一株臨滄野生靈芝的鑒定與馴化栽培

張焱珍　周會明　白玉英　柴紅梅　古廣紅　趙婭通　田利波　卯明娟

摘 ?要：從采集于云南臨滄的野生靈芝子實體中分離純化獲得純培養(yǎng)物，編號為YAASM4672，結合形態(tài)學與ITS序列分析鑒定其分類學地位，并設計了9種栽培種培養(yǎng)基，測定其栽培特性。結果顯示，采集到的菌株YAASM4672為靈芝（Ganoderma lingzhi），其形態(tài)特征與分子鑒定結果一致。該菌在2號栽培種配方上，菌絲生長和子實體農藝性狀（覆土組優(yōu)于露地組）表現(xiàn)最好。菌絲體白色，長勢濃密，38 d滿袋，平均生長速度達（5.891.01） mm/d;菌蓋黃色，直徑達66.00 mm，平均生長速度最快為（4.141.07） mm/d，與其他配方相比，達到顯著（P<0.05）或極顯著差異（P<0.01）;菌柄褐黃，其長度、直徑分別達到84.00 mm、18.00 mm。馴化的野生靈芝菌株YAASM4672人工栽培最優(yōu)配方為：78%玉米芯、18%米糠、2%高粱粉、1%石膏粉、1%白砂糖，覆土能促進其子實體的生長發(fā)育。

關鍵詞：靈芝;形態(tài)學;ITS序列分析;馴化栽培

中圖分類號：S567.3+1 ? ? ?文獻標識碼：A

Identification and Domestication Cultivation of a Wild-type Ganoderma lingzhi Strain from Lincang， Yunnan

ZHANG Yanzhen1，2， ZHOU Huiming1，2， BAI Yuying1， CHAI Hongmei2*， GU Guanghong1， ZHAO Yatong1， TIAN Libo1， MAO Mingjuan1

1. School of Biotechnology and Engineering， West Yunnan University， Lincang， Yunnan 677000， China; 2. Institute of Biotechnology and Germplasmic Resources， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming， Yunnan ?650221， China

Abstract： An optimal medium was screened for the cultivation of a wild-type Ganoderma lingzhi， which are the basis of its mass production. In this paper， a strain of YAASM4672 was isolated from a wild mushroom fruiting body of Ganoderma lingzhi， from Lincang， Yunnan. Taxonomic status was identified based on its morphology and ITS sequence analysis， and nine media of culture spawn were designed for the determination of its cultivation characteristics. The result showed that the wild strain of YAASM4672 was G. lingzhi， and the morphological characteristics were consistent with its molecular identification. Formula 2 of culture spawn were the best for the mycelial growth and agronomic characters of fruiting body （soil mulched group was better than the open field group） of strain YAASM4672. Its mycelia colour was white and dense， the time of sackful was 38 d， and the growth rate of mycelia was （5.891.01） mm/d. The pileus was yellow， diameter was 66.00 mm， and average growth rate was （4.141.07） mm/d， which were significantly （P<0.05） or extremely significantly （P<0.01） different compared with other formula. Stipe was brownish yellow， its length and diameter was 84.00 mm and 18.00 mm respectively. In short， the optimal medium for artificial cultivation of strain YAASM4672 was 78% corn cob， 18% rice bran， 2% sorghum flour， 1% gypsum powder， and 1% white granulated sugar. Soil mulched can promote the growth and development of its fruiting body.

Keywords： Ganoderma lingzhi; morphology; ITS sequencing analysis; domestication cultivation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.005

