水稻半外卷葉突變體sol1的表型分析與基因定位

謝園華 李鳳菲 馬曉慧 譚 佳 夏賽賽 桑賢春 楊正林 凌英華

水稻半外卷葉突變體的表型分析與基因定位

謝園華**李鳳菲**馬曉慧 譚 佳 夏賽賽 桑賢春 楊正林 凌英華*

西南大學(xué)水稻研究所 / 轉(zhuǎn)基因植物與安全控制重慶市重點實驗室, 重慶 400715

適度卷曲有利于提高水稻葉片的光合效率, 增加植株光合產(chǎn)物的有效積累量。我們利用甲基磺酸乙酯(EMS)處理秈型水稻保持系西農(nóng)1B, 獲得一個穩(wěn)定遺傳的水稻半外卷葉突變體。該突變體從十葉期開始各葉片逐漸向外卷曲直至半卷狀, 并伴隨莖稈半矮化和葉片披垂, 暫被命名為()。與野生型(WT)相比,的葉片卷曲指數(shù)均達到30%以上(<0.01); 倒一、倒二、倒三、倒四節(jié)節(jié)間長度和穗長極顯著縮短, 倒一、倒二、倒三葉的葉夾角顯著或極顯著增加; 有效穗數(shù)、千粒重、每穗實粒數(shù)、結(jié)實率顯著或極顯著下降, 一次枝梗數(shù)則增加11.3% (<0.05)。的蒸騰速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度顯著高于野生型。石蠟切片顯示,倒一葉的泡狀細胞體積變小, 數(shù)量顯著增多, 表皮細胞體積略微增大。遺傳分析表明,的半外卷葉性狀受1對隱性核基因調(diào)控, 定位于6號染色體標(biāo)記JY6-3和JY6-10之間165 kb的物理范圍內(nèi), 共含15個注釋基因。qRT-PCR結(jié)果表明, 與泡狀細胞相關(guān)的內(nèi)卷基因和外卷葉基因在突變體中呈不同程度的上調(diào),、、、、則呈不同程度的下調(diào)。研究結(jié)果為基因的克隆和功能研究奠定了基礎(chǔ)。

水稻(L.); 半外卷突變體; 表型鑒定; 基因定位; 泡狀細胞

水稻株型改良對水稻理想株型的形態(tài)建成以及提高水稻產(chǎn)量表現(xiàn)具有重要作用[1]。葉型為株型改良性狀的重要組成部分, 在水稻植株營養(yǎng)生長的中后階段, 葉片的適度卷曲可降低群體消光系數(shù), 提高植株的光能利用率, 促進光合產(chǎn)物的積累, 從而增加稻谷產(chǎn)量[2]。

在葉的形態(tài)建成中, 葉原基從頂端分生組織中的周邊區(qū)分化發(fā)育后, 進一步沿3個不同的方向極性分化, 即基-頂軸分化(proximo-distal axis polarization), 中-邊軸分化(centrol-lateral axis polarization), 近-遠軸分化(adaxial-abaxial axis polarization), 從而構(gòu)成葉片三維體軸, 其中對葉片近-遠軸分化發(fā)育相關(guān)的基因報道很多[3]。水稻葉片卷曲是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程, 受多基因調(diào)控, 包括-家族成員、家族成員等。()基因家族編碼由同源異型框-亮氨酸拉鏈所組成的一典型轉(zhuǎn)錄因子家族, 水稻中有、、、、[4]水稻中的()基因家族成員——基因通過調(diào)控細胞程序性死亡(PCD)過程進而影響近-遠軸面的發(fā)育, 編碼一類MYB類家族轉(zhuǎn)錄因子, 屬于GARP蛋白家族[2]?；蚣易迮c在側(cè)生器官近遠軸面極性建立方面起重要協(xié)調(diào)作用, 主要是通過miRNA來構(gòu)成相互抑制的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[5]。

