野生艾蒿內(nèi)生菌的分離及其拮抗活性菌的篩選

冀玉良，肖一桐，王明迪

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

植物內(nèi)生菌是在植物生活史的一定階段或全部階段存在于其各種組織、器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的微生物。植物內(nèi)生菌是一個(gè)十分豐富的類群，許多植物內(nèi)生細(xì)菌、真菌及放線菌對(duì)植物病原菌都有拮抗作用，它們的防病機(jī)理主要表現(xiàn)在通過產(chǎn)生抗生素類、水解酶類、分泌植物生長調(diào)節(jié)劑和生物堿類物，與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)或生存空間，增強(qiáng)宿主植物的抵抗力以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等途徑抑制病原菌生長繁殖[1-2]，植物內(nèi)生菌已經(jīng)成為開發(fā)生防農(nóng)藥不可忽視的資源。另外在長期與植物的協(xié)同進(jìn)化中，通過基因的橫向轉(zhuǎn)移，內(nèi)生菌還形成了與植物部分相同的代謝途徑，參加植物次生活性物質(zhì)的積累[3-5]，因此，植物內(nèi)生菌也是天然活性物質(zhì)的來源之一，藥用植物內(nèi)生菌有望在醫(yī)藥開發(fā)上作為發(fā)酵生產(chǎn)菌生產(chǎn)植物的藥用成分。

野生艾蒿（Artemisia Argyi）是一種菊科蒿屬多年生草本植物，也是傳統(tǒng)的中藥之一，其主要化學(xué)成分為揮發(fā)油類、黃酮類、桉葉烷類和三萜類等化合物，艾蒿中的黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、抗癌和抑菌等多種生物活性[6]。國內(nèi)外的研究表明，植物不同，從其組織中所分離到的內(nèi)生菌的種類和數(shù)量不同，即使是同一種植物，因其所處的生境、氣候特點(diǎn)、地理位置等因素的差異，從其組織器官中分離到的內(nèi)生菌也會(huì)不同[7-9]。雖然徐亞軍等[10]對(duì)河南商丘地區(qū)野生艾蒿內(nèi)生菌的研究已有報(bào)道，但對(duì)氣候和地理位置比較獨(dú)特、藥用植物道地性極為突出的商洛地區(qū)的艾蒿內(nèi)生菌，目前尚未有研究報(bào)道。本研究從商洛野生艾蒿組織器官中分離內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌，并從中篩選出具有拮抗活性的菌株，旨在為醫(yī)藥生產(chǎn)、植物病蟲害的防治和生物農(nóng)藥的研發(fā)提供有應(yīng)用價(jià)值的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物

新鮮無病害野生艾蒿整體植株，于2019 年4 月27 日采自陜西省商洛市商州區(qū)金鳳山，采樣后裝入保鮮袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，避光保存于4 ℃冰箱，2 d 內(nèi)樣品處理完畢。

1.1.2 供試指示菌

本研究的供試指示菌購自陜西省微生物研究所，供試細(xì)菌依次是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus），枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis），大腸桿菌（Escherichia Coli）；供試植物病原菌依次是棉花枯萎病菌（Fusarium Oxysporum），茄病鐮孢霉（Fusarium Solani），煙草赤星病菌（Alternaria Alternata）。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）牛肉膏蛋白胨固體分離培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨 10 g、NaCl 5 g、瓊脂 18 g、蒸餾水 1 000 mL、pH7.4～7.6；2）牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（不加瓊脂）；3）PDA 固體分離培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 18 g、蒸餾水 1 000 mL、pH7.0 左右；4）PDA 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.2 艾蒿內(nèi)生菌的分離

1.2.1 艾蒿內(nèi)生細(xì)菌的分離

艾蒿內(nèi)生細(xì)菌分離采用組織塊法[11]。將采集來的新鮮艾蒿用自來水沖洗干凈、晾干后剪成大小合適的組織塊，在超凈工作臺(tái)中紫外滅菌20 min，然后在75%乙醇中浸泡1～2 min，無菌水沖洗5 次；0.1%升汞中浸泡1～3 min，無菌水沖洗5 次。

