雞骨素中硝基呋喃代謝物殘留量的不確定度評(píng)定

王成梅 徐進(jìn)

摘要：本文對(duì)雞骨素中硝基呋喃代謝物殘留量的液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行了不確定度的評(píng)定。本文參照《測(cè)量不確定度的評(píng)定與表示》相關(guān)理論，建立對(duì)應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，對(duì)雞骨素中硝基呋喃代謝物殘留量的不確定度進(jìn)行來源分析和計(jì)算。本文認(rèn)為不確定度的來源主要有以下幾個(gè)方面：標(biāo)品的純度;配制的過程;稱樣量;重復(fù)測(cè)定次數(shù);加標(biāo)回收率等方面。當(dāng)添加濃度在1.0μg/kg的水平下，四種硝基呋喃代謝物的不確定度分別為：硝基呋喃西林代謝物CSEM=0.981μg/kg，U=0.070μg/kg，k=2;呋喃唑酮代謝物CAOZ=1.032μg/kg，U=0.061μg/kg，k=2;呋喃它酮代謝物CAMOZ=1.068μg/kg，U=0.076μg/kg，k=2;呋喃妥因代謝物CAHD=1.007μg/kg，U=0.046μg/kg，k=2。本試驗(yàn)研究結(jié)果對(duì)于實(shí)際操作過程中減少不確定度，提高數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和可靠性具有重要的意義。

關(guān)鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;雞骨素;硝基呋喃代謝物;不確定度

硝基呋喃類藥物是一種廣譜性抗菌藥物，具有價(jià)格低廉、殺菌效果強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。硝基呋喃類藥物在體內(nèi)的代謝物易與體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物。該化合物在體內(nèi)貯留時(shí)間久，能誘發(fā)基因突變，具有高制畸、致癌、致突變等危害[1-3]。因此硝基呋喃它酮、硝基呋喃唑酮、硝基呋喃妥因和硝基呋喃西林列入違禁獸藥，要求所有食品動(dòng)物中不得檢出。目前對(duì)于硝基呋喃代謝物的檢測(cè)方法中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是幾種檢測(cè)方法中精密度最高、數(shù)據(jù)最準(zhǔn)確的一種方法。

測(cè)量不確定度是一種表示測(cè)量值分散性的重要參數(shù)[4]，是評(píng)定結(jié)果和水平的重要指標(biāo)。GB/T 27025-2008中明確規(guī)定要具有不確定度或評(píng)定不確定度的程序[5]。隨著檢測(cè)能力和檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的逐漸提高，資質(zhì)認(rèn)定過程中不確定度已經(jīng)成為檢測(cè)過程中必須完成的一項(xiàng)工作。不確定度的研究對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性判定具有重要的意義。本文通過對(duì)雞骨素中硝基呋喃代謝物殘留量的內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行不確定度分析，找出影響因素，從而保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，提高檢測(cè)數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

1 材料和設(shè)備

儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（1260-6460，美國(guó)Agilent公司）;水浴恒溫振蕩器;MS3 Digital渦旋振蕩器（德國(guó)IKA公司）電子天平和高精密電子天平;高速冷凍離心機(jī);純水機(jī);pH計(jì);5mL、1mL和100μL移液槍;

試劑與材料

呋喃西林代謝物鹽酸鹽（簡(jiǎn)稱：SEM.HCL，下同）純度99.8%，德國(guó)Dr公司;呋喃妥因代謝物鹽酸鹽（簡(jiǎn)稱：AHD.HCL，下同）純度99.3%，德國(guó)Dr公司;呋喃唑酮代謝物AOZ純度99.3%，德國(guó)Dr公司;呋喃它酮代謝物（簡(jiǎn)稱：AMOZ，下同）純度99.6%，德國(guó)Dr公司;呋喃西林代謝物同位素標(biāo)準(zhǔn)品SEM-13C-15N2，WITEGA公司;呋喃妥因代謝物同位素標(biāo)準(zhǔn)品AHD-13C3，WITEGA公司;呋喃唑酮代謝物氘代物AOZ-D4純度，德國(guó)Dr公司;呋喃它酮代謝物氘代物AMOZ-D5純度，德國(guó)Dr公司;甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、甲酸、鄰硝基苯甲醛為色譜純，購(gòu)自Fisher Scientific公司;濃鹽酸、氫氧化鈉、乙酸銨、磷酸氫二鉀均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

實(shí)驗(yàn)用樣品來自天博食品配料有限公司。

方法

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱取AOZ 10.06mg、SEM·HCL 14.9mg、AMOZ 10.04mg、AHD·HCL 13.26mg，AOZ-D4 10.0mg、SEM-13C-15N2 10.0mg、AMOZ-13C3 10.04mg、AHD-13C3 10.0mg，乙腈溶解配置成1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1mL的移液槍各移取1.0mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，用乙腈定容。用同樣的方法進(jìn)行稀釋最終得10.0Ug/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合內(nèi)標(biāo)工作溶液：按照上述方法進(jìn)行同樣的稀釋配置成10.0μg/L內(nèi)標(biāo)混合工作液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：分別移取10.0Ug/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液50、100μL和準(zhǔn)確吸取100.0Ug/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20、50、100μL至5個(gè)50mL離心管中，分別加入20μL混合內(nèi)標(biāo)工作溶液，按照前處理步驟分別制成0.50、1.0、2.0、5.0、10.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線，上機(jī)待測(cè)。

