生物表面活性劑槐糖脂研究概況

蔡京榮 呂佳佳

（陽煤豐喜泉稷能源有限公司，山西稷山，043200）

槐糖脂（sophorolipid）是一種具有可生物降解、毒性低、環(huán)境相容性好等特點(diǎn)的生物表面活性劑[1]。它首次發(fā)現(xiàn)于1954年，是由Torulopsis sp產(chǎn)生的[2]。除了有較好的乳化、分散、增溶等表面特性外，槐糖脂還具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎等生物活性[3-4]。目前已在食品、醫(yī)藥、日化、冶金、環(huán)保、廢油回收等領(lǐng)域獲得應(yīng)用。

國際上對(duì)槐糖脂的有關(guān)理論和應(yīng)用的研究已開展多年，國內(nèi)雖然進(jìn)行了有關(guān)研究，但整體上仍處于起步階段。本文從化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、生產(chǎn)方法、分離和純化、主要應(yīng)用、研究現(xiàn)狀等方面對(duì)槐糖脂的研究概況進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)研究提供借鑒。

1 槐糖脂的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

1.1 化學(xué)結(jié)構(gòu)

由微生物代謝產(chǎn)生的槐糖脂一般是由一系列槐糖脂分子組成的混合物，這些槐糖脂分子均包含親水基和疏水基，親水基是由兩分子葡萄糖以β-1,2糖苷鍵結(jié)合而成的槐糖，疏水基為飽和或不飽和長鏈ω-（或ω-1）羥基脂肪酸，親水基和疏水基以β-糖苷鍵連接，這些槐糖脂依其是否存在內(nèi)酯化，可分為內(nèi)酯型和酸型[5]。

1.2 槐糖脂的性質(zhì)

1.2.1 理化性質(zhì)

槐糖脂臨界膠束濃度為11～250 mg/L，表面活性較強(qiáng)，可將水的表面張力從72.8 mN/m降至30-40 mN/m。當(dāng)pH≤5.0時(shí)呈膠態(tài)分布；當(dāng)pH 5.6～5.8時(shí)溶解度最高；當(dāng)pH≈6.0時(shí)，可完全溶解于水；當(dāng)pH≥7.0時(shí)，乙?；王ユI發(fā)生不可逆水解。一般來說，內(nèi)酯型槐糖脂的親脂性較高，具有降低液體表面張力的能力，酸型槐糖脂的水溶性較好，發(fā)泡能力較強(qiáng)[6]。

圖1 內(nèi)酯型槐糖脂結(jié)構(gòu)式

研究表明：槐糖脂脂肪酸碳鏈的長度越長，其表面活性和生物可降解性越高，CMC值越小。Zhang等[7]將一系列槐糖脂烷基酯的表面活性和降解性進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明：槐糖脂烷基酯脂肪酸碳鏈每增加一個(gè)-CH2，其CMC值降低50%，而生物可降解性隨之增加。隨后，Shin等[8]發(fā)現(xiàn)槐糖脂脂肪酸碳鏈為油酸（C18）的槐糖脂甲酯比脂肪酸碳鏈為芥酸（C22）的槐糖脂甲酯更難降解。

1.2.2 生物活性

槐糖脂具有抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒和抗炎等生物活性。

胡靜等[9]分別以豆油和葡萄糖為底物，發(fā)酵制得槐糖脂，研究了槐糖脂對(duì)人宮頸癌細(xì)胞的抑制作用，發(fā)現(xiàn)不同底物發(fā)酵制得的槐糖脂對(duì)人宮頸癌細(xì)胞均有抑制作用，且細(xì)胞存活率隨槐糖脂濃度的增加均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，以葡萄糖為底物制備的槐糖脂質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)的體外抑瘤率可達(dá)87.4%，以豆油為底物的槐糖脂濃度達(dá)到500 μg/mL時(shí)的體外抑瘤率為71.1%。

圖2 酸型槐糖脂結(jié)構(gòu)式

Kim等[10]發(fā)現(xiàn)內(nèi)酯型槐糖脂對(duì)部分引起泌尿系統(tǒng)感染、胃腸道感染的革蘭氏陰性菌及引起新生兒腦膜炎的鏈球菌，均表現(xiàn)出優(yōu)良的抑制作用，當(dāng)其濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí)，對(duì)致病性革蘭氏陰性菌的致死率可達(dá)到100%。

袁兵兵等[11]對(duì)槐糖脂的抑真菌性能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了槐糖脂對(duì)水果有保鮮作用，經(jīng)過槐糖脂涂抹的水果失重率明顯降低，且表皮可保持光澤不起褶皺，從而，有望開發(fā)一款新型果蔬保鮮殺菌劑。