用滅過菌的解剖刀將上述滅菌后的大塊組織按根、莖切去外皮后橫切為0.5 cm 的小塊，葉切為0.5 cm 的小片，用滅過菌的鑷子分別將根、莖靠內(nèi)側(cè)切面和葉片貼向培養(yǎng)基接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，每皿4 塊，接種后的培養(yǎng)基置入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 d。待接種組織塊與培養(yǎng)基接種面邊緣有菌落出現(xiàn)時(shí)，挑取位置、大小和形狀等不同的單菌落，用平行劃線法接入新鮮培養(yǎng)基，于28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，待長出新菌落后，根據(jù)菌落形態(tài)與顏色的不同，再次挑取菌落進(jìn)行純化，反復(fù)純化至單一菌種保存于4 ℃冰箱備用。

為了判斷組織塊表面消毒是否徹底，分別取最后一次沖洗組織塊的沖洗液0.5 mL 涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，并于相同條件下培養(yǎng)作為對(duì)照。若無菌落長出則表明消毒徹底，否則分離到菌株不能證明是內(nèi)生菌，棄之不用。

1.2.2 艾蒿內(nèi)生真菌的分離

艾蒿內(nèi)生真菌的分離基本同內(nèi)生細(xì)菌。所不同的是，組織塊接種于PDA 培養(yǎng)基上，對(duì)照組沖洗液也涂布于PDA 培養(yǎng)基。待培養(yǎng)后接種面邊緣有菌絲長出時(shí)，用尖端菌絲挑取法[12]挑取位置、顏色和形態(tài)不同的單菌絲接種于新鮮PDA培養(yǎng)基，反復(fù)純化得到單一菌株。

1.3 內(nèi)生菌在艾蒿中的分布統(tǒng)計(jì)

分別統(tǒng)計(jì)總組織塊數(shù)、分離到菌株的組織塊數(shù)、每個(gè)組織塊中分離到的菌株數(shù)、每組組織塊中分離到的菌株數(shù)、總分離到的菌株數(shù)。分別計(jì)算定殖率、分離率[13]：

定殖率=分離出菌株的組織塊數(shù)/總組織塊數(shù)

分離率=每組組織塊中分離到的菌株數(shù)/總分離到的菌株數(shù)

1.4 分離內(nèi)生菌的形態(tài)學(xué)觀察

將分離純化得到的內(nèi)生細(xì)菌接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)4～6 d 后，用肉眼觀察菌落的形態(tài)、大小、顏色、透明程度、邊緣和突起等特征。通過革蘭氏染色，在油鏡下觀察細(xì)菌的形狀和特征。

1.5 拮抗性內(nèi)生細(xì)菌的篩選

拮抗性內(nèi)生細(xì)菌的篩選采用紙片法[14]：內(nèi)生細(xì)菌接種于100 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶振蕩培養(yǎng)4 d，制得發(fā)酵液。靶標(biāo)菌（金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌）接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面上培養(yǎng)后制成菌懸液，取0.1 mL 菌懸液涂布于牛肉膏蛋白胨平板中制成含菌平板。用無菌鑷子將濾紙片浸入內(nèi)生菌發(fā)酵液中，取出并在瓶內(nèi)壁除去多余的菌懸液，將紙片放到接好靶標(biāo)菌的平板上，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，以無菌水代替發(fā)酵液浸泡濾紙片作對(duì)照，在28 ℃培養(yǎng)48～72 h 后，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈大小，計(jì)算抑菌帶寬度：

抑菌帶寬度=（抑菌圈直徑-測(cè)量菌直徑）/2。

1.6 拮抗性內(nèi)生真菌的篩選

拮抗性內(nèi)生真菌的篩選采用菌餅對(duì)峙法[15]。在無菌條件下，打取病原菌菌餅接于PDA 平板培養(yǎng)基中央，另打取內(nèi)生真菌菌餅接種于PDA 培養(yǎng)基平板距中央2.5 cm 處，以只接病原菌菌餅于平板中央為對(duì)照，在28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d 后，測(cè)量對(duì)照菌落和處理菌落直徑，并計(jì)算抑菌率：

抑菌率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 野生艾蒿內(nèi)生菌的分離結(jié)果

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上共接種81 個(gè)組織塊，其中根組織塊34 個(gè)、莖組織塊29 個(gè)、葉組織塊18 個(gè)；分離到內(nèi)生細(xì)菌35 株，其中在野生艾蒿根中分離到18 株，莖中分離到15 株，葉中分離到2 株；根莖葉內(nèi)生細(xì)菌的定殖率、分離率見表1。

