復合酶制劑及植物精油對感染產氣莢膜梭菌肉仔雞抗氧化及免疫指標的影響

孫秋娟，安然，咼于明*

(1.北京市華都峪口禽業(yè)有限責任公司，北京 101206；2.中國農業(yè)大學 動物科技學院，北京 100193)

壞死性腸炎為目前全球普遍高發(fā)的一種禽病，對經濟及動物福利的影響巨大。在歐盟抗生素禁用及配方中動物副產品使用受限的情況下，壞死性腸炎尤為嚴重[1]。A型或C型產氣莢膜梭菌繁殖產生的細菌外毒素是引起壞死性腸炎的主要因素[2]。Qiujuan Sun等研究表明，酶制劑和植物精油的添加可提高產氣莢膜梭菌感染肉雞的生長性狀，并可降低回腸有害菌的定殖，保護腸道屏障功能及組織形態(tài)結構免受產氣莢膜梭菌感染的侵害，從而維持腸道健康[3]。蛋白酶也被證明可緩解壞死性腸炎造成的損失[4]?？寡趸懊庖吡τ诰S持機體健康狀況至關重要。Lee等采用胚胎注射硒的方式，驗證硒對于產氣莢膜梭菌感染的肉仔雞的抗氧化力及免疫力等有保護作用[5]。本試驗旨在驗證酶制劑及植物精油對機體抗氧化力及免疫力的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用植物精油及復合酶制劑均購自Novus Intl. Inc.。植物精油(EO)中含麝香草酚25%、香芹酚25%、二氧化硅37%、單甘油酯及雙甘油酯13%；復合酶制劑(CSM)中含木聚糖酶2 424 000 IU·kg-1、葡聚糖酶506 600 IU·kg-1及甘露聚糖酶322 800 IU·kg-1。

1.2 試驗方法

試驗選用648只Cobb 500雌性肉仔雞作為試驗對象，隨機分為8個處理(每個處理9個重復，每個重復9只雞)。選用小麥-豆粕型日糧，采用2×2×2因子設計，研究植物精油(EO：0、60 mg·kg-1)、復合酶制劑(CSM：0、500 mg·kg-1)、細菌感染(產氣莢膜梭菌：感染、未感染)及其交互作用對肉雞腸道健康的影響。試驗處理見表1。日糧配制參照NRC(1 994)，基礎日糧組成見表2，日糧營養(yǎng)指標實測值見表3。試驗自肉仔雞0日齡至35日齡，自由采食、飲水。日常管理按常規(guī)程序進行。

表1 試驗處理Table 1 Experiment design

注：產氣莢膜梭菌感染(“+”為感染；“-”為未感染)。

Note：ClostridiumPerfringensChallenge: “+” means challenged, “-” means with no challenge.

產氣莢膜梭菌感染模型采用劉丹[6]修改過的Dahiya[7]建立的試驗方法。人工感染選用雞源A型產氣莢膜梭菌(CVCC52)，菌種購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。仔雞第14至20日齡時，處理1至4的肉雞每日進行嗉囊接種1 mL A型產氣莢膜梭菌菌液(2×108菌·mL-1)，處理5至8則每日接種1 mL相同的無菌培養(yǎng)基[3]。

21、28日齡時，每處理隨機選取6只仔雞屠宰取樣。分離血清、血漿，-30 ℃保存以備血液生化指標測定。血清IFNγ、IL-1β及IL-10濃度均采用ELISA試劑盒(Cusabio Biotech)進行測定。血漿谷胱甘肽過氧化物酶活性及血清尿酸水平采用南京建成的試劑盒進行測定。

表2 試驗基礎日糧配方Table 2 Composition of basal diet

注：1每千克日糧中微量元素含量為：銅8 mg，鋅75 mg，鐵80 mg，錳100 mg，硒0.15 mg，碘0.35 mg。2每千克日糧中維生素含量為：VA，12 500 IU；VD3，2 500 IU；VK3，2.65 mg；VB1，2 mg；VB2，6 mg；VB12，0.025 mg；VE，30 IU；生物素，0.032 5 mg；葉酸，1.25 mg；泛酸，12 mg；尼克酸，50 mg。

Note：1Trace mineral premix provided the following (per kg of diet): copper, 8 mg; zinc, 75 mg; iron, 80 mg; manganese, 100 mg; selenium, 0.15 mg; iodine, 0.35 mg.2Vitamin premix provided the following (per kg of diet): vitamin A, 12 500 IU; vitaminD3, 2 500 IU; vitamin K3, 2.65 mg; vitamin B1, 2 mg; vitamin B2, 6 mg; vitaminB12, 0.025 mg; vitamin E, 30 IU; biotin, 0.032 5 mg; folic acid, 1.25 mg; pantothenic acid, 12 mg; niacin, 50 mg.

