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    miR-155在重癥肺炎患者血清中的表達(dá)及其對(duì)肺組織的保護(hù)機(jī)制研究

    2020-01-02 17:23:10張錦麗吳杭捷
    健康研究 2020年5期
    關(guān)鍵詞:孵育重癥肺炎

    張錦麗,吳杭捷,郭 偉

    (浙江省醫(yī)療健康集團(tuán)杭州醫(yī)院 重癥監(jiān)護(hù)室,浙江 杭州 310021)

    重癥肺炎是呼吸內(nèi)科常見(jiàn)的社區(qū)獲得性感染,病情嚴(yán)重,發(fā)展迅速,病程長(zhǎng)[1]。重癥肺炎患者死亡率較高,為20%~50%[2]。Th17/Treg動(dòng)態(tài)平衡與炎癥的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[3-5]。microRNAs (miRNAs)是一種長(zhǎng)度為21~24個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA[6],miR-155在炎癥介導(dǎo)的相關(guān)疾病中的作用被相繼報(bào)道[7-8]。本研究檢測(cè)重癥肺炎患者miR-155水平,結(jié)合Th17/Treg動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)對(duì)miR-155保護(hù)肺組織的機(jī)制進(jìn)行探討。

    1 材料和方法

    1.1 一般資料 選取浙江省醫(yī)療健康集團(tuán)杭州醫(yī)院2018年3月—2019 年3月收治的重癥肺炎患者32例,其中男18例,女14例,平均年齡(61.09±7.72)歲,均符合重癥肺炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。以同期健康體檢者32例為健康對(duì)照組,其中男17例,女15例,平均年齡(62.11±7.08)歲。2組研究對(duì)象平均年齡、性別比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。所選研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū),本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 選取成年健康Sprague-Dawley(SD)大鼠39只,6~8周齡,體質(zhì)量200~250 g,雌雄不限,購(gòu)于北京華埠康生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0275]。SPF系統(tǒng)內(nèi)分籠飼養(yǎng),12 h循環(huán)光照,室溫(23.0±1.0)℃,濕度50%~60%,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。miR-155模擬物(miR155-Mimics)購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司,F(xiàn)ITC-Foxp3 (鼠8512477180 ,人71577640)、PE-Cy5.5-CD4 (鼠8511004181,人35004280)、PE-IL-17A (鼠8512717781,人12717842)、PE-CD25 (鼠51-0259- 41,人25-0259-42)、PE-Cy5 IgG1(共用PA5-75428)均購(gòu)自eBioscience公司,IL-17A(鼠1311702, 人512315)、IL-6(鼠1310602, 人430501)、IL-10(鼠1311002, 人501420)等ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自達(dá)科為生物科技有限公司。

    1.3 大鼠肺炎模型建立及給藥方法 參照文獻(xiàn)[10],培養(yǎng)肺炎克雷伯菌(武漢淼靈生物科技有限公司)制備成混懸菌液備用。將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分成3組,每組13只,分別為對(duì)照組、模型組(重癥肺炎模型)和miR-155組。模型組和miR-155組大鼠麻醉后,以仰臥姿態(tài)固定在操作臺(tái)上,將舌頭固定在口外,聲門(mén)顯露,插入氣管約0.5 cm,拔出導(dǎo)絲。0.4 mL的肺炎克雷伯菌液(含菌量1.2×1010CFU/mL)經(jīng)導(dǎo)管注射至大鼠氣管,確保菌液全部進(jìn)入。當(dāng)大鼠出現(xiàn)呼吸急促、喘息、哮鳴音、躁動(dòng)、口唇、耳紫紺等癥狀時(shí)為造模成功[11]。對(duì)照組腹腔注射等體積的無(wú)菌生理鹽水。造模前24 h,miR-155組氣管穿刺注入miR-155模擬物40 μg,對(duì)照組和模型組腹腔注射等量無(wú)菌生理鹽水。造模成功后24 h,各組大鼠腹主動(dòng)脈采血5 mL(1 mL抗凝全血,其余抗凝離心后取血清),并剖開(kāi)胸腔取肺組織,部分于4%多聚甲醛中固定,剩余組織凍存于液氮中。

