根管封閉劑對(duì)糞腸球菌抗菌作用的研究進(jìn)展

劉 瑾，程小剛，仇 珺，梅笑寒，程 庚，白 玉，余 擎

牙髓病和根尖周病是最常見(jiàn)的口腔疾病之一，可以造成患者的極度不適感、頜面部疼痛和牙齒缺失等危害；還能影響患者的身心健康并降低患者的生活質(zhì)量[1]。此外，牙髓和根尖周病還有可能成為系統(tǒng)性疾病(如細(xì)菌性心內(nèi)膜炎和心血管疾病)的感染源[2]。大量研究報(bào)道，細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物是牙髓病和根尖周病的主要病因之一[3]。目前，根管治療術(shù)是治療牙髓病和根尖周病應(yīng)用最廣和效果最好的方法，其根本性目的是清除根管內(nèi)感染并對(duì)根管進(jìn)行徹底的消毒，繼而對(duì)根管系統(tǒng)進(jìn)行三維嚴(yán)密的充填，最終促進(jìn)根尖周組織的愈合[4]。然而，初次根管治療的成功率為86%～98%[5]。根管治療失敗的主要原因是根管系統(tǒng)內(nèi)感染的持續(xù)存在，糞腸球菌是最主要致病菌之一[6]，而當(dāng)前臨床所用根管機(jī)械-化學(xué)消毒和封藥技術(shù)很難將其徹底清除[7-8]。研究證實(shí)糞腸球菌可以通過(guò)自身變異或者從其他細(xì)菌獲得耐藥基因從而對(duì)根管內(nèi)常規(guī)用藥產(chǎn)生耐藥性[9]。此外，它還可以在根管內(nèi)形成細(xì)菌生物膜。有學(xué)者研究證實(shí)糞腸球菌及其生物膜可以耐受經(jīng)過(guò)治療根管內(nèi)包括“寡營(yíng)養(yǎng)”和“高pH值”等在內(nèi)的“惡劣”環(huán)境[10-11]。一旦環(huán)境適宜，其便有可能引起根管再感染和治療失敗的發(fā)生。根管充填是用生物惰性材料(如牙膠尖)和根管封閉劑對(duì)根管系統(tǒng)進(jìn)行三維、嚴(yán)密的充填[12]。牙膠尖是一種生物惰性材料，主要用來(lái)填充根管腔。根管封閉劑的主要作用是填充牙膠尖和根管壁之間的空隙、封閉根管系統(tǒng)、充填根管系統(tǒng)中不規(guī)則區(qū)域和埋沒(méi)殺死根管內(nèi)殘存細(xì)菌[13]。作為根管治療的最后一個(gè)步驟，根管封閉劑將長(zhǎng)期存在于根管內(nèi)。如果根管封閉劑具備長(zhǎng)期穩(wěn)定的抗菌作用，尤其針對(duì)糞腸球菌，那么無(wú)疑會(huì)增加根管治療的成功率并維持其長(zhǎng)期療效。當(dāng)前，根管封閉劑種類繁多，本文將就各類根管封閉劑對(duì)糞腸球菌抗菌作用的研究進(jìn)展作一綜述，這將具備重要的臨床指導(dǎo)意義。

1 氧化鋅丁香油類/氧化鋅丁香油+碘仿類根管封閉劑

1931年，Rickert和 Dixon首次將氧化鋅丁香油類根管封閉劑應(yīng)用在牙髓治療中[14]。隨后，Grossman又對(duì)其進(jìn)行性能改進(jìn)，并提出理想根管封閉劑應(yīng)該具有的十項(xiàng)特性：可以被輕松地輸送入根管內(nèi)；有很好的封閉側(cè)支根管和根尖孔的功能；輸送至根管后不會(huì)發(fā)生收縮；性能不受環(huán)境濕度的影響；有抑菌功能或者至少不會(huì)促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)；有阻射性；不會(huì)對(duì)牙體組織染色；不會(huì)激惹根尖周組織；無(wú)菌的或者在輸送至根管前很容易被滅菌；能隨時(shí)輕易地從根管內(nèi)取出[15]。

