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    木糖及氧化豬脂對熱反應產(chǎn)物滋味的影響及滋味活性肽組分分離

    2020-01-02 02:59:58王天澤杜文斌謝建春
    中國食品學報 2019年12期
    關(guān)鍵詞:解液木糖鮮味

    王天澤 杜文斌 譚 佳 趙 健 謝建春

    (食品營養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心 食品質(zhì)量與安全北京實驗室 北京工商大學 北京 100048)

    熱反應肉味香精是以蛋白酶解物為主要原料,基于肉香風味形成原理而制造的食品添加劑,已廣泛用于方便面、火腿腸、膨化食品、速凍水餃等多種食品的增香調(diào)味。蛋白酶解物中含有游離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)及還原糖等肉香前體物,以酶解物為原料制備的熱反應肉味香精,不僅具有肉的香氣,還具有肉湯的滋味[1-2]。

    迄今,有關(guān)美拉德反應和脂質(zhì)氧化在熱反應肉味香精領(lǐng)域的研究主要集中在對肉香氣形成貢獻上[3-8],如曹長春等[3]研究了“半胱氨酸-木糖”產(chǎn)生的香氣物質(zhì),其檢測到2-甲基-3-呋喃硫醇和2-糠硫醇的含量最高;Hou等[4]研究了復雜美拉德反應體系“半胱氨酸-木糖-甘氨酸”中不同初期美拉德反應中間體對肉香味形成的貢獻大小,Yang等[6]研究了添加氧化及未氧化雞脂對“半胱氨酸-葡萄糖”熱反應產(chǎn)生肉香氣的影響,靳林溪等[7]分析鑒定了“氧化雞脂-半胱氨酸”反應體系產(chǎn)生的香氣物質(zhì)。有關(guān)美拉德反應對熱反應產(chǎn)物滋味影響研究近年也開始被研究者關(guān)注[9-12],如Liu等[9]研究“雞肉肽-木糖”反應,發(fā)現(xiàn)低溫、較長時間的美拉德反應有利于反應產(chǎn)物具有肉湯的鮮味和醇厚感。Lan等[10]研究“大豆肽-木糖”美拉德反應,發(fā)現(xiàn)肽在熱反應中可發(fā)生自身降解反應和美拉德交聯(lián)反應,而發(fā)生美拉德交聯(lián)反應后,小于1 000 u肽組分中苦味氨基酸、苦味肽含量降低,1 000~5 000 u肽的含量增加。但有關(guān)脂質(zhì)氧化反應對熱反應產(chǎn)物滋味影響的研究卻鮮有報道。Azad Shah等[13]曾將青魚片酶解物與脂肪酸的反應產(chǎn)物加入日本清面湯中,發(fā)現(xiàn)該反應產(chǎn)物可顯著提升面湯的飽滿感、醇厚味、連續(xù)性。

    本文以豬肉的酶解物為原料,通過設(shè)計“酶解物”(空白)、“木糖-酶解物”、“氧化豬脂-酶解物”、“木糖-氧化豬脂-酶解物”4個熱反應體系,研究木糖、氧化豬脂添加于酶解物中對熱反應產(chǎn)物滋味的影響,并嘗試對熱反應產(chǎn)物呈味肽組分進行分離鑒定,以探討不同反應體系滋味產(chǎn)生差異的原因。本研究結(jié)果可為熱反應肉味香精制備提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    豬后腿肉,北京美廉美超市;氧化豬脂(P.V.=223 meq/kg;A.V.=0.65 mg KOH/kg),按照文獻[14]制備;復合蛋白酶、風味蛋白酶,諾維信公司;三氟乙酸(色譜純)、木糖(分析純),北京百靈威科技有限公司;乙腈(色譜純),飛世爾實驗器材有限公司;正己烷(分析純),國藥集團化學試劑有限公司;葡聚糖凝膠Sephadex G-15,美國GE Healthcare公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,河南省予華儀器有限公司;PHSJ-3F實驗室pH計,上海儀電有限公司;3-30K高速離心機,美國Sigma公司;ALPHA 2-4 LSC冷凍干燥機,德國Christ公司;MASTERFLEX蠕動泵,科爾帕默儀器有限公司;Pellicon 2 Mini超濾裝置及 1,3,5 ku 再生纖維素超濾膜,美國Millipore公司;MD-55自動液相色譜分離系統(tǒng),上海青浦滬西儀器廠;LC1200型高效液相色譜儀,美國Agilent公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 酶解液制備 肉去除可見脂肪,于90℃水漂燙3 min,絞成肉糜。將一定量的肉糜、水加入到燒瓶中(肉水比1∶1,w/w),加入0.4%的復合蛋白酶,于55℃水浴下酶解3 h;再加入0.3%的風味蛋白酶,酶解1 h;升溫至85℃,滅酶10 min。