目前在水稻中已定位或克隆的卷葉基因超過30個, 在12條染色體上均有分布, 其中經(jīng)典的卷葉基因有、、、、、等[6]。已報道基因如[7-8]、[9]、[10]、[11][12]、[13]等的研究結(jié)果顯示, 泡狀細胞是造成葉片卷曲的重要原因。此外, 其他因素如葉肉細胞的排布及角質(zhì)層的形成等也會引起葉片卷曲。如基因通過影響厚壁組織和葉肉細胞調(diào)控遠軸面的發(fā)育, 進而改變?nèi)~型[2]。內(nèi)卷突變體是60Coγ射線誘變中花11粳稻品種導(dǎo)致正常株厚壁細胞的位置被占據(jù)并影響葉綠體片層基粒排布而形成的[14]。基因是通過抑制角質(zhì)層發(fā)育的關(guān)鍵基因和的表達, 導(dǎo)致突變體中葉片角質(zhì)層發(fā)育受到影響, 葉片表現(xiàn)卷曲[15]。

本研究從秈型水稻保持系西農(nóng)1B的EMS突變體庫中, 鑒定到一個半外卷葉突變體(-)。初步表型鑒定表明,從十葉期至成熟期, 葉片向遠軸面逐漸卷曲, 且各葉片出現(xiàn)不同程度的披垂。本研究對的表型鑒定、光合特性分析、細胞學(xué)分析、遺傳特性分析和基因精細定位等, 為后續(xù)基因的克隆和功能研究奠定了良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

經(jīng)EMS誘變自育秈型保持系西農(nóng)1B, 構(gòu)建了相應(yīng)的突變體庫。通過篩選和連續(xù)多代自交, 從該突變體庫中鑒定到性狀穩(wěn)定遺傳的水稻半外卷葉突變體。將實驗室自育恢復(fù)系縉恢10號與雜交, 利用F1和F2群體進行遺傳分析, 明確目標(biāo)性狀的遺傳特性; 并利用F2群體進行目標(biāo)基因的精細定位。

1.2 表型分析

大田種植和西農(nóng)1B (WT), 鑒定其全生育期植株表型。于成熟期, 隨機選取長勢一致的與WT 各10株, 考察其葉長、葉寬、有效穗數(shù)、一次枝梗、二次枝梗、千粒重、每穗粒數(shù)、倒一、倒二、倒三、倒四節(jié)節(jié)間長度、穗長等性狀。

于拔節(jié)期, 隨機選取長勢一致的和WT各10株, 分別測其倒一(the 1st leaf from the top, Top 1)、倒二(the 2nd leaf from the top, Top 2)、倒三(the 3rd leaf from the top, Top 3)葉的葉夾角(莖稈與主葉脈之間的角度), 以及倒一、倒二、倒三葉葉片最寬處卷曲時的寬度(n)和展開后的寬度(w), 計算卷曲指數(shù)[LRI = (w–n)/w× 100%][16]。

1.3 細胞學(xué)分析

隨機選抽穗期和WT各10株, 分別取其倒一葉片相同部位, 于FAA固定液(50%乙醇∶0.9 mol L–1冰乙酸∶甲醛 = 90∶5∶5)中固定, 依次經(jīng)乙醇脫水, 二甲苯透明, 石蠟包埋, 切片, 番紅-固綠對染, 最后在NIKON E6000顯微鏡下照相觀察[17]。

1.4 光合效率分析

大田期間, 于乳熟期隨機選取與WT各3株, 用Li-6400型便攜式光合測定儀測定凈光合速率(n, μmol m–2s–1)、蒸騰速率(r, mmol m–2s–1)、胞間CO2濃度(i, μmol mol–1)與氣孔導(dǎo)度(s, mmol m–2s–1)等光合參數(shù), 分析與WT植株的光合效率。