1.3 統(tǒng)計分析

數據采用SPSS 16.0軟件中GLM過程進行統(tǒng)計分析，剖析植物精油EO、復合酶制劑CSM、產氣莢膜梭菌感染及其相關關系的影響。交互作用顯著時，采用One-way ANOVA進行分析，處理間差異采用Duncan多重比較進行檢驗，并編程剖析產生交互作用的原因。P<0.05時認為差異顯著。

2 試驗結果

2.1 血清細胞因子

血清細胞因子測定結果見表3。肉仔雞感染產氣莢膜梭菌未對IL-10濃度產生影響(P>0.10)，但顯著提高28日齡IL-1β水平(P<0.01)。日糧中CSM的添加顯著提高21日齡時血清IL-1β、IL-10(P< 0.05，P< 0.05)，但降低28日齡時IL-1β水平(P<0.01)。日糧中添加EO有提高21日齡IL-10的趨勢(P=0.061)。28日齡時血清IFNγ存在EO及CSM的交互作用(P=0.053)：與未添加EO及CSM的日糧(28.16)相比，日糧中CSM的添加顯著提高28日齡血清IFNγ水平(-EO、+CSM：43.98；+EO、+CSM：36.83)。而28日齡血清IL-10則表現(xiàn)出細菌感染、EO及CSM之間的交互作用(P<0.01)：未感染產氣莢膜梭菌肉仔雞采食基礎日糧28日齡時具有較高的血清IL-10水平；而感染產氣莢膜梭菌后，CSM處理組血清IL-10水平最高。

表3 植物精油及復合酶制劑對感染產氣莢膜梭菌肉雞血清細胞因子的影響Table 3 Effects of essential oil and feed enzymes on serum cytokines concentration of C. perfringens challenged chicks

注:同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different letters show significant difference at the 0.05 level in the same array.

2.2 血清抗氧化指標

血清尿酸及谷胱甘肽過氧化物酶的測定結果見表4。肉仔雞產氣莢膜梭菌感染，顯著提高21日齡時血清尿酸水平(P<0.01)。日糧中CSM的添加顯著提高28日齡時血清尿酸濃度(P<0.05)。21日齡時血清谷胱甘肽過氧化物酶活性存在產氣莢膜梭菌感染及EO之間的交互作用(P<0.05)：飼喂添加EO日糧的肉仔雞在產氣莢膜梭菌感染后血清谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著提高(+EO、未感染：771.7，+EO、感染后：887.1)。28日齡時血清谷胱甘肽過氧化物酶活性則表現(xiàn)出產氣莢膜梭菌感染及CSM之間的交互作用(P< 0.05)：日糧中CSM的添加可緩解產氣莢膜梭菌感染導致的谷胱甘肽過氧化物酶活性的降低。

表4 植物精油及復合酶制劑對感染產氣莢膜梭菌肉雞血清抗氧化指標的影響Table 4 Effects of essential oil and feed enzymes on serum antioxidant capacity of C. perfringens challenged chicks

注:同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note：Different letters show significant difference at the 0.05 level in the same array.

3 討論

3.1 免疫功能

試驗自14日齡開始產氣莢膜梭菌攻毒，并持續(xù)至20日齡。產氣莢膜梭菌感染可引發(fā)機體產生炎癥反應，釋放炎性因子。本試驗結果顯示，產氣莢膜梭菌感染早期血清炎性因子IFNγ、IL-1β及抗炎性因子IL-10的水平與健康組無顯著差異，而感染后期血清IL-1β濃度顯著高于健康肉雞。炎性因子IL-1β被證明可誘發(fā)發(fā)熱反應，激活細胞因子網絡[8]。感染沙門氏菌肉雞，IL-1β的基因表達水平的上調一般發(fā)生在感染1～6周后[9, 10]。28日齡感染產氣莢膜梭菌的仔雞血清IL-1β水平高于健康組，可證實其機體存在炎癥反應、模型建立成功。

IL-10為抗炎性因子，在體內可抑制IL-1β、IL-6等炎性因子的產生[11]，并可抑制T細胞、單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞的激活和功能[12]。而本日糧中添加CSM和EO可提高21日齡IL-10的濃度，意味著CSM和EO可更好的調動機體抗炎性反應。而日糧CSM的添加可降低28日齡IL-1β、提高IL-10水平，也可以驗證CSM的添加可以降低機體的炎癥反應，并具有更好的抵抗炎癥反應的能力。

3.2 抗氧化功能

本試驗結果顯示，產氣莢膜梭菌感染可顯著提高機體尿酸水平。尿酸為禽類蛋白質代謝的產物，在機體內可清除血漿中2/3的自由基[13]。產氣莢膜梭菌感染引發(fā)機體的炎癥反應，并由此導致機體產生氧化應激。而血清尿酸水平的增加可以抵抗由于細菌感染造成的氧化應激狀態(tài)。谷胱甘肽過氧化物酶為體內抗氧化防御系統(tǒng)第一道防線中的一種重要的抗氧化酶[14]，可減少過氧化氫的產生。日糧中EO的添加可以提高產氣莢膜梭菌感染肉仔雞21日齡時血清谷胱甘肽過氧化物酶活性，而CSM可提高28日齡血清谷胱甘肽過氧化物酶活性，從而有利于機體自氧化應激狀態(tài)的恢復。

4 結論

本研究結果顯示，植物精油EO及復合酶制劑CSM在肉雞日糧中應用可提高產氣莢膜梭菌感染肉雞抵抗炎癥反應的能力及抗氧化力，從而有利于機體疾病情況下的恢復。未來可就植物精油及復合酶制劑的抗炎反應及抗氧化功能的影響機制進行進一步研究。