鋅指核糖核酸結(jié)合蛋白在惡性腫瘤相關(guān)研究中的進(jìn)展

朱晨輝, 金 鳳, 劉歆農(nóng)

(1.揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225009; 2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

鋅指蛋白通常由一系列鋅指組成，具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的氨基酸模式和相隔特定距離的胱氨酸結(jié)合鋅指，這種結(jié)構(gòu)能與某些RNA、DNA結(jié)合。鋅指核糖核酸結(jié)合蛋白(ZFR)是一種古老且高度保守的蛋白質(zhì)，ZFR是從線蟲(chóng)到哺乳動(dòng)物都存在的染色體相關(guān)蛋白[1], 通常包含3個(gè)N-末端乙炔(C2H2)鋅指基序和1個(gè)C-末端鋅指相關(guān)結(jié)構(gòu)域(DZF)[2]，其中3個(gè)鋅指在秀麗隱桿線蟲(chóng)到人類(lèi)中都高度保守，表明其可維持特定的相互作用的強(qiáng)選擇壓力。在對(duì)ZFR結(jié)構(gòu)的研究[3]中，其DZF結(jié)構(gòu)域可與白細(xì)胞介素增強(qiáng)子結(jié)合因子2(ILF2)/NF45和白細(xì)胞介素增強(qiáng)子結(jié)合因子3(ILF3)/NF90的DZF結(jié)構(gòu)域組成異源二聚體，而鋅指可與RNA靶標(biāo)結(jié)合。

這種高度保守的ZFR對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要，研究[4]證實(shí)ZFR在人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)疾病遺傳性、痙攣性截癱中發(fā)生突變，并對(duì)血管的形成有重要影響，但其生理和生化功能尚未明確。除在骨骼肌中未檢測(cè)到ZFR外，各種人體組織中都測(cè)定了ZFR的轉(zhuǎn)錄水平。神經(jīng)元中ZFR的抑制會(huì)使得Staufen 2(62)同系物重新定位到核中，表明ZFR可能在RNA運(yùn)輸和早期階段的定位起關(guān)鍵作用。ZFR可以指導(dǎo)質(zhì)粒在特定識(shí)別位點(diǎn)的定向染色體整合，這些識(shí)別位點(diǎn)分布在幾種細(xì)胞類(lèi)型的整個(gè)人類(lèi)基因組中。

近年來(lái)，癌癥基因組學(xué)已經(jīng)成為人們了解癌癥的一個(gè)強(qiáng)大的工具。許多癌癥候選驅(qū)動(dòng)基因通過(guò)此類(lèi)基因組學(xué)進(jìn)行研究鑒定，例如ZFR。ZFR是在各種惡性腫瘤中發(fā)揮作用的關(guān)鍵基因。在結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞肝癌以及胰腺導(dǎo)管腺癌中，ZFR已經(jīng)被鑒定為癌癥候選驅(qū)動(dòng)基因。ZFR在許多浸潤(rùn)性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，包括前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、睪丸癌和口腔鱗癌[2]。此外, ZFR的過(guò)表達(dá)在各類(lèi)癌癥的惡性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中發(fā)揮重要作用。

1 ZFR在惡性腫瘤中的作用

1.1 致癌基因

結(jié)直腸癌作為全球第3大常見(jiàn)癌癥，研究[5]表明通過(guò)對(duì)小鼠模型中“睡美人”轉(zhuǎn)座子進(jìn)行誘變篩選，發(fā)現(xiàn)ZFR是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的有效致癌基因。敲除ZFR可顯著減緩腫瘤的生長(zhǎng)速度，同時(shí)ZFR的過(guò)表達(dá)可促使大鼠肝細(xì)胞腫瘤的進(jìn)展，這也表明ZFR可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖來(lái)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。研究[5]還通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)(RNA-seq)鑒定了ZFR的多個(gè)潛在靶標(biāo)并發(fā)現(xiàn)了FAM49B的顯著降低。通過(guò)對(duì)FAM49B進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，它是一種潛在的結(jié)直腸癌和肝癌的腫瘤抑制因子，當(dāng)敲除結(jié)直腸癌和肝癌細(xì)胞中FAM49B時(shí)，可以觀察到細(xì)胞增殖顯著加快，與ZFR過(guò)表達(dá)的結(jié)果一致。