目前，臨床常用氧化鋅丁香油類根管封閉劑主要包括Endomethasone(Septodont, Saint-Maur des Fosse’s，法國(guó))、Grossman’s(NIOM laboratory，Haslum, 挪威)、Tubli-Seal EWT(Sybron Endo Corporation, Orange，美國(guó))、Tubli-Seal(Kerr，Romulus，MI，美國(guó))和Tg-Sealer(Technical and General Ltd.，英國(guó))等。研究報(bào)道，氧化鋅丁香油類根管封閉劑和環(huán)氧胺樹脂類根管封閉劑擁有相對(duì)最廣的抗菌譜和最強(qiáng)的抗菌活性[16]。其抗菌作用主要來(lái)源于固化過(guò)程中釋放的丁香酚成分[17]。Hasheminia等通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法(ADT)證實(shí)，新鮮配制的Endomethasone對(duì)糞腸球菌抗菌作用比Tg-Sealer強(qiáng)，其抑菌環(huán)直徑分別為(29.96±0.56)mm和(7.78±0.25) mm；但在直接接觸法(DCT)中將兩種材料混合后在37 ℃下放置7 d再與糞腸球菌接觸發(fā)現(xiàn)，兩者的抗菌能力無(wú)明顯差別[18]。但Marcela等通過(guò)DCT研究證實(shí)，固化后的Endofill(Dentsply, Petrópolis, 巴西)在與糞腸球菌作用1 min和1 h時(shí)未表現(xiàn)出明顯抗菌作用，24 h后具有較好的細(xì)菌抑制作用[19]。

此外，還有一類根管封閉劑是在氧化鋅丁香酚粉中加入碘仿構(gòu)成的，如Endoflas FS Sealer(Sanlor, 哥倫比亞)和MCS Canal Sealer(Lone Star Technologies, Westport, CT, 美國(guó))。Arora等通過(guò)ADT法比較了氧化鋅丁香油類根管封閉劑(Tubli-Seal EWT)、氧化鋅丁香油+碘仿類根管封閉劑(Endoflas FS Sealer)與環(huán)氧胺樹脂類根管封閉劑(AH Plus)對(duì)糞腸球菌的抗菌作用，發(fā)現(xiàn)其抑菌環(huán)直徑分別為16.88 mm、23.20 mm和18.42 mm，即Endoflas FS Sealer的抗菌作用最強(qiáng)[20]。這是因?yàn)镋ndoflas FS Sealer中添加了碘仿。碘仿是一種溫和的抗菌藥物，當(dāng)與組織液、體液內(nèi)含有的有機(jī)物、細(xì)菌氧化酶接觸后，它能夠緩慢地分解出游離碘，被釋放的游離碘可直接鹵化菌體蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)合，而使菌體蛋白質(zhì)和酶受到破壞，微生物因代謝功能發(fā)生障礙而死亡，呈現(xiàn)殺菌作用[21]。

