局灶性腦低溫處理對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型的保護(hù)作用

費(fèi)曉煒 徐如祥 魏明海 賀業(yè)霆

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是外界暴力作用于頭部導(dǎo)致的腦組織器質(zhì)性損傷，臨床多表現(xiàn)為腦震蕩、腦挫裂傷、彌漫性軸索損傷及和腦干損傷。TBI會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腦水腫及癲癇樣棘波，因此部分患者會(huì)產(chǎn)生癲癇癥狀，及時(shí)有效安全的治療對(duì)TBI至關(guān)重要。低溫治療在臨床上又稱為冬眠療法，根據(jù)溫度不同可分為輕度（33℃～36℃）、中度（28℃～32℃）、深度（17℃～28℃）和超深（17℃以下）低溫。全身性低溫對(duì)腦損傷和缺血患者的臨床運(yùn)用展示出了良好的治療效果，但是也會(huì)出現(xiàn)致命并發(fā)癥的幾率，如感染、心律失常、血液凝固異常等[1,2]。為了更好地解決這個(gè)問(wèn)題，局部腦冷卻作為腦損傷的微創(chuàng)治療受到廣泛關(guān)注。從1959年至1963年，對(duì)腦腫瘤和癲癇患者進(jìn)行了局部腦冷卻的初始臨床應(yīng)用，并證明了其有效性[3,4]。盡管這些初步研究支持局部腦冷卻的治療潛力，但尚未針對(duì)臨床應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化。本研究通過(guò)SD大鼠TBI模型表明了利用局部腦皮層冷卻可抑制TBI引起的腦水腫及癲癇樣棘波的發(fā)生，從而起到腦保護(hù)作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18只健康雄性SD大鼠（180～220 g）購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物級(jí)別、飼養(yǎng)條件、手術(shù)過(guò)程、對(duì)照處理、取材等嚴(yán)格按照大連醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物管理中心相關(guān)規(guī)定執(zhí)行，并符合National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals。

二、儀器

TBI模型制作設(shè)備：液壓腦損傷打擊儀液壓裝置由圓形液柱，電打擊架、示波器和壓力傳感器組成。圓形液柱內(nèi)裝生理鹽水，一端是有機(jī)玻璃活塞，另一端連接打擊管和壓力傳感器，打擊面為直徑3 mm的圓形。通過(guò)打擊玻璃活塞產(chǎn)生壓力，管內(nèi)的液體將壓力傳導(dǎo)到大腦皮層，造成腦損傷。冷卻設(shè)備：采用鈦合金材料制作皮層冷卻模塊，大小6 mm×6 mm，冷卻模塊兩端連接冷卻泵，通過(guò)調(diào)控冷卻水泵的排水速度來(lái)達(dá)到降低腦皮層溫度，從而起到局灶性亞低溫腦保護(hù)作用。

三、試劑

SDS-PAGE凝膠制備試劑盒及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶試劑有限公司。AQP4抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司（ab46182），GABAB1R抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司（3835s）。

四、實(shí)驗(yàn)分組及處理

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組），非冷卻組（non-cooling組），冷卻組（cooling組），每組5只。Sham組大鼠只開(kāi)顱不創(chuàng)傷，non-cooling組和cooling組大鼠均制作為創(chuàng)傷模型，non-cooling組創(chuàng)傷后不予處理。Cooling組給予冷卻處理：腦皮層創(chuàng)傷處迅速降溫至15℃維持3 h，之后為回溫狀態(tài)，每隔10 min升高1℃，升至30℃后維持30 min，整個(gè)回溫過(guò)程持續(xù)3 h。手術(shù)開(kāi)顱骨窗定位及創(chuàng)傷面積見(jiàn)圖1。

圖1 手術(shù)操作示意圖

五、腦組織GABAB1R和AQP4檢測(cè)

取腦組織于500 mL裂解液中，置于冰上裂解1 h，取2 μL用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，按照標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算樣品上樣量。125 mL 5×loading buffer加入含有腦組織的裂解液中，100℃水浴10 min，12 000 g離心15 min取上清用于檢測(cè)。在12%的分離膠與5%的濃縮膠中進(jìn)行蛋白電泳，每孔上樣蛋白總量為30 μg，按恒壓80 V和120 V分別跑濃縮膠和分離膠。恒壓110 V電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%牛血清白蛋白封閉1 h。AQP4抗體使用濃度1 μg/mL，GABAB1R按1∶1000稀釋于1×TBST中使用，4℃過(guò)夜。對(duì)應(yīng)種屬二抗孵育1 h，凝膠成像設(shè)備曝光。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。方差齊性且呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、3組大鼠血?dú)庥涗洷容^

Cooling組在TBI后平均動(dòng)脈血壓較其他組下降明顯，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2A）。Sham組大鼠受到開(kāi)顱刺激且cooling組和non-cooling組大鼠TBI后，血?dú)鈖CO2明顯上升，pO2無(wú)明顯變化，cooling組pCO2分別和sham組、non-cooling組比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.565，P=0.023；t=4.000，P=0.016）；cooling組pO2和sham組、no-cooling組比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.002，P=0.000；t=3.320，P=0.029）（圖2B～C）。

二、TBI后cooling組與non-cooling組腦組織死亡比較

回溫持續(xù)3 h后對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉處死，用2%TTC進(jìn)行染色，低溫處理能明顯改善TBI造成的腦損傷（圖3A～B），對(duì)大鼠進(jìn)行4%多聚甲醛灌流后取腦組織后進(jìn)行HE染色，non-cooling組較cooling組損傷部位細(xì)胞核缺少，細(xì)胞核染色較淺（圖3C～D）。