胰腺腫瘤作為消化系統(tǒng)腫瘤中惡性程度最高的腫瘤，其早期缺乏特異性癥狀或體征，診斷較為困難，患者5年生存率低于6%[6], 因此對(duì)胰腺惡性腫瘤進(jìn)行早期診斷尤其重要。研究[7]顯示, ZFR水平升高的人群，其胰腺癌腫瘤細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞能夠更為有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)移。ZFR對(duì)于胰腺癌的增殖和侵襲有重要作用，胰腺腫瘤中ZFR的表達(dá)顯著高于正常胰腺組織。敲除內(nèi)源性ZFR會(huì)損害細(xì)胞活力并減少集落形成，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和蛋白質(zhì)印跡法分析發(fā)現(xiàn)，敲除ZFR后，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶2、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4、細(xì)胞周期蛋白a和細(xì)胞周期蛋白D1的水平降低，并增強(qiáng)了P27的表達(dá)，這或可成為胰腺癌靶向治療研究的新方向。

在對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的研究[10]中，研究人員首先通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定組織樣品中miR-141-3p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)該組織中miR-141-3p表達(dá)量與鄰近正常組織相比明顯下調(diào)，miR-141-3p的下調(diào)被證明是NSCLC的獨(dú)立預(yù)后因素。ZFR被確認(rèn)為miR-141-3p的靶基因，并且ZFR被證實(shí)在NSCLC中過(guò)表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZFR的表達(dá)與NSCLC中miR-141-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在對(duì)ZFR介導(dǎo)的遷移和侵襲的細(xì)胞通路研究中，研究人員通過(guò)插入誘變的方式，發(fā)現(xiàn)ZFR參與了NSCLC細(xì)胞株H1975的轉(zhuǎn)移，并證明了ZFR的破壞使得H1975細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力被損害。體外試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)shRNA進(jìn)行基因沉默進(jìn)一步證實(shí)了NSCLC細(xì)胞遷移需要ZFR，同時(shí)ZFR的過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了H1975細(xì)胞的遷移能力。此外, H1975細(xì)胞中ZFR表達(dá)下調(diào)顯著抑制了其體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，shRNA對(duì)H1975細(xì)胞的ZFR抑制作用也抑制了裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)。相反, NSCLC特異性ZFR的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了體內(nèi)NSCLC細(xì)胞的致瘤性和生長(zhǎng)。同時(shí)，NSCLC細(xì)胞株H1975中ZFR的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)Notch1水平的上調(diào)，而ZFR沉默導(dǎo)致Notch1表達(dá)降低，表明ZFR通過(guò)影響Notch1信號(hào)通路促進(jìn)了H1975細(xì)胞的遷移和侵襲[9]。

在乳腺癌中，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞系和腫瘤組織中ZFR呈上調(diào)。ZFR通過(guò)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上調(diào)，并在分泌后與其在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的蛋白酶底物形成共價(jià)復(fù)合物，這一過(guò)程可能與惡性腫瘤進(jìn)展與擴(kuò)散有關(guān)。在近期對(duì)于環(huán)狀RNA(circRNA)的研究中顯示, circZFR通過(guò)充當(dāng)miRNA海綿來(lái)調(diào)控多種癌癥的進(jìn)展，其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。Wei H等[10]證明circZFR通過(guò)miR-1261/C8orf4軸促進(jìn)了甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)展。Tan AC等[11]報(bào)道, circZFR通過(guò)miR-3619-5p/CTNNB1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)了肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。Zhang HF等[12]發(fā)現(xiàn)circZFR通過(guò)miR-101-3p/CUL4B軸在NSCLC中起癌基因的作用。研究[13]發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織和細(xì)胞中的circZFR表達(dá)水平比周?chē)姆悄[瘤組織和正常細(xì)胞中都要高，同時(shí)circZFR被證實(shí)可通過(guò)miR-545-3p/CBLL1途徑保護(hù)NSCLC對(duì)抗順鉑導(dǎo)致的損害。