表1 野生艾蒿內(nèi)生細(xì)菌的定殖率、分離率

從表1 中可以看出，野生艾蒿內(nèi)生細(xì)菌在根中的定殖率、分離率分別是41.18%和51.43%，在莖中的定殖率、分離率分別是31.03%和42.56%，在葉中的定殖率、分離率分別是11.11%和5.71%。從定殖率與分離率來看，野生艾蒿根和莖中內(nèi)生細(xì)菌含量較為豐富，這與任慧爽等[11]對(duì)桑樹內(nèi)生細(xì)菌多樣性及內(nèi)生拮抗活性菌群的研究結(jié)果基本一致。

本研究在PDA 平板上共接種69 個(gè)組織塊，其中來自根組織塊22 個(gè)，莖組織塊24 個(gè)，葉組織塊23 個(gè)；分離到內(nèi)生真菌共19 株，其中在野生艾蒿根中分離到12 株，莖中分離到7 株，葉中未分離到內(nèi)生真菌；根莖葉中內(nèi)生真菌的定殖率、分離率見表2。

表2 野生艾蒿內(nèi)生真菌的定殖率和分離率

從表2 中可以看出，野生艾蒿內(nèi)生真菌在根中的定殖率、分離率分別是36.36%和63.16%，在莖中的定殖率、分離率分別是16.67%和36.84%，在葉中的定殖率、分離率均為0。說明商洛野生艾蒿內(nèi)生真菌主要分布在根和莖中，并且野生艾蒿根中的內(nèi)生真菌含量高出莖中近2 倍。

分離的內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌在野生艾蒿中的分布情況和菌株編號(hào)，分別見表3 和表4。

表3 野生艾蒿內(nèi)生細(xì)菌的分布

表4 野生艾蒿內(nèi)生真菌的分布

從表3、表4 分別可以看出，野生艾蒿中內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌在不同部位的分布表現(xiàn)既差異又相似的規(guī)律。內(nèi)生細(xì)菌在艾蒿的根、莖和葉中分布比例分別為51.43%、42.56%和5.71%；內(nèi)生真菌在艾蒿的根、莖和葉中分布比例分別為63.16%、36.84%和0，從中可以看出，商洛野生艾蒿植物中內(nèi)生細(xì)菌、真菌的數(shù)量分布均表現(xiàn)為根中最高，莖中次之，葉中最少。

2.2 分離菌株形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)分離獲得的35 株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了菌落形態(tài)、革蘭氏染色、菌株個(gè)體形態(tài)鑒定，結(jié)果見表5。

表5 內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)特征

2.3 拮抗性內(nèi)生菌篩選

2.3.1 拮抗性內(nèi)生細(xì)菌

采用紙片法，以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌為供試靶標(biāo)菌，經(jīng)反復(fù)篩選，得到4 株具有明顯拮抗性的內(nèi)生細(xì)菌，其中BS-6 和BR-6 菌株對(duì)枯草芽孢桿菌具有拮抗性；BR-9和BS-12 菌株對(duì)大腸桿菌具有拮抗性。

圖1 是將枯草芽孢桿菌稀釋涂布于A、B 平板中，a 為用無菌水浸過的濾紙片，b 為用含BS-6的菌懸液浸過的濾紙片，c 為用含BR-6 的菌懸液浸過的濾紙片，與對(duì)照相比可以看出，b、c 均有明顯的抑菌圈，c 的抑菌圈更大，說明BS-6 和BR-6 菌株對(duì)枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)拮抗作用。抑菌帶寬度分別為 0.81±0.1 cm 和 1.64±0.1 cm（表 6）。

圖2 是將大腸桿菌稀釋涂布于A、B 平板中，a 為用無菌水浸過的濾紙片，b 為用含BR-9的菌懸液浸過的濾紙片，c 為用含BS-12 的菌懸液浸過的濾紙片，與對(duì)照相比可以看出，B 平板中的b、c 均有明顯的抑菌圈，說明兩者對(duì)大腸桿菌均有拮抗作用，抑菌帶寬度分別為0.93±0.1 cm和 0.86±0.1 cm（表7）。