    酶解液15 000 r/min離心10 min,取上清液,凍干,干粉加入正己烷除脂,待用。

    1.3.2 熱反應 取0.5 g除脂凍干粉,加水5 mL成酶解液,置于15 mL耐壓管中。按表1,4個反應體系 “單純酶解液”、“酶解液+氧化豬脂”、“酶解液+木糖”、“酶解液+氧化豬脂+木糖”,120℃反應1 h,感官評價。

    表1 熱反應所用原料Table1 Materials used in the thermal reactions

    1.3.3 吸光度、顏色、pH值的測定 反應液使用pH計測定。反應液先經(jīng)0.45 μm膜過濾后,用超純水稀釋到適當濃度,在波長420 nm下測定吸光度值,結(jié)果=測定值×稀釋倍數(shù)。

    色度測定參照SB/T 10323-1999進行[15]。稱取碘1.000 g、碘化鉀2 g,先將碘化鉀用少量蒸餾水溶解,再加入精確稱取的碘,全部溶解后移入100 mL容量瓶內(nèi),定容后得1%碘液;1%碘液再進一步稀釋后得到系列不同濃度的標準色液。將反應液與系列標準色液比較,其中與標準色液顏色最一致的碘液濃度,記錄為該反應液的色度值。

    1.3.4 超濾分離 熱反應液先經(jīng)0.45 μm膜過濾。使用Millipore Pellicon 2 Mini型超濾裝置和截留分子質(zhì)量(MW)為1,3,5 ku的纖維素超濾膜超濾。氮氣壓力0.02 MPa。先使用5 ku的膜,透過液再依次使用3,1 ku的膜進行分級分離,得到4個組分,分別為 MW>5 ku、MW 3~5 ku、MW 1~3 ku和MW<1 ku。各組分冷凍干燥,稱重,感官評價,備用。

    1.3.5 葡聚糖凝膠色譜分離 對超濾所得MW<1ku組分進行分離。采用自動液相色譜系統(tǒng)進行。Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱(玻璃柱,3.0 cm×60 cm),超純水洗脫,流速 1.0 mL/min,上樣 5 mL,上樣液質(zhì)量濃度100 mg/mL。紫外檢測波長220 nm。根據(jù)譜峰收集組分,凍干、稱量、感官評價。

    1.3.6 反相高效液相色譜分離 樣品為葡萄糖凝膠色譜柱分離后的呈味組分。先采用分析型色譜柱 Zorbax 300SB-C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm)建立了分析方法:流動相組成A水/三氟乙酸(1∶0.001,V/V),B 乙腈/三氟乙酸(1 ∶0.001,V/V);流速 1 mL/min;梯度洗脫,0~14 min,3→23%B;14~16 min,23→75%B;16~28 min,75→95%B。柱溫30℃;檢測波長為220 nm。然后在相同的色譜條件下,采用 Zorbax 300SB-C18(9.4 mm×250 mm,5 μm)色譜柱制備性分離收集,樣品質(zhì)量濃度10 mg/mL,進樣50 μL,重復進樣,自動餾分收集各組分、凍干、稱量、感官評價。

    1.3.7 感官評價 樣品溫度60℃,樣品質(zhì)量濃度10 mg/mL左右。品嘗醇厚感時,樣品與肉湯按1∶1(V/V)比例混合后進行品嘗。肉湯采用市場上購買的濃湯寶配制。

    評價小組包括5名人員,年齡在21~26周歲之間,其中男性2名,女性3名。描述詞包括鮮味、肉味、醇厚感、持續(xù)性。味的強度通過排序法給出,按強度遞增順序用無味、幾乎無味、弱、一般、較強、強等詞匯,表示樣品間的相對強度大小。