1.5 基因定位

參照Michelmore等[18]的BSA法篩選連鎖標(biāo)記, 從F2植株中分別選取10株正常株和10株突變株剪取等量葉片, 構(gòu)建正?；虺睾屯蛔兓虺? 采用改良的CTAB法分別提取親本和F2群體的基因組DNA, 利用本實驗室篩選的均勻分布于水稻12條染色體上的SSR和InDel分子標(biāo)記, 同時結(jié)合數(shù)據(jù)庫(http://www.gramene.org/microsat)和Vector NTI Advance 10 軟件開發(fā)新的SSR和InDel分子標(biāo)記, 進行目標(biāo)基因定位。

1.6 RNA提取與qRT-PCR分析

選取長勢一致的野生型和突變體各3株, 提取植株葉片的總RNA (RNA prep pure Plant Kit, Tiangen Co. Ltd., China), 并以之為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA (Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit, TaKaRa)。采用quantitative Real-time PCR (qRT-PCR)方法測量泡狀細胞相關(guān)的內(nèi)卷基因和外卷相關(guān)基因在野生型和突變體植株中的表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型鑒定

與WT相比,從十葉期開始葉片表現(xiàn)出輕微的向外卷曲, 隨著生育進程其葉片外卷逐漸明顯, 且在葉片未完全抽出時葉片基部就表現(xiàn)向遠軸面卷曲和褶皺, 葉中上部位則只表現(xiàn)向外卷曲, 同時從苗期至成熟期出現(xiàn)葉片披垂和莖稈半矮化(圖1-A~H)。拔節(jié)期倒一、倒二、倒三葉的卷曲指數(shù)分別為34.83%、40.66%、31.75%, 均極顯著高于野生型(5%~6%) (圖1-I)。成熟期的倒一、倒二、倒三、倒四節(jié)的節(jié)間長度和穗長較WT分別縮短13.68%、25.82%、34.00%、29.77%和30.77% (<0.01)(圖1-J, K)。拔節(jié)期的倒一、倒二、倒三葉的葉夾角較WT分別增大了74.82%、19.20%、39.86% (圖1-L)。

(圖1)

A、B、C、D: 分別代表WT與的五至六葉期、分蘗期、成熟期表型; E、F: 分別為WT與未完全抽出時的葉基部; G: WT與倒一葉近軸面基部; H: WT與倒一葉遠軸面葉尖; I: WT與拔節(jié)期葉片卷曲指數(shù); J: WT與穗長及各節(jié)間長; K: 成熟期WT與的各節(jié)間比較; L: WT與拔節(jié)期葉夾角。圖A、B、C、D、J中, Bar = 10 cm; 圖E、F、G、H中, Bar = 2 cm。Top 1: 葉片頂端往下第一片葉; Top 2: 葉片頂端往下第二片葉; Top 3: 葉片頂端往下第三片葉。*: 在0.01 ≤< 0.05區(qū)間差異顯著, **:< 0.01差異極顯著。

A, B, C, D: plant phenotypes of WT andat the 5-6 leaf stage, the tillering stage and the mature stage, respectively; E and F: incompletely extracted leaf base of WT and, respectively; G: bases of the abaxial top 1 of WT and; H: tips of the adaxial top 1 of WT and; I: leaf curl indexes of WT andat jointing stage; J: lengths of the spike and internodes of WT and; K: comparison of the internodes of WT andat mature period; L: leaf angles of WT andat the shooting period. Bar = 10 cm, in A, B, C, D, J diagrams; Bar = 2 cm, in E, F, G, H diagrams. Top1: the 1st leaf from the top; Top2: the 2nd leaf from the top; Top3: the 3rd leaf from the top. * means significant difference at 0.01 ≤< 0.05 by-test; ** means significant difference at< 0.01 by-test.

