仿生生物分子材料在牙體硬組織再礦化中的應(yīng)用

金啟予，鄧淑麗，胡濟(jì)安

齲齒會(huì)導(dǎo)致牙體硬組織的破壞。隨著對(duì)齲病研究的深入，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)齲病是一個(gè)脫礦與再礦化的過程。當(dāng)牙齒表面有牙菌斑附著時(shí)，細(xì)菌代謝的產(chǎn)物如乳酸等會(huì)改變牙齒表面的微環(huán)境，使鈣離子、磷酸鹽離子濃度下降從而導(dǎo)致牙齒表面脫礦與再礦化的平衡被打破，齲病因此產(chǎn)生[1]。有學(xué)者臨床研究發(fā)現(xiàn)抑制脫礦的再礦化治療能夠有效逆轉(zhuǎn)早期齲損[2]。目前臨床上常用的再礦化藥物主要為氟及氟化物、不定形磷酸鈣(amorphous calcium phosphate，ACP)制劑等。氟及氟化物低濃度再礦化的作用不明顯，而過高濃度會(huì)對(duì)人體有害。此外，氟及氟化物對(duì)于光滑面齲的阻斷治療有顯著效果,但對(duì)點(diǎn)隙窩溝齲作用有限，而后者是臨床上最主要的齲損部位之一。ACP制劑主要通過增加牙齒表面鈣離子和磷酸根離子濃度來促進(jìn)再礦化，多用于牙膏中，作用緩慢且效果不明確[3]。

由于以上原因，臨床常用的再礦化制劑存在不足，因此有些學(xué)者希望從仿生學(xué)的方面解決這一問題。本文主要講述牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)仿生再礦化材料在口腔臨床治療中的應(yīng)用。

口腔中牙齒的仿生再礦化主要包括牙釉質(zhì)的仿生再礦化和牙本質(zhì)的仿生再礦化。根據(jù)以往的研究，牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的發(fā)育成熟都是由相應(yīng)細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)所調(diào)控[4]。研究這些因子對(duì)牙體硬組織礦化的作用并將之應(yīng)用就是仿生再礦化材料應(yīng)用的重點(diǎn)。

1 牙釉質(zhì)再礦化

牙釉質(zhì)主要為成釉細(xì)胞由內(nèi)向外分泌形成的磷酸鹽晶體組成。此外，釉質(zhì)中有1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的有機(jī)物，主要為蛋白質(zhì)和脂類。釉質(zhì)蛋白在釉質(zhì)晶體的成核和生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。根據(jù)目前的非經(jīng)典結(jié)晶理論，釉質(zhì)晶體為有機(jī)無機(jī)基質(zhì)相結(jié)合而形成[5]。成釉細(xì)胞分泌蛋白形成銜接釉牙骨質(zhì)界和成釉細(xì)胞的雛晶。當(dāng)雛晶生長(zhǎng)至一定長(zhǎng)度時(shí)成釉細(xì)胞分泌蛋白酶，減少釉質(zhì)基質(zhì)中的有機(jī)物，使雛晶停止伸長(zhǎng)的同時(shí)加快礦物質(zhì)沉積，使雛晶寬度、厚度變大而釉質(zhì)發(fā)育成熟[6]。一般來講這個(gè)過程為3～4年，在釉質(zhì)發(fā)育成熟后其礦化一般不會(huì)產(chǎn)生變化。目前誘導(dǎo)牙釉質(zhì)再礦化機(jī)制主要為用仿生材料使礦物離子聚集成核成為礦化中心——ACP[7]。主要的仿生牙釉質(zhì)再礦化材料為釉原蛋白、多肽、樹狀聚合物、氨基酸、磷酸鈣納米粒子。