2 樹脂類根管封閉劑

雖然市場(chǎng)上根管封閉劑種類繁多，但是樹脂類根管封閉劑因其良好的抗菌作用、封閉能力、理化性能和生物學(xué)特性而被廣泛使用[22-25]。按其主要成分的不同可分為環(huán)氧樹脂類封閉劑和甲基丙烯酸酯類封閉劑。這類封閉劑的抗菌作用主要來(lái)源于固化過(guò)程中釋放的雙酚A-二縮水甘油醚和甲醛成分[26]。常用的樹脂類根管封閉劑有AH Plus(DentsplyDeTrey, Konstanz，德國(guó))、EndoREZ(Ultradent，美國(guó))、ThermaSeal Plus(Dentsply Tulsa Dental, Tulsa,俄克拉荷馬州)等，其中AH Plus由于良好的物理化學(xué)性質(zhì)、生物相容性和組織耐受性而常常被作為根管封閉劑研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”[27-29]。Arora等[20]研究發(fā)現(xiàn)，新鮮配制的AH Plus在ADT實(shí)驗(yàn)中對(duì)糞腸球菌有較強(qiáng)的抗菌性，抑菌環(huán)直徑約為18.42 mm。而Ruiz-Linares等[30]指出在DCT實(shí)驗(yàn)中AH Plus對(duì)糞腸球菌的抗菌作用隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減弱。他通過(guò)比較細(xì)菌ATP含量發(fā)現(xiàn)當(dāng)AH Plus固化24 h后，細(xì)菌含量與對(duì)照組相比減少80%左右，當(dāng)固化后1周和4周發(fā)現(xiàn)細(xì)菌只減少23.28%和28.41%。Alsubait等[31]通過(guò)活死細(xì)菌染色法及細(xì)菌計(jì)數(shù)法研究發(fā)現(xiàn)AH Plus固化后1 d能夠殺滅35%左右糞腸球菌，7 d和30 d時(shí)能夠殺滅30%左右細(xì)菌。Seelan等[32]采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)，通過(guò)檢測(cè)糞腸球菌中的特定基因?qū)颖局械募?xì)菌進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)未固化的AH Plus 37 ℃下培養(yǎng)7 d后 DNA載量為1 968.72，而對(duì)照組為3 826.75，表明AH Plus有一定的抗菌作用。RT-PCR能夠直接檢測(cè)臨床樣本，不需要進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，提高了細(xì)菌檢測(cè)的靈敏性，具有更高的特異性和準(zhǔn)確性，能夠更加準(zhǔn)確鑒別細(xì)菌種類[33]。

3 氫氧化鈣類根管封閉劑

由于氫氧化鈣具備修復(fù)牙髓的能力，Herman于1920年首次將其應(yīng)用于牙髓治療中[34]。1940年，Rhoner首次提出將氫氧化鈣作為根管封閉劑用于臨床的可能[35]。氫氧化鈣類根管封閉劑主要通過(guò)固化過(guò)程中釋放游離的羥基離子來(lái)提高周圍環(huán)境的pH值繼而發(fā)揮其抗菌作用[36]。在根管內(nèi)，它能將pH值提高至12.5。研究報(bào)道，當(dāng)pH>9時(shí)，氫氧化鈣中游離的羥基離子通過(guò)氧化物破壞細(xì)菌細(xì)胞膜、降低酶活性、破壞細(xì)胞新陳代謝來(lái)殺死細(xì)菌[36]。

臨床上常用的氫氧化鈣類根管封閉劑主要有Apexit(Ivoclar Vivadent, Schaan，列支敦士登)、Sealapex(Kerr，Romulus，MI，美國(guó))和CRCS(Coltene/Whaledent Inc.，美國(guó))等。Dalmia等通過(guò)ADT實(shí)驗(yàn)比較新鮮配制的Sealapex、AH Plus、MTA Fillapex三種根管封閉劑對(duì)糞腸球菌抗菌作用，分別在24 h、48 h和72 h觀察抑菌環(huán)直徑大小，發(fā)現(xiàn)Sealpex抗菌性最強(qiáng)，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，抗菌作用逐漸減小[37]。Shakya等在ADT實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新鮮配置的CRCS無(wú)論在24 h還是7 d對(duì)糞腸球菌均有抗菌作用；同時(shí)在DCT實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新鮮制備的CRCS在接觸1 h和24 h時(shí)糞腸球菌的細(xì)菌量均低于對(duì)照組[38]。Seelan等通過(guò)RT-PCR法發(fā)現(xiàn)AH Plus對(duì)糞腸球菌的抗菌作用最強(qiáng)，其次分別是TubliSeal、Fillapex、Apexit Plus，最后是RoekoSeal[32]。