1.2 抑癌基因

在人類(lèi)惡性腫瘤中，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑的激活突變被多次提及，而PI3K抑制劑作用下仍有大量腫瘤細(xì)胞。在對(duì)磷脂酰肌醇3激酶(PIK3CA)突變型乳腺癌細(xì)胞的基因篩選中[14], 發(fā)現(xiàn)了ZFR作為其候選基因。但是ZFR在癌癥和PI3K途徑抑制情況下對(duì)細(xì)胞增殖和存活的意義仍未明確。在對(duì)胃癌的研究中，目前用于胃癌診斷和預(yù)后判斷的循環(huán)生物標(biāo)志物有癌胚抗原(CEA), 糖類(lèi)抗原(CA)中的CA19-9、CA72-4、CA125、CA24-2、CA50, 以及胃蛋白酶原和甲胎蛋白，但是上述生物標(biāo)志物的敏感性和特異性均較低。Liu TL等[15]研究發(fā)現(xiàn), circZFR在胃癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，在體內(nèi)抑制胃癌生長(zhǎng)并影響P53蛋白的表達(dá)。這種ZFR對(duì)胃腫瘤的影響也在異種移植的小鼠模型實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。此外, circZFR通過(guò)抑制miR-130a/miR-107和磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

1.3 先天性免疫

研究[16]表明，由于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞(hMSCs)分泌的β干擾素(IFN-β), 使得三陰乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移被抑制，并且誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。在先天性免疫中，有關(guān)ZFR作用的研究[17]發(fā)現(xiàn), ZFR通過(guò)調(diào)控信使RNA選擇性剪接來(lái)抑制干擾素的反應(yīng)。此外，有研究[18-19]分析了ZFR同系物與pre-mRNA的剪切，這種對(duì)pre-mRNA的剪切的調(diào)控也被證實(shí)存在于多個(gè)人類(lèi)基因中。

在巨噬細(xì)胞分化中, ZFR的調(diào)控可防止異常的干擾素反應(yīng), ZFR可促進(jìn)組蛋白變體macroH2A1(mH2A1)的表達(dá)，以抑制異常的I型干擾素產(chǎn)生，而控制I型干擾素的產(chǎn)生對(duì)于防止有害炎癥反應(yīng)和抗感染至關(guān)重要。為應(yīng)對(duì)感染, IFN-β主要在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控，而實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析顯示，在ZFR缺失的細(xì)胞中，IFN-β的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組細(xì)胞，表明ZFR抑制了IFN-β的轉(zhuǎn)錄。因此, ZFR在先天免疫以及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮的作用也值得進(jìn)一步研究。

2 CCCH家族鋅指蛋白的相關(guān)研究

2.1 鋅指蛋白36(TTP蛋白)

近期研究[20]發(fā)現(xiàn), CCCH型鋅指蛋白參與了RNA代謝的多個(gè)步驟，包括mRNA的剪切、聚腺苷酸化、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯等。CCCH型鋅指蛋白通常會(huì)作為RNA結(jié)合蛋白(RBPs)調(diào)控RNA代謝[21]。RBPs是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子, RBPs是可與RNA分子結(jié)合的蛋白，并在調(diào)控基因表達(dá)中具有重要功能。RBPs在所有真核生物的轉(zhuǎn)錄中起著關(guān)鍵作用，如剪接、調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)以及mRNA翻譯和衰減的調(diào)節(jié)。RBPs組裝成不同的RNA蛋白質(zhì)復(fù)合物，形成核糖核蛋白復(fù)合物(RNPs)[22]。一般RBPs具有1個(gè)或多個(gè)RNA結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域。除了鋅指之外，還有RNA識(shí)別基序(RRM)、K同源結(jié)構(gòu)域(KH)、RGG(Arg-Gly-Gly)框、雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRBD)、Pumilio/PUF域和Piwi/Argonaute/Zwille(PAZ)域等[23]RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。研究[24-25]發(fā)現(xiàn)在脂肪、腎上腺、腦、乳腺、結(jié)腸、心臟、腎臟、肝臟、肺、淋巴結(jié)、卵巢、前列腺、骨骼肌、睪丸、甲狀腺和白細(xì)胞組織中, RBPs的表達(dá)顯著高于非RBPs和其他調(diào)節(jié)因子。尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)、尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(uPAR)和基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)是富含金元素(Au)的mRNA(ARE-mRNA), 其均在癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