1.1 釉原蛋白

釉原蛋白是牙釉質(zhì)發(fā)育過程中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，許多體外研究表明釉原蛋白在控制磷灰石的定向和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用[8]。釉原蛋白水溶膠能穩(wěn)定Ca-P團(tuán)簇并將其排列成線性鏈，然后該線性鏈會(huì)發(fā)展成類似釉質(zhì)的共排列晶體。Ruan等[9]報(bào)道了一種新型的釉蛋白-殼聚糖(CS-AMEL)水凝膠仿生材料，用于人牙釉質(zhì)再礦化(CS-AMEL水凝膠為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的殼聚糖、2.5 mm鈣和1.5 mm磷酸鹽，過飽和度為8.23，含200 μg/mL全長(zhǎng)釉原蛋白)。Ruan等[9]實(shí)驗(yàn)表明在CS-AMEL體系中，只有在一定條件下才能形成類琺瑯質(zhì)的有序磷灰石晶體，這取決于水凝膠粘度和過飽和度對(duì)磷灰石的協(xié)同作用。

1.2 多肽

眾所周知天然的蛋白如釉原蛋白很難大量獲取，因此有些學(xué)者轉(zhuǎn)而進(jìn)行含有相同功能的蛋白質(zhì)類似物的制備。酪蛋白磷酸肽(CPP)是從乳汁中提取的與牙齒生物礦化有關(guān)的蛋白質(zhì)類似物。它含有磷酸化絲氨酸殘基團(tuán)簇，并能通過形成非晶態(tài)納米絡(luò)合物穩(wěn)定鈣和磷酸根離子[10]。Kwak等[11]發(fā)現(xiàn)富含亮氨酸的釉原蛋白肽(LRAP)可以有效地指導(dǎo)針狀羥基磷灰石(HAP)晶體在體外有序排列的形成，達(dá)到體外礦化效果。Kind等[12]設(shè)計(jì)了自組裝肽(P11-4，Ace-Gln-Gln-Arg-Phe-GluTrp-Glu-Phe-Glu-Gln-Gln-NH2)，可以作為HAP成核所需的仿生支架樹狀聚合物促進(jìn)齲病脫礦區(qū)釉質(zhì)的再礦化。

1.3 樹枝狀聚合物

目前主要的樹狀聚合物為聚酰胺-胺型樹枝狀分子(PAMAM)，即人工蛋白。PAMAM作為脫礦牙釉質(zhì)表面的有機(jī)框架，能誘導(dǎo)形成與天然牙釉質(zhì)具有相同結(jié)構(gòu)、方向和礦物質(zhì)的HAP[13]。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)通過在 PAMAM 上加載羧基基團(tuán)(-COOH) 而形成了PAM-AM-COOH 聚合物。這種聚合物具有很強(qiáng)的自組裝成具有納米球、納米鏈、微纖維以及最終組成宏觀聚集體的層次結(jié)構(gòu)的傾向。這種性質(zhì)與人釉原蛋白相同并能促進(jìn)牙釉質(zhì)的再礦化。Chen等[15]通過電鏡觀察體外蝕刻釉質(zhì)的表面PAMAM-COOH聚合物，發(fā)現(xiàn)PAMAM-COOH聚合物可作為釉質(zhì)表面和礦化溶液中的有機(jī)模板，控制新生長(zhǎng)晶體的成核位點(diǎn)和形態(tài)，從而形成類似人類釉質(zhì)的仿生結(jié)構(gòu)。

1.4 殼聚糖

殼聚糖(chitosan)為天然多糖甲殼素脫除部分乙?；漠a(chǎn)物。經(jīng)學(xué)者研究，殼聚糖能用螯合作用穩(wěn)定鈣離子并與羥基磷灰石晶體表面結(jié)合，從而促進(jìn)釉質(zhì)表面再礦化[16]。姚靜等[17]對(duì)殼聚糖進(jìn)行磷酸化改性并和明膠進(jìn)行交聯(lián)形成復(fù)合物，復(fù)合物大分子膜接枝到牙體組織表面，在X射線衍射下觀察到快速、致密的釉質(zhì)再礦化。宋金花等[18]制備羧甲基殼聚糖(CMC)-溶菌酶(LYZ)凝膠并將其抹于酸蝕的牙釉質(zhì)表面，在掃描電鏡下見脫礦后的釉質(zhì)表面有新的晶體形成。

