CPNE7在口腔組織再生中的相關(guān)研究進(jìn)展

劉紫奇，葛少華

鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅶ(calcium phospholipid-binding protein Ⅶ，Copine Ⅶ，CPNE7)最初主要被認(rèn)為在促進(jìn)腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用。近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CPNE7主要由前成釉細(xì)胞分泌，在細(xì)胞發(fā)育過程中易位進(jìn)入前成牙本質(zhì)細(xì)胞參與牙齒發(fā)育的整個(gè)過程。隨著組織工程學(xué)及再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，CPNE7成為口腔組織再生工程的熱點(diǎn)。CPNE7除了能夠誘導(dǎo)牙源性/非牙源性細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化、促進(jìn)牙本質(zhì)細(xì)胞分化形成牙本質(zhì)以外，在促進(jìn)牙周組織再生及促進(jìn)成骨方面的功能也相繼被發(fā)現(xiàn)，其在口腔組織再生方面的潛在作用受到廣泛的關(guān)注。

1 CPNE7在口腔組織再生中的發(fā)現(xiàn)

CPNE7最早在乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)，分離并鑒定為2.6 kb的cDNA[1]，與Copine家族成員Copine Ⅰ、Copine Ⅲ和N-copine都屬于鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白[2-3]。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，前成釉細(xì)胞培養(yǎng)液(preameloblast-conditioned medium，PA-CM)除了誘導(dǎo)牙髓再生外還能促進(jìn)牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)的牙源性分化，并在體內(nèi)和體外促進(jìn)牙本質(zhì)的形成[4-6]。然而PA-CM中含有多種蛋白衍生因子，為了鑒定其中能夠促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和牙本質(zhì)形成的新因素，2011年Lee等通過液相色譜-質(zhì)譜法分析了PA-CM，檢測后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中的CPNE7可將牙本質(zhì)唾液磷蛋白(dentin sialo- phosphoprotein，DSPP)啟動(dòng)子活性提高約3.5倍[5]，這說明CPNE7是參與成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的候選基因?；谶@個(gè)發(fā)現(xiàn)，口腔組織再生研究者們?cè)谘辣举|(zhì)再生、牙周組織再生、骨再生及腫瘤等方面對(duì)CPNE7展開了全方位多角度的研究，自此CPNE7成為口腔組織再生工程的熱點(diǎn)研究方向。

2 CPNE7促進(jìn)牙本質(zhì)再生及其機(jī)制

牙本質(zhì)是保護(hù)牙髓的重要硬組織，而齲壞或外傷是導(dǎo)致牙本質(zhì)缺失、牙髓暴露的兩大主要因素。處理各種原因引起的意外露髓的首要目標(biāo)是保存活髓，因而快速形成修復(fù)性牙本質(zhì)以保護(hù)牙髓成為研究者關(guān)注的內(nèi)容。牙本質(zhì)再生是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程,多種生長因子共同參與它的調(diào)控。

CPNE7作為PA-CM衍生因子，是參與成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的候選信號(hào)分子[5]。Oh等的研究發(fā)現(xiàn)，CPNE7是由前成釉細(xì)胞分泌的一種可擴(kuò)散的信號(hào)分子，它在前成釉細(xì)胞中表達(dá)并在成釉細(xì)胞分化過程中分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中，之后易位進(jìn)入成牙本質(zhì)細(xì)胞調(diào)控上皮-間充質(zhì)相互作用的應(yīng)答反應(yīng)，最終通過調(diào)控DSPP的表達(dá)來調(diào)節(jié)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和礦化[7]。在這些研究的基礎(chǔ)上，Seo等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CPNE7由前成釉細(xì)胞易位進(jìn)入成牙本質(zhì)細(xì)胞的過程主要通過質(zhì)膜囊泡依賴性受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用完成。CPNE7先與其表面受體核仁素(Nucleolin)相結(jié)合，識(shí)別后由細(xì)胞質(zhì)膜囊泡介導(dǎo)的內(nèi)吞作用實(shí)現(xiàn)這一過程；同時(shí)CPNE7與受體Nucleolin結(jié)合后形成CPNE7-Nucleolin復(fù)合體，進(jìn)一步調(diào)節(jié)纖毛的生成并刺激DSPP的表達(dá)，從而參與成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化及牙本質(zhì)形成[8]。近期的兩項(xiàng)研究表明CPNE7不僅與早期釉質(zhì)形成中DSPP的表達(dá)有關(guān)，而且在牙齒的整個(gè)發(fā)育過程中呈動(dòng)態(tài)表達(dá)，提示其在牙齒發(fā)育的每個(gè)階段都發(fā)揮著重要作用[9-10]。