Bluth等[12]發(fā)現(xiàn)槐糖脂可通過抑制動(dòng)物體內(nèi)敗血癥病毒的增殖，減少生物敗血癥病毒性休克，降低動(dòng)物死亡率。

Napolitano等[13]對(duì)患有敗血癥的小鼠，通過靜脈注射槐糖脂，明顯提高了小鼠存活率。他認(rèn)為是槐糖脂加速了巨噬細(xì)胞的衰減，抑制了炎癥的發(fā)展與擴(kuò)散。

2 槐糖脂的生產(chǎn)、分離提純方法

2.1 槐糖脂的主要生產(chǎn)菌種

目前槐糖脂主要采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，科學(xué)家們于20世紀(jì)60-70年代，經(jīng)過篩選、鑒定，得到Torulopsis magnolia（現(xiàn)稱為Candida apicola）、Torulopsis gropengiesseri、Trulopsis bobmbicola及Candidabogoriensis等槐糖脂產(chǎn)生菌[14]。近幾十年，有關(guān)研究者又逐步篩選出Wickerhamiella domercqiae、Pichia anomala、Candida batistae、Candida riodocensis、Candida stellata和Candida sp.Y-27208等新的產(chǎn)生菌[15]。

槐糖脂的產(chǎn)生菌主要為各種非致病性酵母菌，除Rhodotorula bogoriensis為擔(dān)子菌外，多為子囊菌，其不同物種的親緣關(guān)系見圖3。其中Candida bombicola的應(yīng)用最廣泛。

2.2 槐糖脂的生物合成途徑

圖3 槐糖脂產(chǎn)生菌和非槐糖脂產(chǎn)生菌的系統(tǒng)樹

在槐糖脂的微生物合成過程中，涉及的關(guān)鍵酶主要有細(xì)胞色素P450[16]、兩種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶[17]、乙?；D(zhuǎn)移酶[18]、內(nèi)酯化酶[19]和一種輸送酶[20]。

根據(jù)碳源的不同，槐糖脂的生物合成途徑也不同，但均需要活化后的葡萄糖和一種普通的脂肪酸。

2.2.1 以葡萄糖和脂肪酸為復(fù)合碳源

部分葡萄糖經(jīng)糖酵解，分解為丙酮酸，然后在丙酮酸脫羧酶的作用下生成乙酰CoA，乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為菌體提供生長代謝能量。脂肪酸在單加氧酶細(xì)胞色素P450的作用下生成ω-/ω-l羥基脂肪酸，在葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶I的作用下，將一個(gè)葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到ω-/ω-l羥基脂肪酸，生成葡萄糖脂；在萄糖基轉(zhuǎn)移酶II的作用下將另一個(gè)葡糖分子轉(zhuǎn)移到葡萄糖上，生成槐糖脂；在乙酰轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)酯化酶的作用下生成乙酰化的內(nèi)酯型槐糖脂[21]。

2.2.2 以烴類物質(zhì)或脂肪酸為唯一碳源

圖4 以葡萄糖和脂肪酸為復(fù)合碳源時(shí)槐糖脂的合成途徑

在脂肪酸脫氫酶或脂肪醇氧化酶的作用下，烴類物質(zhì)變成脂肪酸，部分脂肪酸經(jīng)氧化生成乙酰CoA，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞生長和代謝提供能量；三羧酸循環(huán)過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物通過糖異生途徑生成葡萄糖。部分脂肪酸在單加氧酶細(xì)胞色素Cyt P450的作用下生成ω-/ω-1羥基脂肪酸，由葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶I催化，將一個(gè)葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到ω-/ω-1羥基脂肪酸，生成葡萄糖脂；在葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶II的作用下將另一個(gè)葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到葡萄糖脂上生成槐糖脂；最后由乙?；D(zhuǎn)移酶和內(nèi)酯化酶催化，生成乙?；乃嵝?內(nèi)酯型槐糖脂[22]。

2.2.3 以葡萄糖為唯一碳源

葡萄糖經(jīng)EMP途徑分解為丙酮酸，其中一部分通過糖異生途徑生成新的葡萄糖分子；另一部分在丙酮酸脫羧酶的作用下，生成乙酰CoA，部分乙酰CoA進(jìn)入TCA循環(huán)，為菌體的生長代謝提供能量，部分通過從頭合成途徑合成脂肪酸。新合成的脂肪酸在單加氧酶細(xì)胞色素Cyt P450的作用下生成ω-/ω-1羥基脂肪酸，由葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶I催化，將一個(gè)葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到ω-/ω-1羥基脂肪酸，生成葡萄糖脂；在葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶II的作用下將另一個(gè)葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到葡萄糖脂上生成槐糖脂；最后由乙酰轉(zhuǎn)移酶或內(nèi)酯化酶催化，生成乙?；乃嵝突騼?nèi)酯型槐糖脂[23]。

