、“GOTERM_ MF_ DIRECT”(分子功能)；保存“Pathways”中的“KEGG_ PATH-WAY”[11]。

2 結果

2.1 人參有效成分及對應靶點

在OB≥30%、DL≥0.18的篩選條件下，獲得人參有效成分22種，見表1。22種有效成分中，有5種未找到對應靶點，去除非人基因，其余17種成分獲得潛在靶點118個。

表1 人參有效成分的基本信息(OB≥30%，DL≥0.18)Tab 1 Main active ingredients of ginseng(OB≥30%，DL≥0.18)

2.2 人參“成分-靶點”網(wǎng)絡

人參“成分-靶點”網(wǎng)絡圖見圖1。該圖包含節(jié)點135個(右側菱形節(jié)點為成分，左側圓形節(jié)點為靶點)，邊線252條；其中，成分Degree平均值為3.306，Degree>平均值的成分有11個，Degree最高者為“Kaempferol”，其余依次為“Beta-sitosterol”“Stigmasterol”“Fumarine”“Inermin”“Frutinone A”“Suchilactone”“Ginsenoside rh2”“Girinimbin”“Aposiopolamine”和“Arachidonate”。

圖1 人參“成分-靶點”網(wǎng)絡圖Fig 1 Composition-Target network of ginseng

2.3 免疫相關靶點數(shù)據(jù)構建及比對分析

在Uniprot、TTD和GAD數(shù)據(jù)庫共篩選出2 083個基因組建免疫相關靶點數(shù)據(jù)庫。對人參有效成分作用靶點與免疫相關靶點進行核查比對，共得出24個核心作用靶點基因，包括“IL1B”、“IFNG”、“TNF”、“CYP1A1”和“TGFB1”等，其中“IGHG1”在多個數(shù)據(jù)庫中沒有記錄，因此不對其進行分析。人參有效成分作用靶點與免疫相關靶點韋恩圖見圖2。人參有效成分作用靶點與免疫相關靶點的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡關系見圖3。人參有效成分對免疫作用靶點的拓撲學分析見表2。經(jīng)Network Analyzer分析網(wǎng)絡拓撲學屬性發(fā)現(xiàn)，該PPI網(wǎng)絡中，聚類系數(shù)為0.644，平均節(jié)點Degree為9.04，平均最短路徑為1.78，中介中心性為0 ～0.027，接近中心性為0～0.77，其中22個重疊靶點在關系網(wǎng)絡中體現(xiàn)了較好的連通特性，是人參發(fā)揮免疫調節(jié)作用的關鍵靶點。

圖2 人參有效成分作用靶點與免疫相關靶點韋恩圖Fig 2 Venn diagram of active ingredients in ginseng and immune-related targets

圖3 人參有效成分作用靶點與免疫相關靶點的PPI網(wǎng)絡關系Fig 3 PPI network relationship between active components and immune related targets of Panax ginseng

表2 人參有效成分對免疫作用靶點的拓撲學分析Tab 2 Topological analysis of active ingredients of ginseng on immune-related targets

A.生物學過程；B.細胞組分；C.分子功能A.biological process； B.cell component； C.molecular function圖4 PPI網(wǎng)絡中的GO條目(FDR<0.05的前20個)Fig 4 GO items in PPI network (Top 20 of FDR<0.05)

2.4 GO功能富集分析

利用DAVID平臺對核心靶點進行GO功能富集分析，共確定了226個GO條目，根據(jù)錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05篩選，根據(jù)各功能的FDR列出前20個GO條目，見圖4。其中，生物學過程相關條目178個，主要涉及細胞對有機環(huán)狀化合物的反應、對藥物的反應、核因子κB轉錄因子活性的正調節(jié)、γ干擾素介導的信號通路、細胞凋亡過程、基因表達的負調控及趨化因子生物合成過程的積極調節(jié)等方面；分子功能相關條目31個，主要涉及細胞因子活性、各類蛋白結合、酶類結合、轉錄因子結合及DNA結合等方面；細胞組分相關條目17個，主要涉及膜筏、核因子κB抑制蛋白/核因子κB復合物、細胞質膜、神經(jīng)元投射及內質網(wǎng)等方面。

2.5 KEGG通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選出的核心靶點進行KEGG通路富集分析，對人參有效成分PPI網(wǎng)絡中涉及的24個蛋白在信號通路中的作用進行通路富集分析，得到66條信號通路。以P<0.01、FDR<0.05進行篩選，其中前20條通路包括弓形體病通路、破骨細胞分化通路、乙型肝炎通路、細胞凋亡通路、南美錐蟲病(美洲錐蟲病)通路、腫瘤壞死因子信號通路、甲型流感通路、肺結核通路、利什曼病通路、惡性腫瘤的途徑通路、核因子κB信號通路、阿米巴病通路、小細胞肺癌通路、瘧疾通路、軍團病通路、Toll樣受體信號通路、單純皰疹感染通路、炎癥性腸病通路、胰腺癌通路及非洲錐蟲病通路，表明人參的有效成分可能通過作用于上述信號通路來發(fā)揮藥理活性。運用Omicshare平臺(http：//www.omicshare.com/tools/index.php/)對富集分析結果進行可視化處理，結果見圖5。