1.5 磷酸鈣納米粒子

人體牙釉質(zhì)礦化過程是一種有機(jī)基質(zhì)介導(dǎo)的非經(jīng)典結(jié)晶途徑，非晶態(tài)納米前體的穩(wěn)定化是釉質(zhì)仿生礦化中非常重要的一步[19]。ACP比磷酸鈣的晶型更易溶解，因此在水溶液中很容易轉(zhuǎn)化為HAP，從而促進(jìn)牙釉質(zhì)的再礦化。Ruan等[9]基于磷酸化蛋白在牙釉質(zhì)生物礦化中的影響，合成了磷酸化殼聚糖和ACP的納米復(fù)合物，以使牙釉質(zhì)早期齲齒再礦化。研究結(jié)果表明，牙釉質(zhì)再礦化后，牙釉質(zhì)表面未形成類似牙釉質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但損傷已再礦化。這些體外研究證明以ACP為基礎(chǔ)的材料在預(yù)防和修復(fù)牙釉質(zhì)早期損傷方面的潛力，然而，這些作用尚未在臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)。

2 牙本質(zhì)再礦化

與牙釉質(zhì)發(fā)育相同，根據(jù)非經(jīng)典結(jié)晶理論，牙本質(zhì)也是由無機(jī)礦化物和有機(jī)細(xì)胞外基質(zhì)交替結(jié)合共同促進(jìn)發(fā)育。其中無機(jī)礦化物主要為HAP，有機(jī)細(xì)胞外基質(zhì)主要為成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌的膠原。成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌膠原中的Ⅰ型膠原分子被學(xué)者認(rèn)為在牙本質(zhì)形成過程中起重要作用[20]。當(dāng)組裝成原纖維時(shí)，三層螺旋狀膠原Ⅰ單體分子堆積成原纖維，在電子顯微鏡下觀察到礦物晶體周期性地連續(xù)穿過原纖維。其中帶正電荷和負(fù)電荷的氨基酸殘基為磷酸根及鈣離子沉積提供良好的三維環(huán)境，為羥基磷灰石晶體成核提供表面。除膠原外，非膠原蛋白(non-collagenous proteins，NCP)也在牙本質(zhì)發(fā)育過程中起引導(dǎo)作用[20-21]。非膠原蛋白主要為具有較強(qiáng)鈣離子和HA晶體結(jié)合能力的一類酸性蛋白質(zhì)，如小整合素結(jié)合配體N端連接糖蛋白(small integrin binding ligand N-1inked glyeoproteins，SIBLING)，其家族成員主要有牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentin matrix protein-1，DMP-1)、牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)和牙本質(zhì)磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)[22]。非膠原蛋白有著穩(wěn)定礦化前驅(qū)體、提供成核結(jié)構(gòu)等作用。此外，同釉質(zhì)礦化一樣，牙本質(zhì)礦化也與ACP濃度有關(guān)。因此，主要的牙本質(zhì)仿生再礦化材料為膠原、非膠原蛋白、樹狀聚合物、磷酸鈣納米粒子等。

2.1 膠原

同上所述，膠原可以為磷酸根及鈣離子提供三維網(wǎng)架及成核位面。因此，膠原作為牙本質(zhì)仿生再礦化材料是實(shí)現(xiàn)牙本質(zhì)再礦化的最直觀材料?？拙S婧等[23]采用腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)進(jìn)行Ⅰ型膠原磷酸化，在透射電鏡和掃描電鏡下觀察到50 mmol/L ATP預(yù)處理的Ⅰ型膠原及脫礦牙本質(zhì)的礦化效果較對(duì)照組明顯提升。李娜等[24]在膠原溶膠-凝膠體系中加入β-甘油磷酸鈉(β-GP)、聚丙烯酸(PAA)和三聚磷酸鈉(TPP)，構(gòu)建了納米羥基磷灰/膠原(n-HA/COL)復(fù)合支架材料。在掃描電鏡下他們觀察到膠原纖維組織，證實(shí)與礦化同步進(jìn)行，認(rèn)為陳化處理有利于HAP晶體的結(jié)晶。