前處理

稱取樣品2.000g于研缽中，加入2.5-4g的硅藻土進(jìn)行細(xì)細(xì)研磨。樣品研磨后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入內(nèi)標(biāo)20μL，通過回收把控質(zhì)量，再加入0.2mol/L鹽酸10mL和鄰硝基苯甲醛（稱取鄰硝基苯甲醛0.015g，甲醇定容1mL，100?L對(duì)應(yīng)一個(gè)樣品）。11500r/min均質(zhì)1min，37℃恒溫振蕩器中避光衍生16h。取出冷卻至室溫，加入磷酸氫二鉀和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.5左右。加入5mL的乙酸乙酯，振蕩20min，9000r/min離心5min。上清液轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，重復(fù)提取兩次，合并提取液。40℃氮吹近干，加1mL0.1%甲酸溶液，加入2mL正己烷除油，渦旋2min，5000r/min離心5min，取下層液過0.22Um水系膜過濾，上進(jìn)待測(cè)。

1.3.3 測(cè)量不確定度來源

不確定度來源主要來自以下幾個(gè)方面：標(biāo)品的純度（含內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)）;標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程;混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制;稱樣量;重復(fù)測(cè)量;復(fù)現(xiàn)性限R等。

2 不確定度評(píng)定

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

本實(shí)驗(yàn)按照下式（1）計(jì)算雞骨素中硝基呋喃代謝物的殘留量：

式中R表示樣液中分析物與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值;c代表混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中分析物的濃度（ng/mL）;V為樣液最終定容體積單位為毫升（mL）;RS表示混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中分析物與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值;m代表試樣質(zhì)量（g）。

2.2 合成不確定度公式如下式：

Urel（1）：標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度;

Urel（2）：內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度;

Urel（3）：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度;

Urel（4）：內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度;

Urel（5）：稱樣量引入的不確定度;

Urel（6）：重復(fù)線性回收引入的不確定度;

urel（7）：加標(biāo)回收率引入的不確定度

2.3不確定度的分量計(jì)算

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度的不確定度

SEM·HC擴(kuò)展不確定度U=0.92%，由于擴(kuò)展不確定度是是標(biāo)準(zhǔn)不確定度的k倍，包含因子k=2，故其純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

Urel（SEM·HCL）=U/k=0.92%/2=0.0046

AMOZ擴(kuò)展不確定度U=3.73%，包含因子k=2，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

Urel（AMOZ）=U/k=3.73%/2=0.01865

AOZ擴(kuò)展不確定度U=1.73%，包含因子k=2，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

Urel（AOZ）=U/k=1.73%/2=0.00865

AHD擴(kuò)展不確定度U=2.99%，包含因子k=2，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

Urel（AHD）=U/k=2.99%/2=0.01495

2.3.2 內(nèi)標(biāo)純度引入的不確定度

AOZ-D4擴(kuò)展不確定度U=1.95%，包含因子k=2，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

Urel（AOZ-D4）=U/k=1.95%/2=0.00975

AMOZ-D5擴(kuò)展不確定度U=1.15%，包含因子k=2，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

Urel（AMOZ-D5）=U/k=1.15%/2=0.00575

AHD-13C3純度為（99.8±0.2）%，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

Urel（AHD-13C3）=?=0.00116

SEM-13C-5N2純度為（99.98±0.2）%，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

Urel（SEM-13C-5N2）=?=0.00116

2.3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量不確定度來自三個(gè)方面：a，稱量的重復(fù)性，可以通過10次重復(fù)稱量，用UA（m1）表示;b，來自天平稱量不準(zhǔn)造成的不確定度;c，天平標(biāo)度的可讀性（數(shù)字分辨力）引入的不確定度。

a.對(duì)標(biāo)品進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)量（注：稱樣量和實(shí)際稱量盡可能一致），采用貝塞爾公式計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度等于1倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

b.電子天平的最大允許誤差為±0.03mg，區(qū)間半寬度a1（m1）=0.03mg，該分布屬于均勻分布，包含因子k1（m1）= .其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

c.天平分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量UB2（m1）=0.005mg，k2（m1）= 。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成不確定度為：