圖1 BS-6和BR-6 菌株對(duì)枯草芽孢桿菌的拮抗作用

圖2 BR-9 和BS-12 菌株對(duì)大腸桿菌的拮抗作用

表6 BS-6 和BR-6 菌株對(duì)枯草芽孢桿菌的拮抗性效果

表7 BR-9 和BS-12 菌株對(duì)大腸桿菌的拮抗性效果

2.3.2 拮抗性內(nèi)生真菌的篩選

采用平板兩點(diǎn)對(duì)峙法，以棉花枯萎病、煙草赤星病、茄病鐮孢霉為病原菌，對(duì)分離到的19 株內(nèi)生真菌進(jìn)行病原菌抗性篩選。結(jié)果表明，有2 株內(nèi)生真菌有拮抗性，其中FR-4 菌株對(duì)茄病鐮孢霉具有拮抗性，但對(duì)棉花枯萎病菌和煙草赤星病菌無拮抗性。FS-8 菌株對(duì)棉花枯萎病菌具有拮抗性，但對(duì)茄病鐮孢霉和煙草赤星病菌無拮抗性。

圖3 中將含茄病鐮孢霉的菌餅置于A、B 平板a 的位置，含F(xiàn)R-4 菌株的菌餅置于B 平板b的位置，培養(yǎng)一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，A 圖的茄病鐮孢霉生長良好，而從B 圖可以明顯的看出茄病鐮孢霉的菌絲生長受到FR-4 菌株的抑制，產(chǎn)生了月牙形狀，分別測(cè)定對(duì)照菌落直徑、處理菌落直徑，計(jì)算出FR-4 菌株對(duì)茄病鐮孢霉的抑菌率達(dá)38.61%（表8），表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗作用。

圖3 FR-4 菌株對(duì)茄病鐮孢霉的拮抗性作用

圖4 中將棉花枯萎病菌的菌餅置于A、B 平板a 的位置，含F(xiàn)S-8 菌株的菌餅置于B 平板b的位置，培養(yǎng)一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，A 圖的棉花枯萎病菌生長良好，而B 圖的棉花枯萎病菌的菌絲擴(kuò)展受到FS-8 菌株的抑制，使得棉花枯萎病菌的右側(cè)區(qū)域凹陷進(jìn)去，不再向四周擴(kuò)展。測(cè)出FS-8菌株對(duì)棉花枯萎病菌的抑菌率為31.34%（表 8）。

圖4 FS-8 菌株對(duì)棉花枯萎病菌的拮抗性作用

表8 FR-4 和FS-8 菌株對(duì)植物病原菌的抗菌效果

3 結(jié)論與討論

本研究從商洛野生艾蒿根、莖、葉中共分離到54 株內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細(xì)菌35 株，內(nèi)生真菌19 株，分離到的內(nèi)生細(xì)菌、真菌的含量分布均表現(xiàn)為：根部最多，莖中次之，葉部最少。以金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，大腸桿菌為指示菌對(duì)分離內(nèi)生細(xì)菌的拮抗性進(jìn)行了測(cè)定，篩選得到4株具有明顯抗菌作用的菌株，分別是菌株BS-6和BR-6 對(duì)枯草芽孢桿菌具有明顯的抗菌作用，抑菌圈直徑分別為 2.34±0.1 cm 和 4.10±0.1 cm。菌株BR-9 和BS-12 對(duì)大腸桿菌的抑菌效果均較明顯，抑菌圈直徑分別為2.60±0.1 cm 和2.41±0.1 cm；以棉花枯萎病菌，茄病鐮孢霉，煙草赤星病菌為供試植物病原菌，對(duì)分離的內(nèi)生真菌的拮抗性進(jìn)行了測(cè)定，篩選得到2 株具有明顯抗菌作用的菌株，分別是FR-4 菌株對(duì)茄病鐮孢霉具明顯的拮抗作用，抑菌率達(dá)38.61%，F(xiàn)S-8 菌株對(duì)棉花枯萎病菌具有明顯的拮抗作用，抑菌率為31.34%。這表明內(nèi)生菌在野生艾蒿中分布比較豐富，具有拮抗活性的菌株比例和拮抗活性都比較高。