現(xiàn)有關(guān)于氫氧化鈣類根管封閉劑對(duì)糞腸球菌抗菌作用研究的結(jié)論并不一致，大多數(shù)研究認(rèn)為其對(duì)糞腸球菌有一定的抗菌作用，但要比AH Plus的抗菌作用弱、其持續(xù)時(shí)間短[32,39]。這可能與糞腸球菌的耐堿機(jī)制有關(guān)，它可以通過(guò)細(xì)胞壁相關(guān)的質(zhì)子泵驅(qū)動(dòng)質(zhì)子進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞質(zhì)酸化，這對(duì)生物體在高堿性環(huán)境下的生存起著重要的作用[40-41]。

4 硅酸鈣類根管封閉劑

近年來(lái)，硅酸鈣類根管封閉劑因其良好的生物相容性已得到廣泛使用。該類根管封閉劑具備良好的細(xì)胞相容性、生物相容性、封閉性能和粘接性能，它們還具有一定的抗菌作用[27]。2009年iRoot SP(Innovative Bioceramix, Vancouver, 加拿大)作為該分類首個(gè)根管封閉劑應(yīng)用于臨床。目前臨床常用的硅酸鈣類根管封閉劑除了iRoot SP外，還有BioRoot RCS(Septodont，法國(guó))和Endoseal(Maruchi, Wonju, 韓國(guó))等。

iRoot SP是一種新型生物陶瓷類根管封閉劑，目前被廣泛應(yīng)用于根管治療、根管穿孔的修補(bǔ)以及根尖屏障術(shù)等[42-44]。Zhang等認(rèn)為它在新鮮及固化1 d時(shí)對(duì)糞腸球菌的抗菌作用比AH Plus更強(qiáng)，但在固化7 d時(shí)抗菌作用便會(huì)消失[45]。但Willershausen等的研究并未發(fā)現(xiàn)其對(duì)糞腸球菌的抗菌作用[46]。此外，Shin等比較了iRoot SP和EndoSeal對(duì)糞腸球菌的抗菌作用,發(fā)現(xiàn)二者未凝固時(shí)均具有抗菌作用，且EndoSeal的抗菌作用要比iRoot SP強(qiáng)，但凝固后的iRoot SP未顯示出抗菌作用[47]。iRoot SP和EndoSeal均屬于硅酸鈣類根管封閉劑，它們主要通過(guò)Ca(OH)2對(duì)細(xì)胞膜或DNA的破壞和蛋白質(zhì)變性對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生殺菌作用[47]。但是EndoSeal含有比iRoot SP更多的具有抗菌作用的氧化物如Na2O、MgO、Al2O3、SO2、和Fe2O，這可能是二者抗菌作用表現(xiàn)不同的原因。

Alsubait等對(duì)BioRoot RCS和iRoot SP的抗菌作用做了比較，DCT、MDCT及活死細(xì)菌染色等研究均發(fā)現(xiàn)它們?cè)谂渲坪? d和7 d時(shí)對(duì)糞腸球菌均具有較好的抗菌作用，且強(qiáng)于AH Plus的抗菌作用。但是，活死細(xì)菌染色研究還發(fā)現(xiàn)，BioRoot RCS配制后1 d時(shí)對(duì)糞腸球菌顯示出較強(qiáng)的抗菌作用、7 d時(shí)抗菌作用明顯減弱，但30 d時(shí)抗菌作用又有所增強(qiáng)，這可能與它在固化過(guò)程中離子釋放的不同有關(guān)[31]。

5 玻璃離子類根管封閉劑

目前，玻璃離子類根管封閉劑種類較少，其中臨床最常用的是Ketac-Endo(3M ESPE, St. Paul, MN,美國(guó))。這類根管封閉劑的抗菌作用主要取決于氟離子釋放。有研究通過(guò)ADT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未固化Ketac-Endo對(duì)糞腸球菌的抑菌環(huán)比氧化鋅丁香油類根管封閉劑Roth’s Sealer(Roth International Ltd, 芝加哥，伊利諾斯州)的抑菌環(huán)大兩倍；同時(shí)，該研究中DCT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未固化Ketac-Endo完全抑制了糞腸球菌的生長(zhǎng)；但其固化24 h和7 d后樣本對(duì)糞腸球菌生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用[48]。這與Cobankara等的研究結(jié)果基本相似[49]。

