一株具有抑菌活性的平榛內(nèi)生真菌的鑒定

周永強，余佳佳，孔德靜，胡娟，陳群英，趙春麗，周英*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 實驗中心，貴州 貴陽 550025)

植物內(nèi)生真菌是指在植物的組織中以細胞內(nèi)或細胞間的方式生長，而不會對它們造成任何有害影響的微生物[1]。由于內(nèi)生真菌長期和宿主植物生活在一起并建立了特殊互相促進生長的關(guān)系，內(nèi)生真菌可以合成如萜類、生物堿類及芳香族類等抗菌物質(zhì)[2～4]。這些代謝產(chǎn)物種類豐富且多具有生物活性，如抗腫瘤、抑菌及抗氧化等[5～8]。此外，內(nèi)生真菌因具有生長周期短、易培養(yǎng)、條件易控制等特點，使得利用內(nèi)生真菌發(fā)酵獲得具有活性的抑菌成分成為可能。

榛(CorylusheterophylaFisch.ex Bess)，為樺木科(betulaceae)，榛屬(corlus L.)植物。目前國內(nèi)外學(xué)者已從榛樹植物中分離的到了多種有效成分，諸如β-谷甾醇類、鞣質(zhì)類、麥角甾醇類、黃酮類、及(口山)酮類(xanthone)化學(xué)成分[9]。榛樹中的這些化學(xué)成分多具有不同的生物活性，研究表明，榛樹中的鞣質(zhì)類成分具有對DPPH自由基清除能力，榛樹中黃酮類、苯駢色原酮類化合物多具有心血管保護作用、抗菌等活性，此外，有學(xué)者在榛樹中發(fā)現(xiàn)了具有抗腫瘤活性的紫杉醇類成分[9～11]。因此，榛屬植物有望成為提取紫杉醇原料藥的新植物資源。研究表明，藥用植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同的藥效成分，且許多高等植物所產(chǎn)生的具有新生物活性的化合物與其內(nèi)生菌有關(guān)[12]。然而，目前有關(guān)榛樹內(nèi)生真菌的研究尚無報道，本文擬對課題組前期分離的一株內(nèi)生真菌進行形態(tài)學(xué)和分子鑒定，并對該菌株發(fā)酵后進行體外抑菌活性的篩選，為擴大榛樹中抑菌成分的研究提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

平榛內(nèi)生真菌菌株zs-14由課題組從平榛的莖條中分離得到，經(jīng)純化后，保存于貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實驗室。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)及白色念珠菌(Moniliaalbican)均為本實驗室保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

內(nèi)生真菌zs-14的形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草桿菌的培養(yǎng)采用LB固體培養(yǎng)基，白色念珠菌的培養(yǎng)采用馬丁培養(yǎng)基。

1.3 試驗方法

1.3.1 內(nèi)生真菌zs-14的形態(tài)學(xué)鑒定

在無菌條件下，挑取保存在PDA斜面培養(yǎng)基上的內(nèi)生真菌菌絲或孢子，接種于插有滅菌過的蓋玻片的PDA培養(yǎng)基的交叉線處培養(yǎng)，于28 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5 d。待菌絲長到蓋玻片上時將玻片取下，放置酒精擦拭過的載玻片上，用乳酸酚-棉蘭染液固定0.5 h，用無菌水反復(fù)沖洗多余染液，隨后在光學(xué)顯微鏡下觀察內(nèi)生真菌的微觀形態(tài)特征，對照《真菌鑒定手冊》進行形態(tài)學(xué)鑒定[13]。

1.3.2 內(nèi)生真菌zs-14的分子鑒定

用接種針挑取保存在PDA斜面培養(yǎng)基的內(nèi)生真菌的菌絲，轉(zhuǎn)接于100 mL的PDB發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃黑暗條件，160 r·min-1搖床培養(yǎng)3～5 d。用8層無菌紗布過濾發(fā)酵液，得到菌絲，用液氮研磨法提取內(nèi)生真菌基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測真菌基因組DNA提取結(jié)果，并采用真菌的特異性鑒定引物V9D(5’-TTAAGTCCCTGCCCTTTGTA-3’)、LS266(5’-GCATTCCCAAACAACTCGACTC-3’)對內(nèi)生真菌進行ITS (Internal Transcribed Spacer)序列擴增。擴增反應(yīng)體系50 μL：模板DNA：1 μL，Taq DNA聚合酶(50 U·μL-1)：0.35 μL，10×PCR Buffer：7 μL，dNTP (2.5 mM)：4 μL，引物V9D(10 μM)：2 μL，引物L(fēng)S266(10 μM)：2 μL，滅菌去離子水：33.65 μL。擴增結(jié)束后，取5 μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證目的條帶，進一步將擴增出未純化的PCR產(chǎn)物進行測序。最后將所得序列結(jié)果與GenBank中已知序列進行blast分析，應(yīng)用MEGA5.05軟件對比分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3.3 內(nèi)生真菌zs-14發(fā)酵液抑菌活性檢測