內(nèi)生菌普遍存在于植物組織中，但從不同植物體內(nèi)分離得到的內(nèi)生菌數(shù)量和種類有所差異，即使是同一種植物，也會(huì)因生境、品種和年齡等的不同而分離出不同數(shù)量和種類的內(nèi)生菌。如徐亞軍等[10]從河南商丘地區(qū)野生艾蒿的根莖葉部位分離出內(nèi)生細(xì)菌共68 株，篩選獲得對(duì)病原菌抑制效果最明顯的3 株菌并對(duì)其進(jìn)行了分子水平的分類和鑒定。馬長樂等[16]從云南榧的新鮮莖與葉中分離得到10 株內(nèi)生真菌和5 株內(nèi)生放線菌，發(fā)現(xiàn)2 株內(nèi)生真菌和2 株內(nèi)生放線菌對(duì)植物病原菌均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑菌活性。杜曉寧等[17]從寧夏枸杞各藥用組織器官中分離出內(nèi)生細(xì)菌34 株，隸屬于 7 科 11 屬，內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量和群落組成存在明顯的組織特異性，且遺傳多樣性豐富，對(duì)植物病原菌有較強(qiáng)的抑制活性。從不同植物不同環(huán)境下分離到的內(nèi)生菌數(shù)量、類型和拮抗性大小不同，正說明了植物內(nèi)生菌是一個(gè)極其豐富的群體，其中蘊(yùn)藏著對(duì)人類有用的各種功能性菌種資源，值得人們進(jìn)行廣泛的研究開發(fā)。

根據(jù)現(xiàn)有的研究，內(nèi)生菌寄生于植物中與植物之間形成了一種協(xié)同進(jìn)化、互惠互利的關(guān)系[18-19]，對(duì)于藥用植物而言，內(nèi)生菌對(duì)植物的作用表現(xiàn)為三個(gè)方面，其一可能通過分泌生長素，促進(jìn)植物的生長；二是參與植物有效活性成分合成的部分代謝，有利于藥用植物活性成分的積累；三是寄生于植物組織中抑制植物病原菌，防止病原菌侵染和病蟲害的發(fā)生[20]。艾蒿是傳統(tǒng)的中藥材，具有活血通絡(luò)止疼、抗菌消炎驅(qū)蟲等功效。醫(yī)學(xué)和中藥材抗菌試驗(yàn)中一般通用的指示菌為金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌，本研究中分離到的拮抗性內(nèi)生細(xì)菌具體的抑菌機(jī)理雖然還有待深入研究，但推測(cè)可能與艾蒿有效成分對(duì)指示菌的抑菌作用機(jī)理有共同之處。如果是一樣的，分離到的內(nèi)生細(xì)菌可能還可以作為醫(yī)藥的生產(chǎn)菌種用于工業(yè)發(fā)酵中生產(chǎn)艾蒿活性物質(zhì)。

關(guān)于內(nèi)生菌在防治植物病原菌侵害方面的研究，以前都廣泛集中于內(nèi)生真菌對(duì)植物病原菌的抵抗方面，近幾年有不少內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物病原菌抑制作用的研究。由于植物病原菌大多數(shù)為真菌，內(nèi)生細(xì)菌一般是通過分泌抑菌物質(zhì)對(duì)植物病原菌產(chǎn)生抑制的，而內(nèi)生真菌對(duì)植物病原菌的抑制除可能分泌某種抑菌物質(zhì)外，主要是通過空間占位、營養(yǎng)競爭和溶解菌絲等達(dá)到對(duì)病原菌抵抗的。本研究篩選到的2 株內(nèi)生真菌抵抗植物病原菌作用明顯，F(xiàn)R-4 菌株對(duì)茄病鐮孢霉抑菌率達(dá)38.61%，F(xiàn)S-8 菌株對(duì)棉花枯萎病菌的抑菌率為31.34%，2 株菌都有作為生防菌種應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的潛力。

本研究對(duì)分離的內(nèi)生真菌未進(jìn)行鑒定，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌只從形態(tài)上作了初步鑒定，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌和真菌的抑菌作用機(jī)理也只從抑菌現(xiàn)象上進(jìn)行了分析，對(duì)分離的內(nèi)生細(xì)菌是否對(duì)植物病原菌也有拮抗作用未進(jìn)行測(cè)定，下一步將研究內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物病原菌的拮抗作用，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及細(xì)菌16S rRNA 序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析確定篩選到的拮抗內(nèi)生菌的具體種屬類型[21]，并提取和分析內(nèi)生菌產(chǎn)生的拮抗性代謝物質(zhì)，深入研究其拮抗作用。