靈芝（Ganoderma lingzhi）隸屬于靈芝屬（Ganoderma）真菌[1-2]，應用歷史悠久，自古以來被譽為名貴的中藥材[3]，干燥子實體是其藥用正品[4]，因其具有抗腫瘤、降血糖、保肝解毒等藥用功效[5-8]，已被開發(fā)成多種藥品和保健品[9]，成為現(xiàn)代醫(yī)學研究的熱點[10]。目前，有關靈芝的眾多研究主要集中于該菌的活性物質提取[11]、藥理作用[12-13]、分子生物學與基因工程[14]等方面。近年來，隨著人們對靈芝藥用價值的逐步深入了解，個人自我保健意識逐漸加強，其產品開發(fā)越來越受到重視[15]。我國靈芝種質資源種類有100余種，占全世界種類的1/2[16]，但主栽品種大多引自其他國家，且菌種存在活性退化、產量低、抗雜菌能力弱等嚴重問題[17]。同時，近年來人們對有限的靈芝野生資源的掠奪性采集及生態(tài)環(huán)境惡化，導致野生靈芝種源數(shù)量日益劇減并瀕臨滅絕。本研究擬在加強靈芝野生資源保護的基礎上，研究不同菌株的親緣關系，開發(fā)適合當?shù)卦耘嗟膬?yōu)良品種，利用本地來源廣、成本低的栽培原料，對其進行人工栽培。臨滄市作為云南省森林覆蓋率最大的地級市之一，有“亞洲恒溫城”之美稱，適合各種恒溫結實菌類的生長，擁有豐富的野生靈芝資源。筆者利用采集的當?shù)匾吧鷥?yōu)良靈芝資源，在形態(tài)學與ITS序列分析鑒定的基礎上，利用當?shù)貜V泛的農業(yè)廢棄物（玉米芯、草坪草、麥秸等）代替木屑，設計9種不同培養(yǎng)料，尋找適合該菌生長的培養(yǎng)基，明確其栽培特性，為該菌推廣提供理論參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試材料 ?供試野生菌為2014年7月30日，在云南省臨滄市滇西科技師范學院小河邊綠化帶的草坪枯樹樁基部采集到的1株野生幼嫩子實體。

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?母種培養(yǎng)基（%）：馬鈴薯20，葡萄糖2，瓊脂1.5;液體培養(yǎng)基（%）：葡萄糖2，蛋白胨0.2，酵母提取粉0.2;原種培養(yǎng)基（%）：小麥粒98，石膏粉2;栽培種培養(yǎng)料（%）配方見表1。上述培養(yǎng)基pH均自然。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌種的初步鑒定、分離純化及培養(yǎng) ?對采集到的野生菌子實體依據(jù)其形態(tài)特征進行初步鑒定，并采用組織分離得到純培養(yǎng)物，將其編號為YAASM4672。該菌株保存于云南省農業(yè)科學院生物技術與種質資源研究所。

1.2.2 ?DNA提取及ITS序列分析 ?采用CTAB法提取菌株YAASM4672菌絲體DNA，用0.8%瓊脂糖檢測DNA的質量和濃度[18]，通過用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）擴增ITS片段[19-20]，PCR產物交由昆明碩擎生物科技有限公司進行測序，所測得的ITS序列通過NCBI在線BLAST N檢索，與GenBank中的ITS基因序列進行同源性比較，并利用ClustalX軟件對所得序列進行比對分析，比對結果用Gblocks 0.91b （www.phylogeny.fr/one_task.cgi？task_type=gblocks）在線編輯，設置低的一致性選擇。用MEGA 6.06v軟件構建ML進化樹，選擇最適模型kimura 2，1000重復的自展分析[21-22]。

1.2.3 ?制種及最適栽培種配方篩選 ?采用食用菌常規(guī)制種方法[23]，小麥使用前用開水浸泡10 h，瀝水，風干至手抓料后手心潮濕為宜;木屑、玉米芯、發(fā)酵料、草坪粉、麥秸拌料前要預濕2 h，其中麥秸剪成1 cm左右的小段，每一配方60袋重復。121 ℃下滅菌90 min，然后室溫（20～25 ℃）擱置2 d，再繼續(xù)121 ℃下滅菌60 min 1次，等料溫降至30 ℃左右無菌接種，繼續(xù)置于室溫遮光培養(yǎng)，培養(yǎng)期間，及時檢查污染，并測定菌絲萌發(fā)時間（d）、生長勢等[24]。

1.2.4 ?農藝性狀測定 ?待菌絲體長滿菌袋，袋內培養(yǎng)料表面有白色的原基時，采用覆土和露地（凸畦面蔭棚）2種方法[14]進行出菇。待菌蓋邊緣顏色逐漸加深并與中間的顏色一致時進行子實體的采收，測定菌柄長度（cm）、菌柄直徑（cm）、菌蓋直徑（cm）等農藝性狀[20]。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均由SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析[25]。