    1.4 miR-155檢測(cè) 提取血清中總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-155水平,上海生工生物工程(上海)股份有限公司協(xié)助完成引物設(shè)計(jì)和合成,嚴(yán)格按照SYBR Green PCR 混合試劑盒(德國(guó)Qiagen)說(shuō)明書(shū)操作。miR-155正向和反向引物分別是:5’-UUAALUGGUAAUUGUCAUACGGGU-3’和5’-CCCUAUGACAAUUACCAUUAA UU-3’,內(nèi)參為U6,采用2-△△ct法進(jìn)行定量計(jì)算,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.5 Th17和Treg細(xì)胞比例測(cè)定 采用FC500 MCL流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。分別采集重癥肺炎組和健康對(duì)照組研究對(duì)象3 mL抗凝血,F(xiàn)icoll 法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞,懸液于2個(gè)流式管中,第 1 管中加入 PERCP標(biāo)記的CD4抗體,第2管中加入PERCP標(biāo)記的CD4、FITC標(biāo)記的CD25,室溫避光孵育30 min,PBS洗滌離心后室溫避光孵育IL-17A 破膜劑A液15 min,清洗。加入IL-17A 破膜劑B液及IL-17A 抗體,通過(guò)IgG1做同型對(duì)照,室溫下避光孵育30 min,清洗重懸等待上機(jī)。以相同操作孵育Foxp3對(duì)應(yīng)的抗體,上機(jī)設(shè)門(mén)后分別分析CD4-CD25-Foxp3-/CD4-(Th17細(xì)胞)和CD4+IL-17+/CD4+(Treg細(xì)胞)在外周血中的比例。另取大鼠肺組織的單個(gè)核細(xì)胞,調(diào)整至1×106個(gè)/mL,步驟同上。

    1.6 ELISA IL-17A、IL-6、IL-10水平檢測(cè) 采用ELISA法。取各組外周血3 mL,EDTA抗凝后3 000 r(有效離心半徑10 cm),4 ℃下離心10 min,取上層血清。加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL /孔)至相應(yīng)孔中,封孔、室溫下孵育120 min后洗板5次。加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔),密封室溫孵育60 min,洗板。加入酶結(jié)合物工作液(100 μL /孔),密封室溫孵育20 min,洗板。100 μL /孔顯色劑顯色,密封室溫孵育20 min。加入終止液混勻檢測(cè)重癥肺炎組、健康對(duì)照組和大鼠對(duì)照組、模型組、miR-155組血清中IL-17A、IL-6和IL-10水平。

    1.7 HE染色及形態(tài)學(xué)分析 各組大鼠肺組織采用4%多聚甲醛溶液固定后脫水及石蠟包埋,制成厚度約為5 μm的組織切片,行常規(guī)HE染色,中性樹(shù)膠封固,顯微鏡下觀(guān)察。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料2組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 重癥肺炎患者血清中miR-155及炎癥因子水平 重癥肺炎組患者血清中miR-155水平低于健康對(duì)照組,IL-17A水平高于健康對(duì)照組,IL-10低于健康對(duì)照組,IL-6水平高于健康對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)封三圖1。

    2.2 重癥肺炎患者外周血中Th17和Treg的比例 重癥肺炎組患者外周血中Th17細(xì)胞比例高于健康對(duì)照組,Treg細(xì)胞比例低于健康對(duì)照組,Th17/Treg的比值高于健康對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)封三圖2。

    2.3 大鼠肺組織的HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示,正常組大鼠肺小葉結(jié)構(gòu)清晰,肺泡腔結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和上皮黏膜脫落現(xiàn)象;模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及出血癥狀;miR-155組大鼠炎性浸潤(rùn)減少;見(jiàn)封三圖3。

    2.4 大鼠外周血中Th17和Treg的比例 與正常組相比,模型組大鼠Treg細(xì)胞比例降低,Th17細(xì)胞比例上升,Th17/Treg的比值上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,miR-155組大鼠Treg細(xì)胞比例上升,Th17細(xì)胞比例下降,Th17/Treg的比值下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);見(jiàn)封三圖4。

    2.5 大鼠血清中miR-155及炎癥因子水平 與正常組大鼠血清中miR-155的相對(duì)表達(dá)量(1.00±0.13)比較,模型組大鼠miR-155的相對(duì)表達(dá)量(0.42±0.09)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.42,P=0.003);miR-155組大鼠miR-155的相對(duì)表達(dá)量(1.03±0.16)高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.07,P<0.001)。與正常組相比,模型組重癥肺炎大鼠血清中IL-17A和IL-6水平上升, IL-10水平下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,miR-155組大鼠血清中IL-17A和IL-6水平下調(diào),IL-10水平上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);見(jiàn)封三圖5。