由此可得出各化合物的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

Urel（SEM·HCL）=0.0339mg/14.9mg=0.002275

Urel（AMOZ）=0.0339mg/10.04mg=0.003376

Urel（AOZ）=0.0339mg/10.06mg=0.003370

Urel（AHD·HCL）=0.0339mg/13.26mg=0.002557

2.3.3.2 定容體積引入的不確定度

定容體積不確定來源于三個(gè)方面：第一，重復(fù)性UA（V）;第二，容量瓶允差UB1（V）;溫度系數(shù)UB2（V）。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)100mL的容量瓶定容10次，采用貝塞爾公式計(jì)算偏差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度等于一倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液采用乙腈溶解，定容至100mL容量瓶中，配制成相應(yīng)的濃度。容量瓶的檢定規(guī)程《JJG196-2006 常用玻璃量具》規(guī)定100mL的容量瓶屬于A級(jí)容量瓶。其所允許的偏差為±0.10。區(qū)間半寬度a1（V）=0.10。服從三角分布，包含因子k1（V）= 。其標(biāo)準(zhǔn)不確定UB1（V）為：

根據(jù)規(guī)程，容量瓶的檢定是在20℃條件下進(jìn)行的。而液體的體積膨脹系數(shù)遠(yuǎn)大于玻璃，因此實(shí)驗(yàn)過程中只需要考慮液體的體積產(chǎn)生的膨脹系數(shù)。乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，產(chǎn)生的體積變化為±（100×4×1.37×10-3）=±0.548mL

則區(qū)間半寬度a2（V）=0.548mL，設(shè)為區(qū)間分布，包含因子k2=，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則合成不確定度為：

其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引入的不確定度

混合中間溶液采取逐級(jí)稀釋的操作，從1.0mg/mL稀釋到10.0μg/L。稀釋過程采用10mL的容量瓶和1000μL的移液槍。10mL的容量瓶最大允許誤差為±0.020mL，1000μL的移液槍的最大允許誤差為±1.0%，按照均勻分布，k=，則不確定度為：

2.4 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

如2.3.3 內(nèi)標(biāo)溶液配制過程中稱樣量引入的不確定度分別為：

Urel（SEM-13C-15N2）=0.0339mg/10.0mg=0.00339

Urel（AMOZ-13C3）=0.0339mg/10.04mg=0.003376

Urel（AHD-13C3）=0.0339mg/10.0mg=0.00339

Urel（AOZ-D4）=0.0339mg/10.0mg=0.00339

定容體積和稀釋過程引入的不確定度如2.3.3.2和2.3.3.3一樣。

2.5樣品稱量引入的不確定度

天平分辨力為0.1mg，區(qū)間半寬度a2=0.05mg，k3=，樣品的稱樣量為2.00g。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.6 重復(fù)測(cè)量引入不確定度

對(duì)某一濃度進(jìn)行重復(fù)測(cè)量10次，根據(jù)貝塞爾公式進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式如下;計(jì)算結(jié)果見表1

標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式：

2.7 加標(biāo)回收率引入的相對(duì)不確定度

對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，在2μg/kg水平下進(jìn)行6次加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，用如下公式進(jìn)行計(jì)算。加標(biāo)回收不確定度服從均勻分布，k=，計(jì)算結(jié)果見下表：

2.8 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度及不確定度

以上各項(xiàng)不確定度相互獨(dú)立，不考慮分量之間的相關(guān)性，則合成不確定度urel（c）按照公式（2）計(jì)算和不確定度uc（X）檢測(cè)結(jié)果見下表。

95%置信概率其包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=k*uc（X），根據(jù)計(jì)算結(jié)果為：硝基呋喃西林代謝物CSEM=0.981μg/kg，U=0.070μg/kg，k=2;呋喃唑酮代謝物CAOZ=1.032μg/kg，U=0.061μg/kg，k=2;呋喃它酮代謝物CAMOZ=1.068μg/kg，U=0.076μg/kg，k=2;呋喃妥因代謝物CAHD=1.007μg/kg，U=0.046μg/kg，k=2。

3 結(jié)論

根據(jù)測(cè)量不確定度評(píng)定方法，本實(shí)驗(yàn)對(duì)雞骨素中硝基呋喃代謝物不確定度來源進(jìn)行分析，通過建立數(shù)學(xué)模型，評(píng)定和計(jì)算各不確定度分量。結(jié)果表明，雞骨素中硝基呋喃代謝物殘留量測(cè)定的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)品純度、配制過程、樣品稱樣量、重復(fù)測(cè)量、樣品加標(biāo)回收等方面。因此在日常的檢測(cè)中應(yīng)盡量選用純度較高的標(biāo)品，在配制的過程中選用精密度高的玻璃量器或者移液器、天平等。同時(shí)在測(cè)定的過程中盡量做到多次測(cè)量以減少檢測(cè)過程中產(chǎn)生的不確定度，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

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作者簡(jiǎn)介：王成梅（1984.12）女，漢族，山東省濟(jì)寧市，中級(jí)工程師，研究生（碩士），研究方向：食品檢測(cè)與安全 .

徐進(jìn)（1988.7） 女 漢族 山東省濟(jì)寧市，助理工程師，本科 ，研究方向：食品檢測(cè)與樣品管理.