2 ?結果與分析

2.1 ?野生菌株YAASM4672子實體形態(tài)特征

子實體中等，幼芝菌蓋白色，中央稍黃，近圓形，邊緣薄，木栓質，直徑3.5～5.4 cm，厚0.7～ 0.8 cm;菌肉白色，菌管未形成;菌柄紫褐色，有光澤，側生，長度5～7 cm，直徑1.5～2.7 cm;擔孢子未形成，從形態(tài)學來看，初步鑒定菌株YAASM4672為靈芝（Ganoderma lingzhi）（圖1）。

2.2 ?基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

CTAB法提取菌株YAASM4672的菌絲體DNA，經(jīng)PCR擴增獲得ITS序列片段（圖2），測序完成后，將獲得的正反向序列使用DNAStar軟件包中的SeqMan進行拼接、編輯獲得完整的ITS序列（序列長度661 bp），以多孔菌科的假芝屬真菌（Amauroderma calcitum）基因序列為外群，與GenBank中的18個相似性最高的靈芝（G. lingzhi）以及靈芝屬（Ganoderma）的其他種ITS基因序列進行同源性比較，利用ClustalX軟件對所得序列進行多序列聯(lián)配分析，并使用MEGA6.06v軟件構建ML（Maximum likelihood，最大似然法）進化樹（圖3）。結合其形態(tài)學特征，鑒定菌株YAASM4672為靈芝（G. lingzhi）。

2.3 ?不同栽培種配方對菌株YAASM4672菌絲生長的影響

從表2可見，菌株YAASM4672在9種設定的栽培種培養(yǎng)基上均能生長，不同配方上的菌絲生長情況存在差異。菌絲體顏色白色或淡黃色、微黃色，除4號與9號配方外，其余配方上菌絲生長濃密。其中在2號配方上，菌絲滿袋時間最短（38 d），平均生長速度最快，為（5.89± 1.01） mm/d，除與5號配方不顯著外，與其余配方相比表現(xiàn)出顯著或極顯著差異。

2.4 ?菌株YAASM4672露地栽培農藝性狀

凸畦面蔭棚栽培試驗結果顯示，供試的9種配方上只有2、3、5及6號配方產生了子實體，且不同配方的表現(xiàn)不同。在2號配方上子實體的農藝性狀最優(yōu)，菌蓋金橘黃或金黃、直徑51.00 mm;菌柄顏色褐紅，其長度、直徑分別達到65.50、17.00 mm;菌蓋平均生長速度最快，達到（3.01±0.17）mm/d，并顯著高于5號和6號配方（表3）。出菇52 d的成熟露地栽培子實體見圖4。

2.5 ?菌株YAASM4672覆土栽培農藝性狀

覆土栽培組試驗發(fā)現(xiàn)，供試的9種配方上只有配方1、4及9號未出芝，不同配方其栽培特性存在一定差異。在2號配方上子實體的農藝性狀最優(yōu)，菌蓋黃色、直徑66.00 mm;菌柄顏色褐黃，其長度、直徑分別達到84.00、18.00 mm;菌蓋平均生長速度最快，達到（4.14±1.07）mm/d，與其他配方相比表現(xiàn)出顯著或極顯著差異（表4）。出菇62 d的成熟覆土栽培子實體見圖5。

3 ?討論

野生靈芝多生長于闊葉樹的樹樁、枯木和倒木上[26]，人工栽培時常以木質素含量較高的木材為主[27]。按照生態(tài)保護的要求木材栽培食用菌受到一定的限制，開發(fā)新型的栽培原料成為發(fā)展木腐食用菌的一種趨勢[28]，農業(yè)廢棄物成為眾多原料的首選。