    1.3.8 基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)分析 委托北京大學分析中心進行。5800型MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀 (美國AB Sciex公司)。樣品為反相高效液相色譜分離收集后的組分,溶劑為超純水。使用60%的乙腈水溶液配制飽和的α-氰基-4-羥基肉桂酸(CCA)溶液作為基質(zhì),將基質(zhì)溶液與樣品1∶1混合,取1 μL點在MALDI靶板上,在室溫下自然干燥。

    一級質(zhì)譜分析:激光光源為固態(tài)激光光源,波長349 nm,脈沖加速電壓7 kV,采用正離子反射模式采集數(shù)據(jù)。采集相對分子質(zhì)量范圍:100~1 000 u。二級質(zhì)譜分析:選擇一級譜中目標母離子峰進行二級質(zhì)譜分析(MS/MS),加速電壓2 kV,采用CID碰撞裂解母離子,獲取每個母離子的離子碎片。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 熱反應產(chǎn)物基本特性比較

    4個體系熱反應產(chǎn)物的吸光度、色度值、及pH值,見表2。

    表2 熱反應產(chǎn)物基本特性比較Table2 Basic characteristics determined for the four thermal reaction products

    木糖可與酶解液中的含氨基化合物發(fā)生美拉德反應,而氧化脂肪因含有一定量的醛、酮、氫過氧化物等脂質(zhì)氧化產(chǎn)物[16-18],其也與酶解液中的含氨基化合物發(fā)生反應[19]??傊?,4個反應體系中主要反應均為“羰-胺”反應,反應產(chǎn)物的褐變程度可用420 nm吸光值或反應液的色度表示[20-23],420 nm吸光值與形成的褐變產(chǎn)物(類黑精)的含量有關(guān)[5,24],而色度與肉眼觀察的反應液顏色有關(guān),二者往往具有一致性的變化趨勢。pH與反應過程中游離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)等化合物中氨基的消耗及反應產(chǎn)物中有機酸的形成有關(guān),一般而言隨著反應進行pH呈下降趨勢[25-27]。

    由表2可知,與酶解液自身熱反應相比,加入氧化脂肪或木糖后,反應產(chǎn)物的420 nm吸光值及色度值均升高,pH均降低,但加入木糖后的變化幅度大,而加入氧化脂肪的變化幅度較小。同時加入木糖和氧化豬脂的變化與單獨加入木糖時差距不大。這些結(jié)果表明,酶解液中加入木糖發(fā)生的褐變反應程度遠大于加入氧化豬脂,氧化豬脂對反應液褐變產(chǎn)生的影響較小。

    2.2 熱反應產(chǎn)物滋味

    4個體系熱反應產(chǎn)物進行滋味評價,結(jié)果見表3。

    表3 熱反應產(chǎn)物的滋味特性Table3 Taste properties of the four thermal reaction products

    由表3可知,與“酶解液”體系相比,加入氧化豬脂后,熱反應產(chǎn)物的“鮮味”提升,“肉味”輕微提升,“醇厚感”較大提升,“持續(xù)性”顯著提升;加入木糖后,熱反應產(chǎn)物的“鮮味”和“肉味”均顯著提升,但“醇厚感”和“持續(xù)性”較小提升。氧化豬脂和木糖都加入時,熱反應產(chǎn)物 “鮮味”、“醇厚感”和“持續(xù)性”顯著提升,“肉味”較大提升。進一步比較可得出,木糖的加入更多地增強熱反應產(chǎn)物的“鮮味”、“肉味”,而氧化豬脂的加入更多地增強“醇厚味”、“持續(xù)性”。

    2.3 超濾分離及組分滋味評價

    “酶解液+氧化豬脂”、“酶解液+木糖”、“酶解液+氧化豬脂+木糖”熱反應產(chǎn)物超濾分離所得>5 ku、3~5 ku、1~3 kua和<1 ku 組分所占百分比及滋味評價結(jié)果見表4。

    表4 超濾分離所得不同分子質(zhì)量范圍組分占百分比(%)和滋味特性Table4 Percentages and taste properties of the ultra filtration fractions in different MW ranges