此外，有研究將CPNE7應(yīng)用于比格犬牙本質(zhì)缺損模型，表明用CPNE7間接蓋髓可促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化形成第三期牙本質(zhì)，很好地保存了牙髓活力；同時(shí)研究人員觀察到缺損牙本質(zhì)下方的牙本質(zhì)小管被礦物質(zhì)沉積所阻塞且不存在微滲漏，但在對(duì)照組中，所有缺損處的牙本質(zhì)小管均呈開放狀態(tài)，這很好地證明了CPNE7能夠促使缺損對(duì)應(yīng)處的牙本質(zhì)小管內(nèi)形成牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體及修復(fù)性牙本質(zhì)，可以有效改善牙本質(zhì)過敏癥狀[11-12]。因此，CPNE7在間接蓋髓并緩解牙本質(zhì)敏感方面具有臨床轉(zhuǎn)化的潛在優(yōu)勢，但仍需大量臨床前期實(shí)驗(yàn)對(duì)其作用及機(jī)制進(jìn)行深入探討。

3 CPNE7促進(jìn)牙周組織再生

牙周炎是發(fā)生在牙周組織的慢性感染性疾病，以牙齦出血和炎癥、牙周袋形成、牙槽骨吸收、牙齒松動(dòng)和移位為主要表現(xiàn)，其中牙周組織的破壞是不可逆的[13]。牙周炎的理想治療目標(biāo)是獲得牙周組織結(jié)構(gòu)和功能的重建，通過恢復(fù)已被牙周疾病或創(chuàng)傷損壞的牙周組織的原始狀態(tài)(包括牙周膜，牙骨質(zhì)，牙槽骨或牙齦)來產(chǎn)生新的附著[14-15]。臨床上對(duì)牙周組織再生的主要治療方式有引導(dǎo)性組織再生術(shù)(guided tissue regeneration，GTR)[16]、牙周植骨術(shù)[17]、生長因子治療等[18]。

目前有研究報(bào)道，將CPNE7應(yīng)用于完全去除牙周膜的比格犬牙根表面時(shí)，CPNE7能夠促進(jìn)牙骨質(zhì)樣組織形成，但形成的牙周膜樣組織的數(shù)量與對(duì)照組相比沒有顯著差異[19]。盡管CPNE7對(duì)牙周膜樣組織形成的促進(jìn)效果仍需深入研究，但值得肯定的是類牙骨質(zhì)的形成為新生的牙周膜纖維樣組織提供了附著位點(diǎn)，有利于牙周組織再生。在此基礎(chǔ)上，一個(gè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CPNE7能促進(jìn)牙周膜細(xì)胞中牙骨質(zhì)附著蛋白(cementum attachment protein，CAP)的表達(dá)，該基因支持牙周來源的細(xì)胞附著在牙骨質(zhì)上，然而CPNE7對(duì)其他成牙骨質(zhì)相關(guān)基因，如成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor 2，Runx2)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨鈣素(osteocalcin，OC)、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體(osterix，OSX)等的表達(dá)以及牙周膜細(xì)胞的增殖、遷移沒有顯著影響；但在比格犬牙周缺損模型中CPNE7能夠促進(jìn)牙周復(fù)合體產(chǎn)生且可以更好地促進(jìn)牙周膜樣纖維的排列——使其排列與牙根部新形成的牙骨質(zhì)和牙槽骨垂直，類似于Sharpey’s纖維[20]。因此，CPNE7可能通過上調(diào)CAP的表達(dá)來支持牙周膜細(xì)胞附著在牙骨質(zhì)上并促進(jìn)牙周膜纖維的生理排列，從而在牙周組織再生中發(fā)揮功能性作用。