收集培養(yǎng)10 d的100 mL榛樹內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)物，用布氏漏斗將菌體與發(fā)酵液分開。然后無菌條件下取20 mL發(fā)酵液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液備用。另外，將抽濾后的發(fā)酵液依次用石油醚、乙酸乙酯及水飽和正丁醇進行萃取，回收溶劑的相應(yīng)萃取物，備用。

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌菌株活化后分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r·min-1震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移液槍吸取200 μL菌液分別涂布于LB瓊脂平板。將白色念珠菌接種到馬丁液體培養(yǎng)基，28 ℃、150 r·min-1震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移液槍吸取200 μL菌液涂布于馬丁瓊脂平板。然后無菌條件分別吸取已過濾處理的50 μL的內(nèi)生真菌濾液、25 g·L-1的石油醚、乙酸乙酯及水飽和正丁醇的萃取物于無菌空白藥敏紙片(直徑5 mm)上，用無菌鑷子夾取貼于帶菌平板表面，同以浸潤有青霉素鈉溶液(100U·片-1)的濾紙片作為陽性對照，不含藥液的濾紙片作為陰性對照。細菌、真菌分別37 ℃、28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察其對供試菌株的抑制作用，用抑菌圈測量儀測量抑菌圈半徑大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 平榛內(nèi)生真菌zs-14形態(tài)學(xué)鑒定

zs-14的菌絲在PDA平板剛萌發(fā)時成白色絨毛狀，菌落形成時，則變?yōu)辄S色邊緣及頂部間有白色絨毛狀，菌落薄，皺縮，呈放射狀生長，無滲出液。插片培養(yǎng)5 d后，取下蓋玻片，經(jīng)乳酸-棉蘭染液染色觀察，發(fā)現(xiàn)顯微鏡下菌絲呈成網(wǎng)狀發(fā)散狀分布，分生孢子呈球形狀，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征將zs-14鑒定為Phomasp.(莖點霉屬)(圖1)。

A.菌落形態(tài)B.孢子形態(tài)C.菌絲形態(tài)D.液體發(fā)酵 A. Colony B. Spore C. Mycelium D. Fermentation圖1 內(nèi)生真菌zs-14的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of endophytic fungi zs-14

2.2 平榛內(nèi)生真菌zs-14分子鑒定

液氮研磨法提取內(nèi)生真菌zs-14的DNA結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，其基因組分子量大小在20 kbp左右，且條帶清晰，符合作為PCR擴增的模板(圖2)。

Marker：分子量標(biāo)記，ck：陰性對照，zs-14：基因組DNA圖2 內(nèi)生真菌zs-14的基因組DNA電泳圖Fig.2 Genomic DNA electrophoresis of endophytic fungi zs-14

zs-14的ITS區(qū)經(jīng)引物V9D和LS266擴增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物在1 000 bp左右出現(xiàn)特異性條帶(圖3)，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序得到898 bp的DNA序列。

Marker：分子量標(biāo)記，ck：陰性對照，zs-14：擴增產(chǎn)物圖3 內(nèi)生真菌zs-14的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplified products of endophytic fungi zs-14

將測得內(nèi)生真菌zs-14的擴增產(chǎn)物序列，直接通過NCBI中的Blast進行序列比對，比對后，選取與內(nèi)生真菌zs-14最相近的序列，并用MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，在進化樹中，內(nèi)生真菌zs-14與KF367493聚類在同一分支，親緣關(guān)系表現(xiàn)為最為相近，且同源性達到99%(圖4)。同時，結(jié)合zs-14的形態(tài)學(xué)特征，最終將該菌株鑒定為Phomasp.(莖點霉屬)。

2.3 平榛內(nèi)生真菌zs-14的抑菌活性

紙片擴散法檢測內(nèi)生真菌zs-14的發(fā)酵液、石油醚、乙酸乙酯及水飽和正丁醇的萃取部位對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及白色念珠菌的抑菌活性，結(jié)果如圖5所示。