本研究利用臨滄市優(yōu)良的野生靈芝菌株YAASM4672為材料，篩選適合本地靈芝的栽培基質，培養(yǎng)和出菇試驗表明該菌在2號培養(yǎng)基上，菌絲體白色，長勢濃密，滿袋時間最短（38 d），平均生長速度最快，達（5.891.01）mm/d，2號培養(yǎng)基出菇表現(xiàn)也最優(yōu)，覆土栽培優(yōu)于露地栽培方式。因此，同一靈芝品種不同栽培方式和栽培基質對靈芝的品質有著很大的影響[29]。覆土能促進菌株YAASM4672子實體的生長發(fā)育，玉米芯可作為替代木屑種植該菌的最佳農業(yè)廢棄物，這與玉米芯中的糖類和蛋白類物質含量及胞外酶活力高于棉籽殼和雜木屑密不可分[30]。為更好地開發(fā)與利用該菌株，在今后對該菌株的研究中，以臨滄當?shù)氐呢S富林業(yè)資源為突破口，有必要以市場已推廣的人工靈芝（如‘信州2號‘臺芝1號‘赤芝109號等）為對照，擴展該菌的栽培方式（如開展林下仿生栽培），縮小該菌的研究誤差（如不同配方設定相同的酸堿度、C/N比、松緊度等），擴大最適培養(yǎng)料的篩選范圍等。

總之，我國是世界靈芝的物種多樣性中心[31]，云南是其野生種質資源最多的地區(qū)之一，在保護好生態(tài)環(huán)境的前提下，鑒定和馴化臨滄市當?shù)刭Y源，以本地極為豐富的玉米芯為栽培主料，利用適宜的氣候條件，大力生產靈芝，既可提高農業(yè)廢棄物的利用率，增加農民收入，又能促進當?shù)氐纳鷳B(tài)恢復以及經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展。

參考文獻

[1] Cao Y， Wu S H， Dai Y C. Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom“Lingzhi”[J]. Fungal Diversity， 2012， 56（1）： 49-62.

[2] 戴玉成， 曹 ?云， 周麗偉， 等. 中國靈芝學名之管見[J]. 菌物學報， 2013， 32（6）： 947-952.

[3] 賈紅巖， 王亞濤， 張芝華， 等. 高效液相色譜法測定不同產地及品種靈芝三萜類成分的含量[J]. 微生物學通報， 2017， 44（1）： 238-244.

[4] 劉艷芳， 呂佳維， 馮 ?娜， 等. 三種因素對“滬農靈芝1號”子實體三萜的影響[J]. 食用菌學報， 2016， 23（3）： 43-48.

[5] Xu J W， Zhao W， Zhong J J. Biotechnological production and application of ganoderic acids[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2010， 87（2）： 457-466.

[6] Smiderle F R， Baggio C H， Borato D G， et al. Anti-infla?mmatory properties of the medicinal mushroom Cordyceps militaris might be related to its linear （1→3）-β-D-glucan[J]. PLoS One， 2014， 9（10）： e110266.

[7] Pan D， Zhang D， Wu J S， et al. A novel proteoglycan from Ganoderma lucidum fruiting bodies protects kidney function and ameliorates diabetic nephropathy via its antioxidant activity in C57BL/6 db/db mice[J]. Food and Chemical ToxiCology， 2014， 63： 111-118.

[8] Zhang S， Nie S， Huang D， et al. Immunomodulatory effect of Ganoderma atrum polysaccharide on CT26 tumor-bearing mice[J]. Food Chemistry， 2013， 136（3-4）： 1213-1219.

[9] 馮 ?娜， 顏夢秋， 王晨光， 等. 不同日常食用加工方法對靈芝中活性成分利用的比較[J]. 食用菌學報， 2017， 24（2）： 83-87.

[10] Lee Y H， Kim J H， Song C H， et al. Ethanol extract of Ganoderma lucidum augments cellular anti-oxidant defense through activation of Nrf2/HO-1[J]. Journal of Pharma- copuncture， 2016， 19（1）： 59-69.

[11] 葉麗云， 林 ?強， 劉 ?梅， 等. 鈣離子和水楊酸誘導靈芝多糖和三萜的合成[J]. 菌物學報， 2017， 36（2）： 220-228.

[12] 梁 ?磊， 黃清鏵， 王慶福， 等. 響應面優(yōu)化微波-超聲波協(xié)同提取靈芝三萜工藝及其清除自由基活性[J]. 菌物學報， 2017， 36（4）： 512-521.

[13] 張中霄， 王紅艷， 王開運， 等. 靈芝多糖拌種對小麥抗紋枯病的誘導效應及生長發(fā)育影響[J]. 中國農業(yè)科學， 2018， 51（1）： 96-104.