另外，CPNE7能夠在體外增加牙骨質(zhì)樣組織形成的原因可能是：CPNE7本身具有高鈣離子結(jié)合力，這種鈣離子親和力可能有助于牙骨質(zhì)礦化[11]；CPNE7可以在體內(nèi)促進(jìn)牙本質(zhì)的形成，而正常的無細(xì)胞牙骨質(zhì)需要形成正常的牙本質(zhì)[7，21]；在牙囊細(xì)胞(dental follicle cells，DFCs)中同樣可以檢測到CPNE7，因而也有理由認(rèn)為趨化性物質(zhì)可能來自新形成的根部牙本質(zhì)，通過促進(jìn)DFCs遷移以促進(jìn)牙骨質(zhì)生成[20]。因此CPNE7具有應(yīng)用于治療臨床牙周缺損，促進(jìn)生理性牙周結(jié)構(gòu)再生的潛力。

4 CPNE7及其衍生肽促進(jìn)成骨

牙周組織再生除了需要促進(jìn)牙周膜纖維恢復(fù)正常排列以外，恢復(fù)已缺損的骨組織也是必不可少的。骨組織的再生常使用生長因子和激素來誘導(dǎo)，例如骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)[22]，甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)[23]，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)[24]和硬化蛋白抗體(sclerosin antibody，Scl-Ab)[25]。盡管已有研究證明這些生物活性分子的成骨潛力，但由于其潛在的免疫原性、分子的不穩(wěn)定性以及產(chǎn)生相關(guān)副作用等問題的存在，其臨床應(yīng)用仍然受到限制[26-27]。

2015年Fosgerau等研究發(fā)現(xiàn)具有安全性和相似生物活性的蛋白質(zhì)片段(如肽)能夠克服蛋白質(zhì)生物制劑的當(dāng)前缺點(diǎn)，與全蛋白相比，合成肽在再生治療中具有降低免疫原性、減緩降解和降低致癌性等優(yōu)勢[28]。同時(shí)已經(jīng)開發(fā)出的生物材料可以增強(qiáng)其細(xì)胞粘附性等功能[27]。

在此研究基礎(chǔ)上，最近的研究發(fā)現(xiàn)CPNE7應(yīng)用于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)時(shí)具有誘導(dǎo)成骨的潛能[11，29-30]。2015年Oh等研究表明CPNE7可以誘導(dǎo)牙源性或非牙源性MSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，并易位進(jìn)入成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)其形成礦化結(jié)節(jié)[29]。同年，Choung所在的研究團(tuán)隊(duì)通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)同時(shí)證明了前成釉細(xì)胞衍生因子是通過Runx2-OSX-BSP信號(hào)介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)的成骨分化并促進(jìn)骨形成，其中CPNE7與其他前成釉細(xì)胞來源的因子共同促進(jìn)該成骨過程，但CPNE7促進(jìn)成骨的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究[30]。隨后，2016年Choung團(tuán)隊(duì)為探究鈣與CPNE7的親和力，對(duì)其進(jìn)行了鈣結(jié)合測定，結(jié)果表明CPNE7具有很強(qiáng)的鈣離子結(jié)合能力，這說明CPNE7本身特有的高鈣離子親和力是其促進(jìn)MSCs礦化成骨的原因之一[11]。