結(jié)果顯示，zs-14的發(fā)酵液只針對金黃色葡萄球菌有抑制作用，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及白色念珠菌無明顯抑制作用(表1)。

圖4 內(nèi)生真菌ZS-14的ITS系統(tǒng)進化樹Fig.4 ITS phylogenetic tree of endophytic fungi zs-14

A.zs-14正丁醇萃取物B.青霉素對照C.陰性對照D.zs-14發(fā)酵液A. N-butanol extract of zs-14 B. Penicillin control C. Negative control D. Fermentation broth of zs-14圖5 內(nèi)生真菌zs-14對金黃色葡萄球菌的抑制活性Fig.5 Inhibitory activity of endophytic fungi zs-14 against Staphylococcus aureus

進一步研究發(fā)現(xiàn)，zs-14的發(fā)酵液的正丁醇萃取部位對金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及白色念珠菌無明顯抑制作用，而石油醚和乙酸乙酯萃取部位則無抑菌作用(表1)。

表1內(nèi)生真菌zs-14對不同供試菌株的抑菌圈半徑/mm

Table1 Radius of bacteriostatic zone of endophytic fungi zs-14 for different tested strains

菌株Strain發(fā)酵液Fermentation broth石油醚Petroleum ether乙酸乙酯Ethyl acetate正丁醇N-butanol青霉素Penicillin大腸桿菌----5.1金黃色葡萄球菌1.0--2.06.2枯草芽孢桿菌----4.7白色念珠菌-----

注：“-”為無抑菌效果。

Note：“-” represented no antiseptic effect.

3 討論與結(jié)論

研究表明，大多藥用植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有抑菌的活性。近年來有關(guān)篩選抑菌活性的內(nèi)生真菌的報道逐漸增多。杜曉娜等[14]從南海指海綿上的共附生真菌中篩選得到3種(6株)對金黃色葡萄球菌有抑菌活性的真菌菌株，趙名君等[15]從葉底珠中分離得到41株內(nèi)生真菌，其中，篩選出兩株具有較強抑制白色念珠菌的活性，金宏杰[16]等從龍腦樟樹葉中分離得到的39株內(nèi)生真菌中篩選出7株具有對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌較強抑制活性的菌株?？梢?，通過研究植物內(nèi)生真菌抑菌活性為抑菌藥物的研發(fā)開辟了新的路徑。

本研究首次從榛樹莖條中分離得到內(nèi)生真菌zs-14，并采用形態(tài)學(xué)及分子鑒定方法將其鑒定為Phomasp(莖點霉菌)。研究報道，莖點霉菌可被作為防治雙子葉雜草的微生物除劑，對車前、車軸草和雞眼草表現(xiàn)較為敏感[17]。此外，Palak等從洋甘草中分離得到的Phomasp.(莖點霉菌)能夠產(chǎn)生抑制金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌生長的生物堿成分Thiodiketopiperazine[18]。作為本研究從榛樹莖條中分離得到的Phomasp.(zs-14)同樣具有抑菌活性，且具有選擇性，只針對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為抑制活性，抑菌圈半徑為1.0 mm，進一步篩選確定了zs-14的抑菌有效部位為發(fā)酵液的正丁醇萃取部位，抑菌圈半徑為2.0 mm。另有研究學(xué)者相繼從尖瓣海蓮葉內(nèi)生真菌Penicilliumsp. B21發(fā)酵液中獲得揮發(fā)油成分，并發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油在20 mg·L-1時，對大腸埃希菌和白色葡萄球菌表現(xiàn)為良好抑菌活性[19]，從紫蘇內(nèi)生真菌Penicilliumsp. 12Y25的發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物中發(fā)現(xiàn)麥角甾醇類成分對番茄灰霉菌和西瓜枯萎菌表現(xiàn)為中等強度的抑制活性[20]。

總之，榛樹莖中存在內(nèi)生真菌，且經(jīng)分離鑒定得到的內(nèi)生真菌的發(fā)酵液具有抑制金黃色葡萄球菌生長的活性。下一步，將針對zs-14抑制金黃色葡萄球菌生長的有效部位進行深入的成分分離鑒定研究，從而從榛樹內(nèi)生真菌zs-14中篩選出具有抑制金黃色葡萄球菌活性的單體化合物。