6 硅基類根管封閉劑

硅基類根管封閉劑是一種含有聚二甲基硅氧烷和牙膠顆粒的有機(jī)硅根管充填材料，它們的抗菌作用較弱，與氫氧化鈣類根管封閉劑抗菌作用相類似[50]。目前常用硅基類根管封閉劑主要有GuttaFlow(Roeko/Colte`ne/Whaledent, Langenau, 德國(guó))，GuttaFlow2(Coltène/Whaledent, Langenau, 德國(guó))，GuttaFlow Bioseal(Coltène/Whaledent, Langenau, 德國(guó))和Roeko Seal(Roeko/Colte`ne/Whaledent, Langenau,德國(guó))。有研究證實(shí)，無(wú)論是固化還是未固化的GuttaFlow2和Roeko Seal在ADT或者DCT實(shí)驗(yàn)中對(duì)糞腸球菌均未顯示出抗菌作用[18-19,51]。但是，Ruiz-Linares等在DCT實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)GuttaFlow Bioseal固化后1 d、1周和4周對(duì)糞腸球菌的抗菌作用隨固化時(shí)間增加而加強(qiáng)，同時(shí)活死細(xì)菌計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn)生存細(xì)菌數(shù)量減少[30]。另有研究將經(jīng)糞腸球菌處理3周后的人牙本質(zhì)塊與新鮮配置Roeko Seal反應(yīng)1周，RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA載量為3 034.54，而對(duì)照組的DNA載量為3 826.75，表明Roeko Seal具有一定的抗菌作用[32]。

7 其 他

當(dāng)前，氧化鋅丁香油類根管封閉劑和環(huán)氧胺樹脂類根管封閉劑擁有相對(duì)最廣的殺菌譜和最強(qiáng)的殺菌活性。其對(duì)包括具核梭桿菌、變形鏈球菌和白色念珠菌在內(nèi)的多種細(xì)菌都有有效的殺滅作用[52]。但是，其對(duì)糞腸球菌的殺滅作用較弱[53-55]。同時(shí)，目前大多數(shù)根管封閉劑僅具備一定的短期抗菌作用，這是因?yàn)榭咕饔弥饕獊?lái)源于它們固化過(guò)程中釋放的抗菌成分。但是，隨著根管封閉劑的固化，抗菌成分的釋放會(huì)越來(lái)越少，因此它們的抗菌作用會(huì)逐漸減弱甚至在數(shù)小時(shí)到數(shù)天內(nèi)完全喪失[47,50-51]。