2.2 非膠原蛋白

同上，非膠原蛋白(NCP)也擁有穩(wěn)定無定形礦化前驅(qū)體、調(diào)控牙本質(zhì)再礦化的作用。因此許多學(xué)者也嘗試了使用NCP及其衍生物來誘導(dǎo)牙本質(zhì)再礦化。He[25]發(fā)現(xiàn)DMP-1在體外加速了膠原原纖維的組裝，并且還增加了重建的膠原原纖維的直徑，由此認(rèn)為DMP1和可能的其他非膠原蛋白在膠原原纖維上的特異性結(jié)合可能是膠原基質(zhì)組織和礦化的關(guān)鍵步驟。另外牙本質(zhì)基質(zhì)中的DPP被認(rèn)為有調(diào)控牙本質(zhì)礦化過程的作用，可誘導(dǎo)羥基磷灰石晶體成核和生長(zhǎng)[26]。Burwell等[27]用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了用聚丙烯酸和聚天冬氨酸等陰離子聚合物形成的液態(tài)前驅(qū)體(polymer-induced liquid-precursor，PILP)可誘導(dǎo)人工牙本質(zhì)齲的仿生再礦化。

2.3 樹狀聚合物

同牙釉質(zhì)再礦化相同，PAMAM也能為牙本質(zhì)礦化提供功能基團(tuán)、結(jié)晶位點(diǎn)和礦化支架，從而誘導(dǎo)牙本質(zhì)再礦化。謝方方等[28]用氧化鈣溶液預(yù)處理對(duì)羧基改性的PAMAM，在掃描電鏡觀察到羧基改性的PAMAM協(xié)同氧化鈣溶液預(yù)處理可促進(jìn)脫礦牙本質(zhì)的再礦化。Wang等[29]用PAMAM樹狀聚合物處理牙本質(zhì)，然后使用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法(ATR-FTIR)、X射線衍射(XRD)、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)等設(shè)備觀察到涂覆在牙本質(zhì)表面并滲透到牙本質(zhì)小管中的PAMAM樹狀聚合物可誘導(dǎo)羥磷灰石形成。林軒東[30]同樣用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了3.5代羧基改性后的聚酰胺-胺樹枝狀高分子聚合物對(duì)人類脫礦牙本質(zhì)仿生再礦化作用。吳柳鮮等[31]制備羧基改性的聚酰胺-胺/納米羥基磷灰石[m(PAMAM-COOH):m(n-HAP)]的PAMAM-COOH/n-HAP復(fù)合材料，在體外觀察證實(shí)了其于酸性環(huán)境下誘導(dǎo)脫礦牙本質(zhì)再礦化的效果。

3 總 結(jié)

綜上所述，來自于大自然的仿生生物分子材料能很好地應(yīng)用于牙體牙髓臨床所需的齲齒脫礦表面的再礦化。釉原蛋白、膠原蛋白及衍生物，PAMAM、磷酸鈣納米粒子能使牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)再礦化。這些仿生材料一般通過提供三維網(wǎng)架、成核位點(diǎn)，穩(wěn)定ACP使之結(jié)合沉積，增強(qiáng)表面與HA晶體親和力，抑制早期自發(fā)性沉積等方式來促進(jìn)再礦化。

但目前很多仿生材料的研究都是體外實(shí)驗(yàn)，能否真正應(yīng)用于口腔中復(fù)雜的環(huán)境仍然未知。而許多仿生蛋白材料存在取材困難，實(shí)驗(yàn)時(shí)間過長(zhǎng)的問題，實(shí)驗(yàn)生成的晶體強(qiáng)度性能與天然的釉質(zhì)仍有一定差距。因此口腔仿生材料有良好的應(yīng)用前景，但仍需更多的實(shí)驗(yàn)支持。