2.4 槐糖脂的分離純化

依據(jù)最終產(chǎn)物純度的差異，可以把槐糖脂純化過程分為粗提、中度純化和精細(xì)純化三個(gè)階段。常用的純化方法有凝膠過濾層析和薄層層析[24]。

圖5 以烴類物質(zhì)或脂肪酸為唯一碳源時(shí)槐糖脂的合成途徑

硅膠柱層析法是根據(jù)硅膠對(duì)被分離物質(zhì)的吸附力的不同而得到分離純化，吸附力的強(qiáng)弱是由被分離物質(zhì)極性大小而定。一般情況下，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附。被分離物質(zhì)的整個(gè)層析過程包括：吸附、解吸、再吸附、再解吸的過程。

凝膠過濾層析法又名排阻層析或者分子篩方法，依據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，通過在層析柱中填充某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)進(jìn)行分離，從而對(duì)蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。

硅膠層析法是依據(jù)硅膠和各種不同物質(zhì)之間吸附力的不同而能夠?qū)⒉煌镔|(zhì)分離開來。

薄層層析又名薄層色譜，屬于色譜法的一個(gè)種類，通過固-液吸附色譜從而快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，同時(shí)具備了柱色譜和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)。

3 槐糖脂的主要應(yīng)用

3.1 食品工業(yè)

槐糖脂不僅具有乳化、增稠、潤滑等特性，而且無臭、無味、無毒、對(duì)人體無害，因此，可以作為食品添加劑用來改善食品的口味和品質(zhì)。此外，還有報(bào)道在冷藏運(yùn)輸過程中，用于防止形成冰粒子。

3.2 石油工業(yè)

Beckman1926年首先提出的用微生物提高原油采收率的設(shè)想，被稱為最有發(fā)展前景的一項(xiàng)采油技術(shù)。生物表面活性劑可以很容易地溶解在地層水和注入水中，在油-水界面上發(fā)揮其較高的表面活性。研究表明：生物表面活性劑的驅(qū)油效率比人工合成的表面活性劑的驅(qū)油效率高3.5～8倍[25]。

德國學(xué)者將酵母菌生產(chǎn)的槐糖脂發(fā)酵液用于室內(nèi)驅(qū)油實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它具有較強(qiáng)的驅(qū)油能力，不加助表面活性劑時(shí)石油采收率便能達(dá)到87%。國內(nèi)學(xué)者篩選出的一種耐鹽3%～5%、耐溫40～80℃的糖脂類表面活性劑，在與多糖、槐糖脂或鼠李糖脂復(fù)配時(shí)呈現(xiàn)“超加和”現(xiàn)象，能獲得低界面張力[26]。

3.3 環(huán)境保護(hù)

槐糖脂已被應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)中的多個(gè)方面，例如：石油污染的生物修復(fù)、從焦油中分離瀝青[27]、土壤中重金屬離子的去除[28]、水中金屬離子和烴類的去除[29]、有害藻類危害的減輕[30]等。

3.4 醫(yī)藥領(lǐng)域

很多報(bào)道均證明槐糖脂具有很好的抗菌活性、抗炎癥活性、抗腫瘤活性、抗病毒活性和殺精子活性等。這些在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，提高了槐糖脂的經(jīng)濟(jì)附加值，使槐糖脂具有良好的應(yīng)用前景。但槐糖脂的分子結(jié)構(gòu)與槐糖脂藥學(xué)活性的關(guān)系目前還不清楚[31]。

3.5 日化領(lǐng)域

法國Soliance公司推出的化妝品Sopholiance S，主要成分為槐糖脂，具有較溫和的殺菌功效，可以高效抑制痤瘡丙酸桿菌及乳酸棒桿菌，同時(shí)可以抑制脂肪酶的活性，防止皮脂分解而產(chǎn)生游離脂肪酸。另外，據(jù)很多專利報(bào)道，槐糖脂還能刺激人真皮層纖維細(xì)胞的生長和膠原蛋白的重新合成，減少皮下脂肪儲(chǔ)存，因此，可以添加到抗衰老化妝品中[32]。

另外，槐糖脂在納米技術(shù)[33]、昂貴材料[34]方面也有相關(guān)應(yīng)用報(bào)道。

4. 槐糖脂目前研究的重點(diǎn)