3 討論

中草藥使用歷史悠久，積累了大量的人體應用經(jīng)驗，理論體系豐富，但其復雜的物質組分導致其作用機制難以明確。網(wǎng)絡藥理學運用中藥藥劑學、藥理學、蛋白組學、代謝組學及基因組學等學科的大數(shù)據(jù)，將中藥復雜的作用機制通過網(wǎng)絡學科語言呈現(xiàn)出來，不再局限于以往單成分、單靶點的研究方式，從整體的角度去研究藥物與疾病間的關聯(lián)性，明確中藥的多種成分通過作用于不同的蛋白靶標，協(xié)同性地調控機體的生物功能及信號通路，從而發(fā)揮其獨特的療效。網(wǎng)絡藥理學是中醫(yī)藥科學發(fā)展的有力工具，為中藥的研究方向提供了指導。

根據(jù)網(wǎng)絡藥理學的研究方法，本研究篩選了17種在TCMSP數(shù)據(jù)庫中有對應靶點的化學成分，構建人參“成分-靶點”網(wǎng)絡，分析成分與靶點的相互作用關系。人參“成分-靶點”網(wǎng)絡中的關鍵化合物為β-谷甾醇、豆甾醇和富馬堿等。β-谷甾醇與豆甾醇同屬植物甾醇類化合物，藥理活性大多相似[12-13]，具有抗氧化[14]、降低膽固醇[15]、抗炎[16]和抗腫瘤[17]等功效。人參皂苷rh2具有抗腫瘤[18]、提高免疫功能[19]等功效。吉九里香堿可以通過磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt和Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路抑制人體卵巢癌細胞的體外增殖[20]；還通過阻滯細胞G0/G1期誘導細胞凋亡來抑制HepG2細胞的增殖[21]。

將人參有效成分作用靶點與免疫靶點進行交集，得到共同作用靶點24個，其中“TNF”和“IL1B”是最接近中心的靶點，“CASP3”次之。目前，關于人參通過對“TNF”和“IL1B”調控影響免疫功能的研究很多，因此本研究結果具有極高的可信度。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的可直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子之一，主要為TNF-α、TNF-β。TNF是一種多效因子，參與多種生理活動。TNF可直接作用于T細胞、B細胞及自然殺傷細胞等效應細胞，促進T細胞MHC-Ⅰ類抗原表達，增強依賴IL-2的胸腺細胞、T細胞增殖能力，促進IL-2、巨噬細胞集落刺激因子等淋巴因子產(chǎn)生，TNF與γ干擾素聯(lián)合作用直接誘導腫瘤細胞的永久性生長停滯，這可能是生物體阻止惡性腫瘤的機制[22]。持續(xù)存在TNF-α是保持興奮性突觸的突觸強度所必需的。通過對AMPA受體運輸?shù)挠绊?，TNF-α可能在突觸可塑性和調節(jié)對神經(jīng)損傷的反應中起作用[23]。IL-1β由活化的巨噬細胞產(chǎn)生，通過誘導IL-2釋放、B細胞成熟和增殖以及成纖維細胞生長因子活性來刺激胸腺細胞增殖。IL-1蛋白參與炎癥反應，被鑒定為內源性熱原，據(jù)報道，西洋參莖葉總皂苷可通過降低IL-1β的表達，降低炎癥反應，減輕大鼠腦神經(jīng)功能損傷程度，減輕腦水腫，從而對局灶性腦缺血損傷起到保護作用[24]。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)是細胞內半胱氨酸蛋白酶，在損傷細胞的細胞凋亡反應中被激活。人類原代細胞在TNF或化療藥激活Caspase-3后表現(xiàn)出Gasdermin E(GSDME)蛋白依賴性的細胞凋亡，這有助于緩解化療的毒性[25]。

圖5 KEGG機制分析Fig 5 KEGG mechanism analysis

為了進一步了解24個共同作用靶點的功能和作用通路，對其進行了GO功能富集和KEGG通路富集分析。發(fā)現(xiàn)人參在免疫方面主要能夠調控核因子κB轉錄因子活性的正調節(jié)、γ干擾素介導的信號通路、細胞凋亡過程、基因表達的負調控、趨化因子生物合成過程的積極調節(jié)及細胞因子活性等方面；涉及多條與惡性腫瘤有直接關系的通路，包括惡性腫瘤的途徑、小細胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌及結直腸癌等；與免疫有直接關系的通路包括TNF信號通路、核因子κB信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、趨化因子信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性及B細胞受體信號通路等。目前，已有多項研究結果表明，人參可以增強人體免疫功能，減輕化療引起的免疫抑制，提高疾病控制率[26-28]。但其活性成分復雜，作用機制難以分析，希望通過本研究能為以后的實驗提供一定幫助。

綜上所述，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，分析了人參在人體內多種組分的共同作用，多途徑、多靶點發(fā)揮作用，對進一步了解人參的作用機制提供了一定參考，為后續(xù)從人參中選取有效藥物成分、選取研究靶點提供了依據(jù)。在大數(shù)據(jù)時代，隨著各種研究數(shù)據(jù)的不斷豐富，網(wǎng)絡藥理學的分析結果也將越來越科學，越來越接近真實，這將是未來中醫(yī)藥理論發(fā)展的一個方向。