    由表4可以看出,3個體系均為<1 ku的組分所占百分比最多,其次是>5 ku的組分,3~5 ku和1~3 ku組分所占百分比較少。3個體系均是>5 ku、3~5 ku組分無味;1~3 ku的組分幾乎無味;而主要呈味的為<1 ku的組分。其中“酶解液+氧化豬脂”體系熱反應產(chǎn)物<1 ku的組分的醇厚感、持續(xù)性均強,“酶解液+木糖”體系熱反應產(chǎn)物<1 ku的組分的鮮味強,“酶解液+氧化豬脂+木糖”體系的<1 ku的組分鮮味強、醇厚感較強、持續(xù)性強。這與2.2節(jié)熱反應產(chǎn)物的滋味比較結(jié)果相一致。加入糖后的鮮味增強,很可能與形成交聯(lián)性的美拉德反應產(chǎn)物有關(guān)[12]。

    2.4 凝膠色譜分離

    對超濾所得的<1 ku的呈味組分進行葡聚糖凝膠色譜柱分離,色譜圖如圖1所示,收集的組分評價結(jié)果見表5。

    由圖1可知,樣品(“酶解液+氧化豬脂”體系)被分離洗脫出6個峰,在180~390 min之間,主要的峰在180 min以后被洗脫出來;樣品(“酶解液+木糖”體系)被分離洗脫出4個峰,在180~360 min之間,主要峰在180 min以后被洗脫出來;樣品(“酶解液+氧化豬脂+木糖”體系)被分離洗脫出5個峰,在100~360 min之間,主要的峰在120 min以后被洗脫出來。

    表5為圖1中葡聚糖凝膠分離所得各組分峰的感官評價結(jié)果。根據(jù)表5可知,“酶解液+氧化豬脂”體系中,分離所得的峰G2醇厚感較強、持續(xù)性強;“酶解液+木糖”體系中,分離所得的峰G1鮮味最強;“酶解液+氧化豬脂+木糖”體系中,分離所得的峰G3鮮味較強,醇厚感最強,持續(xù)性強。

    2.5 反相高效液相色譜分離

    分別對“酶解液+氧化豬脂”、“酶解液+木糖”、“酶解液+氧化豬脂+木糖”體系中的主要呈味峰G2、G1、G3進行反相高效液相色譜分離,所得色譜圖如圖2所示。

    由圖2可以看出,譜峰H1~H6和H8為3個體系反應產(chǎn)物中的共有組分,除了“酶解液+木糖”體系外,“酶解液+氧化豬脂”和 “酶解液+氧化豬脂+木糖”體系均存在峰H7和H9,因此推測峰H7和H9的組分的出現(xiàn)與反應體系組成中加入氧化豬脂有關(guān)。

    圖1 3個體系超濾所得<1ku組分的凝膠分離色譜圖Fig.1 Chromatograms of Sephadex G-15 separation of the<1ku taste-active fractions from the three reaction products

    表5 葡聚糖凝膠G-15分離所得各組分的滋味特性Table5 Taste properties of the fractions collected in the Sephadex G-15 chromatographic separation

    圖2 葡聚糖凝膠G-15分離所得呈味組分的反相高效液相色譜(分析型色譜柱)分離圖Fig.2 RP-HPLC chromatograms in the separation of the taste-active fractions collected from the Sephadex G-15 chromatographic separation

    對H1~H9譜峰組分進行液相色譜制備性分離,所收集流分的滋味品評結(jié)果見表6??芍?,峰H1-H6味道相似,主要呈鮮味、并帶有酸味,但鮮味最強的為H1組分,其它組分的鮮味很弱。H8組分鮮味和醇厚感都有,且醇厚感強、持續(xù)性較強。由于H1~H6和H8為3個體系反應產(chǎn)物中的共有組分,從滋味特征推測H1~H6應為來源于酶解物中的呈味多肽,而H8可能為美拉德肽[12](注:酶解液中含有少量還原糖,因此“酶解液+氧化豬脂”體系會檢測到H8組分)。

    H7和H9這兩個與反應體系中氧化豬脂的加入有關(guān)的組分中,前者幾乎無味、且持續(xù)性弱;而后者突出的味感為醇厚味、并具有持續(xù)性,推測后者很可能為小分子羰基類脂肪氧化成分修飾的肽組分。

    表6 反相高效液相色譜分離所得組分的滋味特性Table6 Taste properties of the fractions collected in the RP-HPLC chromatographic separation