盡管CPNE7具有成骨潛力，但由于其分子尺寸較大和半衰期短的缺陷在臨床應(yīng)用中顯示出有限的活性。為進(jìn)一步解決這個(gè)問題，Lee等在最近的研究中發(fā)現(xiàn)CPNE7的6種衍生肽——CDP1-CDP6，它們能夠穿透細(xì)胞且表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性以及高誘導(dǎo)成骨性的特點(diǎn)，通過對(duì)六種生物活性合成肽成骨潛能進(jìn)行測試，證明CDP4在DPSCs中的細(xì)胞穿透活性以及成骨效率是最強(qiáng)的；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠顱骨缺損模型中，CPNE7衍生肽CDP4與可注射凝膠相結(jié)合可促進(jìn)骨再生[31]。該研究首次探明了CDP4在體內(nèi)的骨再生率，盡管CDP4是一個(gè)早期釋放的肽，但由CDP4誘導(dǎo)的骨形成效果與最有效的BMP-2的效果相當(dāng)，因此CDP4很可能在臨床應(yīng)用中代替BMP-2，成為新一代高效骨形成劑。同時(shí)CDP4可與生物材料結(jié)合使用，并在骨組織工程領(lǐng)域發(fā)揮著較高的成骨功效，有望進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)牙周組織缺損中的骨組織再生。

5 CPNE7在腫瘤性疾病發(fā)生發(fā)展中的影響

癌癥等惡性疾病的發(fā)生與基因調(diào)控有著密不可分的關(guān)系[32]，此前有研究表明CPNE7可能與乳腺癌[1]、宮頸癌[33]及白血病[34]的發(fā)生相關(guān)。Atsumi等的研究表明，與腫瘤相關(guān)的炎癥可以誘導(dǎo)腫瘤本身或其周圍的細(xì)胞釋放各種因子，從而形成促進(jìn)腫瘤發(fā)展的微環(huán)境，而炎癥放大因子是導(dǎo)致炎癥發(fā)生的主要機(jī)制。同時(shí)該團(tuán)隊(duì)證實(shí)，CPNE7作為細(xì)胞中炎癥放大因子的靶基因之一參與炎癥發(fā)生與癌癥發(fā)展的過程。因此CPNE7與其他炎癥放大因子相關(guān)基因很可能成為控制癌癥發(fā)生發(fā)展的潛在治療靶標(biāo)[35]。盡管目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)證明CPNE7與口腔癌的發(fā)生發(fā)展有直接關(guān)系，但有證據(jù)表明慢性炎癥可能是導(dǎo)致口腔癌發(fā)生的主要因素[36-37]，尤其是伴有牙周炎的患者，其發(fā)生口腔癌的概率是非牙周炎患者的2.66倍[37]。因此，是否可以通過調(diào)控CPNE7的表達(dá)來消除口腔炎癥從而控制口腔癌的進(jìn)展，將會(huì)成為我們未來研究的熱點(diǎn)問題。

6 小 結(jié)

本文主要介紹了CPNE7作為Copine家族成員在促進(jìn)牙本質(zhì)再生、牙周組織再生、骨組織再生以及在癌癥發(fā)生發(fā)展中的研究進(jìn)展。CPNE7已被證實(shí)在口腔組織中再生中有著巨大潛力，尤其是促進(jìn)牙本質(zhì)再生方面。目前國內(nèi)外學(xué)者已深入研究了CPNE7在促進(jìn)牙本質(zhì)再生方面的相關(guān)條件與機(jī)制，這為口腔組織再生工程中牙本質(zhì)修復(fù)提供了新的發(fā)展前景，但相關(guān)研究一直局限于體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物模型，尚缺乏臨床試驗(yàn)，有待進(jìn)行臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。同時(shí)CPNE7在牙周組織再生和骨再生中也起到促進(jìn)作用，有望在未來的研究中實(shí)現(xiàn)牙周炎缺損模型中牙周組織的修復(fù)再生。另外，雖然該蛋白在一些惡性疾病的發(fā)生發(fā)展中可能起到誘導(dǎo)作用，但致病機(jī)制仍不明確，尚需大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入探究?？傊?，CPNE7在組織再生方面受到越來越多的關(guān)注，有望開辟口腔組織再生工程的新領(lǐng)域。