[14] 孫墨可， 張 ?曼， 田 ?娟， 等. 真菌免疫調節(jié)蛋白基因LZ-8過表達載體的構建及轉化靈芝原生質體的研究[J]. 菌物學報， 2017， 36（12）： 1625-1631.

[15] 馬 ?英. CW電子商務有限公司靈芝茶產品市場營銷策略研究[D]. 長春： 吉林大學， 2017.

[16] Yue Q X， Xie F B， Guan S H， et al. Interaction of Ganoderma triterpenes with doxorubicin and proteomic characterization of the possible molecular targets of Ganoderma triterpenes[J]. Cancer Science， 2008， 99（7）： 1461-1470.

[17] 金 ?鑫， 劉宗敏， 黃羽佳， 等. 我國靈芝栽培現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 食藥用菌， 2016， 24（1）： 33-37.

[18] Chen W M， Chai H M， Zhou H M， et al. Phylogenetic analysis of the Agrocybe aegerita multispecies complex in Southwest China inferred from ITS and mtSSU rDNA sequences and mating tests[J]. Annals of Microbiology， 2012， 62（4）： 1791-1801.

[19] 周會明， 張焱珍， 柴紅梅， 等. 野生雞瑽菌鑒定及最適菌株、培養(yǎng)基的篩選[J]. 河南農業(yè)科學， 2018， 47（7）： 106-111.

[20] 周會明， 張焱珍， 柴紅梅， 等. 一株野生花臉香蘑的生物學特性及其栽培[J]. 食用菌學報， 2017， 24（1）： 39-44， 2.

[21] Thompson J D， Gibson T J， Plewniak F， et al. The CLUSTAL X windows interface： Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（24）： 4876-4882.

[22] Tamura K， Dudley J， Nei M， et al. MEGA4： Molecular evolutionary genetics analysis （MEGA） software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution， 2007， 24（8）： 1596-1599.

[23] 周會明. 食用菌栽培技術[M]. 鄭州： 中國農業(yè)大學出版社， 2017.

[24] 周會明， 張焱珍， 席亞麗， 等. 荷葉離褶傘優(yōu)良菌株篩選[J]. 菌物學報， 2014， 33（2）： 208-217.

[25] 周會明， 柴紅梅， 趙 ?靜， 等. 基于SPSS的楊柳田頭菇菌絲生長速度與交配型相關性分析[J]. 西南農業(yè)學報， 2010， 23（6）： 1992-1998.

[26] 陳永敢， 屈 ?直， 陳川平， 等. 海南產靈芝Ganoderma sp.室內栽培方法研究[J]. 熱帶農業(yè)科學， 2016， 36（2）： 28-30， 35.

[27] 呂明亮， 應國華， 斯金平， 等. 基質對段木靈芝栽培外觀與產量的影響[J]. 中國食用菌， 2008， 27（5）： 22-24.

[28] 倫志明， 郭文學， 馬懷良， 等. 作物秸稈栽培靈芝試驗研究[J]. 食用菌， 2011， 35（5）： 24-25.

[29] 黃文麗， 陳祖琴， 金 ?鑫， 等. 果樹枝條栽培靈芝的品質特性分析[J]. 微生物學通報， 2016， 43（6）： 1274-1279.

[30] 韓嘉鈺， 魏 ?巍， 余夢瑤， 等. 不同栽培基質對靈芝基質營養(yǎng)物質及胞外酶活的影響[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2016， 27（3）： 715-719.

[31] 李欽艷， 鐘瑩瑩， 陳逸湘， 等. 我國靈芝種質資源及生產技術研究進展[J]. 中國食用菌， 2016， 35（1）： 8-12， 20.

收稿日期 ?2019-11-28;修回日期 ?2019-12-27

基金項目 ?云南省教育廳科學研究基金項目（No. 2019J0491）;國家食用菌產業(yè)技術體系項目（No. CARS-20）。

作者簡介 ?張焱珍（1986—），女，碩士，講師，研究方向：食用菌馴化、栽培及產品開發(fā)。*通信作者（Corresponding author）：柴紅梅（CHAI Hongmei），E-mail：chm621@aliyun.com。