三、3組大鼠術(shù)后癲癇樣棘波頻率比較

Sham組進(jìn)行假手術(shù)后皮層電位未發(fā)生明顯改變。Non-cooling和cooling組在TBI處理后均出現(xiàn)明顯的癲癇樣棘波。然而，cooling組中在15℃的腦冷卻期間癲癇樣棘波顯著受到抑制，并且在整個(gè)復(fù)溫期間癲癇樣棘波的不完全抑制持續(xù)存在。在sham組和non-cooling組中，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中所有頻率范圍內(nèi)的功率譜差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4A）。然而，在cooling組中頻率范圍4～25 Hz的功率譜低溫冷卻相比冷卻處理前明顯降低，回溫時(shí)各波譜的平均功率雖較低溫時(shí)略上升，但較冷卻前降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4B）。此外，頻率范圍1～4 Hz、25～30 Hz的波譜在各處理階段功率譜之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4C）。

檢測(cè)TBI損傷周圍腦組織中GABAB1R蛋白含量，結(jié)果顯示cooling組的GABAB1R蛋白含量較non-cooling組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=33.411，P=0.000）（圖4D）。

四、TBI后cooling組和non-cooling組腦組織水腫比較

Cooling組腦組織蒸干前后的質(zhì)量差較noncooling組大，蒸干后cooling組腦重量較non-cooling組大，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.436，P=0.011，圖5A）。Cooling組較non-cooling組腦水腫癥狀輕，且腦組織AQP4蛋白含量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.510，P=0.001，圖5B）。

圖2 實(shí)驗(yàn)全程大鼠血?dú)庥涗?/p>

圖3 大鼠腦組織TTC染色和HE染色

圖4 實(shí)驗(yàn)全程大鼠皮層腦電分析和GABAB1R表達(dá)變化；圖5創(chuàng)傷性腦損傷后cooling組和non-cooling組水腫情況及AQP4表達(dá)變化

討論

在臨床上不能預(yù)防原發(fā)性TBI，但是由其引起的繼發(fā)性腦損傷如腦水腫、腦死亡、癲癇等并發(fā)癥對(duì)患者的影響較原發(fā)性TBI更嚴(yán)重，因此如何更好地預(yù)防TBI之后的各類并發(fā)癥顯得極為重要。低溫治療TBI的基本理論基礎(chǔ)可能與降低腦組織耗氧量、減少乳酸在腦組織中的堆積、保護(hù)血腦屏障和降低腦組織水腫程度有關(guān)[5,6]。最新研究發(fā)現(xiàn)中度低溫通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬/凋亡和MyD88依賴性TLR4信號(hào)通路抑制創(chuàng)傷性腦損傷后的小膠質(zhì)細(xì)胞激活[7]。此外，低溫預(yù)處理通過(guò)增強(qiáng)神經(jīng)元的突觸可塑性改善創(chuàng)傷性腦損傷引起的認(rèn)知功能障礙[8]。中度低溫通過(guò)影響細(xì)胞自噬途徑減少腦損傷后海馬細(xì)胞的死亡[9]。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是最普通的腦內(nèi)抑制性遞質(zhì)，通過(guò)與突觸后膜相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮作用，與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)[10]。許多抗癲癇藥能增加腦內(nèi)GABA的含量，從而改善大腦過(guò)度放電導(dǎo)致癲癇的癥狀。GABA受體根據(jù)藥理學(xué)特征不同可分為GABA-A受體、GABA-B受體和GABA-C受體，其中GABA-B受體屬代謝型受體，可與鈣離子、鉀離子和G蛋白偶聯(lián)。目前對(duì)GABAB1R研究較少，有研究顯示在人類難治性顳葉癲癇病中GABAB1R蛋白和mRNA含量上升[11]。本研究檢測(cè)到cooling組癲癇樣棘波出現(xiàn)頻率較其他組少，且Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GABAB1R蛋白低溫處理后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，與之前的研究相符。因此筆者猜測(cè)低溫冷卻抑制TBI引起的癲癇樣棘波，其機(jī)制可能與調(diào)控GABAB1R有關(guān)，但是具體如何調(diào)控GABAB1R涉及的信號(hào)通路還有待進(jìn)一步研究。

AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的水通道蛋白，位于星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突上，不同原因引起的腦水腫中AQP4的表達(dá)變化不同[12]。細(xì)胞毒性腦水腫AQP4的缺失能降低水流入腦組織的速度，減輕細(xì)胞毒性腦水腫。相反，缺失AQP4能降低血管源性腦水腫水流出腦組織的速度，加重血管源性腦水腫[13,14]。通過(guò)對(duì)腦組織進(jìn)行外力的打擊形成TBI模型，腦組織TTC染色和HE染色都顯示出細(xì)胞死亡，所引起的水腫屬于細(xì)胞毒性腦水腫[15]。AQP4 Western blot檢測(cè)結(jié)果與之前報(bào)道的結(jié)果相符。此外，有研究發(fā)現(xiàn)Foxo3a上調(diào)AQP4的轉(zhuǎn)錄水平，誘導(dǎo)TBI后引起的腦水腫。選擇性血管加壓素-1a受體拮抗劑可預(yù)防局灶性腦外傷后引起的腦水腫，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹和GFAP、V1aR和AQP4的表達(dá)[16]。本研究證實(shí)了低溫抑制TBI后引起的腦水腫和AQP4之間的相關(guān)性，但具體潛在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)局部低溫處理能降低腦組織的新陳代謝，減輕TBI后腦細(xì)胞死亡，抑制大腦皮層癲癇樣棘波產(chǎn)生的機(jī)制可能與GABAB1R相關(guān)，減輕損傷后腦水腫程度的機(jī)制可能與AQP4相關(guān)，為臨床治療TBI提供了一種更加安全有效的方法。