    2.6 呈味組分的結(jié)構(gòu)鑒定

    盡管進行了超濾、葡聚糖凝膠色譜、反相高效液相色譜的多級分離,但由于熱反應產(chǎn)物組分復雜,最后收集制備的樣品,反過來再用反相液相色譜進行分析,發(fā)現(xiàn)仍然不純,但H1、H9號峰樣品相對較純。為此對這兩樣品進行MALDI-TOF一級質(zhì)譜分析,然后再選擇一級質(zhì)譜圖中強度高的峰進行二級質(zhì)譜分析,結(jié)果見圖3。

    圖3 HPLC分離收集H1、H9組分的MALDI-TOF一級質(zhì)譜圖及其主要質(zhì)譜峰m/z448.2859、762.4446和806.4725對應的二級質(zhì)譜圖Fig.3 MALDI-TOF mass spectra in analysis of fractions H1 and H9 and their corresponding MS/MS spectra for m/z 448.2859,762.4446 and 806.4725

    由圖3可知,H1號峰樣品一級質(zhì)譜中相對強的質(zhì)譜峰為m/z448.2859,H9號峰樣品一級質(zhì)譜中相對強的質(zhì)譜峰為m/z762.4446,806.4725。對這3個質(zhì)量數(shù)進行二級碰撞,根據(jù)所得二級質(zhì)譜碎片,并結(jié)合肽類化合物的質(zhì)譜裂分規(guī)律[28-29],推測出m/z448.2859可能為五肽丙氨酸-甘氨酸-谷氨酸-蘇氨酸-丙氨酸,由于組成該肽的氨基酸均為鮮甜味氨基酸,可知這很可能是H1號峰具有較強的鮮味的原因。H9組分中m/z762.4446、m/z806.4725推測為脂質(zhì)修飾的肽,分別為己醛修飾的甘氨酸-谷氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸,及丙氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸-賴氨酸 (2-己烯醛修飾)-甘氨酸-半胱氨酸-天冬酰胺。2-己烯醛與肽的結(jié)合方式很可能為肽鏈中賴氨酸或精氨酸上的殘留氨基,通過邁克爾加成反應與2-己烯醛結(jié)合[30]。前期研究表明[16],2-己烯醛和己醛是氧化脂肪中含有的主要具有較高反應活性的醛,而己醛和2-庚烯醛可與谷胱甘肽反應,生成不揮發(fā)性加合物[31]。另外,H9組分采用600 M核磁共振碳譜初步分析 (未提供數(shù)據(jù)),發(fā)現(xiàn)在δC 20~30處檢測出峰簇,這可能也與H9的組分中含有脂質(zhì)化碳鏈有關(guān)??赡芤驗殡谋恢|(zhì)化修飾后,親脂性變強,從而對肉湯的滋味有增強醇厚感和持續(xù)性的效應,但這還有待于進一步研究。

    3 結(jié)論

    1)以豬肉酶解物為原料的熱反應,熱反應產(chǎn)物中主要呈味組分為<1 ku肽組分。木糖的添加對褐變反應貢獻遠大于氧化豬脂,木糖的添加對于提升反應產(chǎn)物的鮮味、肉味等滋味特性具有主要貢獻,而氧化豬脂的添加對于提升反應產(chǎn)物的醇厚感、持續(xù)性的滋味特性有主要貢獻。

    2)反應產(chǎn)物中<1 ku呈味肽組分,經(jīng)葡聚糖凝膠色譜、反相高效液相色譜分離收集,MALDITOF一級和二級質(zhì)譜分析,鑒定出3個肽分別為丙氨酸-甘氨酸-谷氨酸-蘇氨酸-丙氨酸、己醛修飾的甘氨酸-谷氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸、丙氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸-賴氨酸(2-己烯醛修飾)-甘氨酸-半胱氨酸-天冬酰胺,其中丙氨酸-甘氨酸-谷氨酸-蘇氨酸-丙氨酸肽可能對鮮味具有主要貢獻,而己醛修飾的甘氨酸-谷氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸和丙氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸-賴氨酸(2-己烯醛修飾)-甘氨酸-半胱氨酸-天冬酰胺兩個脂質(zhì)化修飾肽對增強醇厚感和持續(xù)性有貢獻。

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