    3 討論

    病毒性肺炎和細(xì)菌性肺炎是導(dǎo)致兒童、老年人、免疫缺陷者和全世界共病者死亡的重要原因[12-13]。肺炎初次感染時(shí),病毒或者細(xì)菌潛伏在患者體內(nèi)多個(gè)器官中,尤其是肺部。當(dāng)機(jī)體免疫功能受到抑制后,病毒或細(xì)菌將成瀑布式暴發(fā),與機(jī)體免疫系統(tǒng)形成對(duì)抗[14-16],最終發(fā)展成重癥肺炎。重癥肺炎作為一種急性呼吸道感染,是常見(jiàn)的高死亡率疾病之一[17]。目前可用于監(jiān)測(cè)肺炎發(fā)展的特異性生物指標(biāo)尚不完善,迫切需要檢測(cè)方便和特異性高的生物指標(biāo)來(lái)監(jiān)測(cè)重癥肺炎的發(fā)生發(fā)展,以提高重癥肺炎的確診率。

    miRNAs可通過(guò)介導(dǎo)RNA裂解、抑制mRNA翻譯或引起mRNA不穩(wěn)定來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miR-155干擾免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞、T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞功能,并在多種疾病中具有不同的表達(dá)模式[18]。本研究結(jié)果顯示,miR-155在重癥肺炎患者和大鼠模型血清中的相對(duì)表達(dá)量均明顯下降,肺部損傷明顯;當(dāng)miR-155過(guò)表達(dá)時(shí),重癥肺炎大鼠肺部損傷減輕,炎性浸潤(rùn)減少,表明miR-155過(guò)表達(dá)對(duì)于重癥肺炎大鼠的肺部有一定的保護(hù)功效。miR-155對(duì)人肺組織的保護(hù)作用,仍需進(jìn)一步研究確定。

    研究[19-20]顯示,雖然具體觸發(fā)重癥肺炎的機(jī)制尚不明確,但是炎癥反應(yīng)在重癥肺炎進(jìn)展中的地位已明確。當(dāng)初期潛伏的病毒或者細(xì)菌被激活后,宿主自身免疫調(diào)節(jié)開(kāi)始發(fā)揮作用[16],這時(shí)多種炎癥因子成瀑布式暴發(fā),最終由局部肺炎發(fā)展成全身炎癥反應(yīng),甚至可導(dǎo)致肺部乃至多器官的衰竭。Th17/Treg失衡是炎癥反應(yīng)的重要特征之一,有研究[21]顯示Th17/Treg平衡在肺炎患者中的重要性。本研究結(jié)果顯示,重癥肺炎患者和大鼠模型外周血中Th17細(xì)胞比例明顯增加,Treg細(xì)胞比例明顯降低。在宿主體內(nèi),當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí),Th17和Treg細(xì)胞顯示出相反的變化趨勢(shì),一方面,Th17細(xì)胞主要作用是促進(jìn)炎癥反應(yīng),這一效應(yīng)通過(guò)分泌大量的IL-17并聚集大量炎癥細(xì)胞達(dá)成[22],此時(shí)機(jī)體內(nèi)的IL-6等其他炎性因子的表達(dá)也會(huì)增多;另一方面,Treg細(xì)胞的主要作用是負(fù)性調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞,達(dá)到抑制T細(xì)胞增殖、活化的效應(yīng),防止自身免疫疾病的發(fā)生,這一效應(yīng)主要通過(guò)分泌IL-10等炎性細(xì)胞因子而發(fā)揮免疫抑制功能。本研究結(jié)果顯示,重癥肺炎患者和大鼠模型血清中IL-17A、IL-6水平明顯上升,IL-10水平明顯下降;過(guò)表達(dá)miR-155后,重癥肺炎大鼠血清中IL-17A、IL-6水平明顯降低, IL-10水平明顯上升,這一結(jié)果與外周血中Th17/Treg的變化趨勢(shì)一致。

    綜上,重癥肺炎患者血清中miR-155的表達(dá)明顯下降,過(guò)表達(dá)miR-155后重癥肺炎大鼠的肺組織損傷減少,具體的保護(hù)機(jī)制可能與恢復(fù)Th17/Treg的平衡有關(guān)。

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