TTP是一種非典型的CCCH家族鋅指蛋白。在乳腺癌相關(guān)研究中, TTP參與調(diào)控乳腺癌相關(guān)進(jìn)程。TTP在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)。在4類(lèi)雌激素受體陽(yáng)性與陰性的正常細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系的研究中，雌激素受體(ER)陰性正常細(xì)胞系中TTP表達(dá)量最高，而在高侵襲性ER陰性腫瘤細(xì)胞系中，TTP高度缺乏, TTP轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細(xì)胞的侵襲性也顯著降低。研究[26]表明, TTP表達(dá)的恢復(fù)使uPA、uPAR和MMP-1表達(dá)水平顯著降低，而敲除TPP的細(xì)胞質(zhì)，這3者的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平都增高。TTP調(diào)控uPA、uPAR和MMP1轉(zhuǎn)錄物的衰減，并且以Au富集元件(AREs)依賴(lài)的方式調(diào)控uPA、uPAR和MMP1的表達(dá)。

2.2 單核細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白1(MCPIP1)

MCPIP1也是一種來(lái)自于CCCH家族的蛋白。MCPIP1在人和小鼠之間的同源性超過(guò)85%。最新發(fā)現(xiàn)表明, MCPIP1是乳腺癌細(xì)胞抑制蛋白，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中扮演重要角色, MCPIP1促進(jìn)促炎因子的衰減。MCPIP1與TTP不同，TTP通過(guò)去乙酰化來(lái)調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性，而MCPIP1可以直接分解目標(biāo)mRNA。MCPIP1與細(xì)胞凋亡的關(guān)系最初是在研究心肌細(xì)胞時(shí)被提出。MCPIP1與腫瘤抑制基因P53不同，它主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，這一分布特征，就像是在細(xì)胞核的P53之外，形成了第2道預(yù)防腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的防線。目前為止，尚無(wú)直接證據(jù)表明MCPIP1誘導(dǎo)乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡，但MCPIP1抑制抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，并對(duì)促凋亡基因轉(zhuǎn)錄物的影響很小或沒(méi)有影響。研究[27]顯示，當(dāng)MCPIP1導(dǎo)致凋亡和抗凋亡基因之間的平衡被打破時(shí)，就會(huì)觸發(fā)凋亡。MCPIP1在其N(xiāo)端具有1個(gè)核酸內(nèi)切酶活性的PIN樣結(jié)構(gòu)域, MCPIP1通過(guò)識(shí)別并結(jié)合3′UTR中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，選擇性地靶向通過(guò)PIN域降解抗凋亡基因的mRNA, 打破凋亡與抗凋亡之間的平衡，促使細(xì)胞凋亡，使腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。

2.3 血管形成

在現(xiàn)代腫瘤治療中，依據(jù)靶向于腫瘤血管的“饑餓至死亡”的觀點(diǎn)，人們研發(fā)了大量的抗血管生成制劑，而ZFR在血管形成的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。一項(xiàng)糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究[28]發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)、體外高血糖條件下，人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRMECs)中ZFR都會(huì)高表達(dá), ZFR促進(jìn)了HRMECs的增殖和遷移，其機(jī)制可能是通過(guò)高血糖中O-糖基化修飾提高了ZFR在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)，提示高血糖環(huán)境中ZFR在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)與血管形成具有一定相關(guān)性，但是具體對(duì)有關(guān)腫瘤血管生成方面的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究明確。

3 展 望

ZFR作為一種擁有特殊結(jié)構(gòu)的染色體相關(guān)蛋白，在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展以及轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮著重要作用，在不同的惡性腫瘤中, ZFR的作用也有所不同，其中的關(guān)聯(lián)與機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡述。ZFR對(duì)于RNA的剪切的調(diào)控被多次提及，這可能是ZFR影響惡性腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展的重要機(jī)制，但ZFR在其中發(fā)揮的作用仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。