近年來(lái)，學(xué)者們進(jìn)行了大量的研究與嘗試，以求改善現(xiàn)有根管封閉劑的抗菌作用，提高其長(zhǎng)期抗菌作用。比如將Kerr Pulp Canal Sealer EWT、AH Plus和RealSeal SE等根管封閉劑與阿莫西林、甲硝唑和多西環(huán)素等抗生素簡(jiǎn)單地進(jìn)行混合后確實(shí)提高了根管封閉劑本身的抗菌作用，但是這種改善僅限于新鮮配制的根管封閉劑，而長(zhǎng)期抗菌作用并未有所改善[56-57]。也有研究嘗試將AH Plus、Apexit Plus和Canals等根管封閉劑與日扁柏素(hinokitiol)混合以提高其抗菌活性。結(jié)果證實(shí)，與根管封閉劑本身的抗菌活性相比較，混合日扁柏素的根管封閉劑的抗菌活性有所改善，但與此同時(shí)他們的細(xì)胞毒性作用也增加了[58]。此外，將陽(yáng)離子納米顆粒或者銀離子與根管封閉劑進(jìn)行混合或者對(duì)其進(jìn)行包被，結(jié)果證實(shí)其可以得到強(qiáng)的短期抗菌活性[59-60]。季銨鹽是一種廣譜陽(yáng)離子抗菌劑，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌都有強(qiáng)的殺菌活性，目前普遍公認(rèn)其殺菌機(jī)制為其表面陽(yáng)離子集團(tuán)可以與細(xì)菌表面的陰離子集團(tuán)結(jié)合發(fā)生靜電反應(yīng)作用，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，從而殺滅細(xì)菌[60]。自20世紀(jì)70年代開始，季銨鹽已被廣泛應(yīng)用于抗生素合成、環(huán)境消毒和水消毒等領(lǐng)域[61-62]。將季銨鹽與根管封閉劑按照一定比例(5%～20%)混合，結(jié)果提示季銨鹽顯著增強(qiáng)了根管封閉劑的短期殺菌作用，但其長(zhǎng)期殺菌作用并無(wú)顯著改善[63-65]。程小剛等利用二氧化硅類生物玻璃作為基底，通過(guò)化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合的方式將丙烯酸酯季銨鹽聚合物接枝到生物玻璃表面獲得了一種可用于根管封閉劑合成的新材料。這種材料兼?zhèn)溟L(zhǎng)期、穩(wěn)定和有效的殺菌作用以及良好的生物相容性，其固化后28 d樣本對(duì)糞腸球菌表現(xiàn)出了長(zhǎng)期、穩(wěn)定和有效的殺滅作用[66]。然而，目前尚未轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品，其臨床應(yīng)用仍需等待一段時(shí)間。

此外，上述提及的封閉劑固化過(guò)程中所釋放的抗菌成分還會(huì)引起不同程度的細(xì)胞或者組織毒性作用[67-68]，還有可能影響封閉劑的封閉效果[69-70]。大量文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)根管封閉劑的新鮮制備樣本的毒性最強(qiáng)[71-72]。氧化鋅丁香油類根管封閉劑固化過(guò)程中釋放的丁香油和氧化鋅對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞和成骨細(xì)胞等多種細(xì)胞都有很大的毒性作用[73-74]。此外，它還能誘發(fā)軟組織和骨組織的炎癥反應(yīng)[75]。環(huán)氧胺樹脂類根管封閉劑固化過(guò)程中釋放的少量甲醛和雙酚A-二縮水甘油醚等成分有中等到重度程度體內(nèi)和體外細(xì)胞毒性作用[76-77]。彭彬等[41,78]發(fā)現(xiàn)硅酸鈣類根管封閉劑(iRoot SP)具備良好的細(xì)胞相容性和組織相容性，但另有研究證實(shí)它的殺菌作用在其固化后7 d便會(huì)消失[45]。當(dāng)前根管封閉劑的殺菌作用和生物相容性往往呈現(xiàn)一個(gè)此消彼長(zhǎng)的狀態(tài)。

8 總結(jié)與展望

根管封閉劑在根管充填時(shí)使用，它將長(zhǎng)期存在于根管內(nèi)。因此，如果根管封閉劑具備長(zhǎng)期穩(wěn)定的抗菌作用，尤其針對(duì)糞腸球菌，那么無(wú)疑會(huì)增加根管治療的成功率并維持其長(zhǎng)期療效。然而，通過(guò)以上文獻(xiàn)綜述發(fā)現(xiàn)，雖然現(xiàn)有根管封閉劑種類繁多、且均具備不同程度的抗菌作用，但其對(duì)糞腸球菌抗菌作用較弱、且持續(xù)時(shí)間短。截至目前，合成兼?zhèn)溟L(zhǎng)期、穩(wěn)定和有效殺菌作用以及良好生物相容性的根管封閉劑仍然是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)，也是有關(guān)牙髓治療研究今后探索的方向，這將為提高根管治療成功率、維持根管治療遠(yuǎn)期療效和預(yù)防根管治療失敗提供新的思路和理論支持。