雖然槐糖脂具有諸多優(yōu)點(diǎn)，特別是在環(huán)境污染生物治理方面具有極其重要的作用，但其成本居高不下，限制了其廣泛應(yīng)用。目前有關(guān)研究主要是圍繞如何優(yōu)化發(fā)酵條件和提高提取純化工藝手段、如何獲取廉價(jià)的發(fā)酵生產(chǎn)材料、如何運(yùn)用生物技術(shù)手段（基因改造、基因重組、基因突變等）選育出高產(chǎn)菌株，以提高產(chǎn)量和降低成本而展開。

脂肪酸的羥基化是球擬酵母在合成槐糖脂過程中的關(guān)鍵步驟，該步驟耗氧較大，因此，在較高密度情況下發(fā)酵，溶解氧水平往往是制約菌體細(xì)胞生長和合成槐糖脂的重要因素[35]。通過調(diào)整發(fā)酵工藝可以有效提高菌體細(xì)胞外源的溶氧供給水平，如增加通氣量、加快攪拌速度、提高罐壓、提高發(fā)酵罐的徑高比等傳統(tǒng)措施，但這些對(duì)設(shè)備強(qiáng)度等要求較高，且二氧化碳分壓過高還會(huì)限制細(xì)胞的生長；另外，添加補(bǔ)料技術(shù)也是提高溶氧供給水平的重要工藝手段，且該技術(shù)對(duì)設(shè)備沒有特殊要求。

目前，見諸報(bào)道的可用于槐糖脂發(fā)酵生產(chǎn)的廉價(jià)底物有還原糖類、脂肪酸類、烴類、工業(yè)副產(chǎn)品及木質(zhì)纖維素類等。Zhou等[36]以100g/L葡萄糖、10.5% 菜籽油（體積分?jǐn)?shù)）和4g/L酵母粉為培養(yǎng)基，發(fā)酵8天，轉(zhuǎn)化率達(dá)到80%，槐糖脂的產(chǎn)量達(dá)到90～110g/L。Casas等[37]以葡萄糖和不同植物油為復(fù)合底物間歇培養(yǎng)C. bombicola，疏水性底物為葵花油時(shí)槐糖脂產(chǎn)量最高，達(dá)到11.0g/L，其次分別是橄欖油、玉米油、葡萄籽油和椰子油。Davila等[38]分別以C12、C14、C16、C18烷烴為單一碳源時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著碳原子數(shù)的增加、碳鏈的增長，則更有利于槐糖脂的合成，產(chǎn)量分別為 17.0、20.0、95.0和175.0 g/L，且C16和C18合成槐糖脂的效率更高。Kim等[39]提出以100 g/L葡萄糖和100 g/L大豆黑油為共底物，對(duì)C. bombicola進(jìn)行流加培養(yǎng)，7天后得到90.0 g/L的槐糖脂。Konishi等[40]改進(jìn)了玉米芯合成槐糖脂的工藝，降低了酸用量，獲得了43.8 g/L的產(chǎn)量。

通過基因重組手段，在槐糖脂生產(chǎn)菌株中導(dǎo)入氧的傳輸和利用基因以提高胞內(nèi)氧氣利用率，是槐糖脂生產(chǎn)菌株基因重組的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。透明顫菌血紅蛋白（VHb）在表面活性劑產(chǎn)生菌Gordonia amarae和銅綠假單胞菌重組菌株P(guān)aJC及畢赤酵母中的異源表達(dá)可明顯促進(jìn)菌株對(duì)氧的利用率。

5 結(jié)束語

作為一種最具有發(fā)展前景的生物表面活性劑，槐糖脂雖然在日化、環(huán)境、食品、醫(yī)藥方面都有應(yīng)用價(jià)值，但大都處于實(shí)驗(yàn)階段，目前制約槐糖脂廣泛應(yīng)用的主要瓶頸是其昂貴的價(jià)格，所以，今后有關(guān)研究的重點(diǎn)，將緊緊圍繞如何降低槐糖脂的成本而展開。其一是在生產(chǎn)菌株改造方面，通過誘變和基因改造，篩選出產(chǎn)量更高、遺傳性更穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株；其二是對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)工藝進(jìn)行更深層次的優(yōu)化，尤其是分離純化階段的研究，開發(fā)出適合規(guī)模化生產(chǎn)的發(fā)酵工藝；其三是拓寬廉價(jià)原材料的范圍，進(jìn)一步降低槐糖脂的生產(chǎn)成本；最后是對(duì)槐糖脂的結(jié)構(gòu)、活性及其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行更深入的研究，為槐糖脂的開發(fā)應(yīng)用創(chuàng)造更廣闊的前景。