與WT相比, 孕穗期突變體倒一葉葉長無明顯變化、葉寬較WT顯著增加7.27%; 倒二葉葉寬無變化, 葉長顯著縮短9.17%; 而倒三葉的葉長、葉寬則顯著或極顯著變短、變窄, 較WT分別降低35.76%和11.56% (圖2-A, B)。與WT相比, 突變體除每穗粒數(shù)、二次枝梗數(shù)無顯著差異外, 其有效穗數(shù)、千粒重、結(jié)實率均顯著或極顯著減少, 一次枝梗數(shù)則顯著增多(圖2-C~H)。

(圖2)

A、B: 孕穗期倒一、倒二、倒三葉葉長及葉寬(cm); C: 有效穗數(shù); D: 一次枝梗; E: 二次枝梗; F: 千粒重(g); G: 每穗實粒數(shù); H: 結(jié)實率(%)。倒一葉: 葉片頂端往下第一片葉; 倒二葉: 葉片頂端往下第二片葉; 倒三葉: 葉片頂端往下第三片葉。*: 在0.01 ≤< 0.05區(qū)間差異顯著, **:<0.01差異極顯著。

A, B: length and width of tops 1, 2, 3 at booting stage (cm); C: numbers of effective panicles; D: primary branches; E: secondary branches; F: 1000-grain weights (g); G: filled grain numbers per panicle; H: Seed setting rate (%); Top 1:the 1st leaf from the top; Top 2: the 2nd leaf from the top; Top 3: the 3rd leaf from the top. * means significant difference at 0.01 ≤< 0.05 by-test; ** means significant difference at< 0.01 by-test.

2.2 sol1的光合效率分析

突變體的凈光合速率除倒二葉與野生型的差異無統(tǒng)計學(xué)意義外, 倒一、倒三葉均極顯著下降;的蒸騰速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度均顯著或極顯著高于野生型。r較WT分別增加了161.52%、211.12%、82.08%, 差異均達到極顯著水平;i均極顯著上升; 倒一、倒二、倒三葉葉尖、葉基部s均極顯著或顯著增加(圖3-A~D)。由此說明可能是上三葉葉型的改變引起光合特性參數(shù)的變化, 進而影響光能利用率和光合作用效率。

圖3 乳熟期野生型(WT)與突變體sol1葉片光合效率分析

A: 倒一、倒二、倒三葉凈光合速率(n); B: 倒一、倒二、倒三葉蒸騰速率(r); C: 倒一、倒二、倒三葉胞間CO2濃度(i); D: 倒一、倒二、倒三葉葉尖、葉基氣孔導(dǎo)度(s)。Top 1: 葉片頂端往下第一片葉; Top 2: 葉片頂端往下第二片葉; Top 3: 葉片頂端往下第三片葉。*: 在< 0.05水平上差異顯著, **: 在< 0.01水平上差異顯著。

A: net photosynthetic rate (n) of tops 1, 2, 3; B: transpiration rate (r) of tops 1, 2, 3; C: intercellular CO2concentration (i) of tops 1, 2, 3; D: stomatal conductance (s) of the tip and base of tops 1, 2, 3. Top 1:the 1st leaf from the top; Top 2: the 2nd leaf from the top; Top 3: the 3rd leaf from the top. * significant difference at< 0.05; ** significant difference at< 0.01.

2.3 sol1葉片的細胞學(xué)分析

石蠟切片觀察抽穗期倒一葉橫切面, 發(fā)現(xiàn)葉片向遠軸面呈不對稱卷曲, 而WT則基本平直展開(圖4-A, B)。進一步放大觀察, 發(fā)現(xiàn)相鄰維管束之間的泡狀細胞向內(nèi)凹陷并變小, 其數(shù)量和總面積較WT分別增加了38.88%和34.83%, 差異達顯著水平(圖4-C~H)。此外, 葉片上下表皮細胞略微增大, 泡狀細胞下的葉肉細胞厚度略變薄。因此, 突變體葉片外卷可能是其表皮泡狀細胞異常所致。

圖4 葉片橫切面石蠟切片分析

A、B: 分別為抽穗期WT和倒一葉橫切圖, Bar = 1 mm; C、D: 分別為A、B圖中紅色線框的放大圖; E、F: 分別為A、B圖中黃色線框的放大圖, Bar = 0.1 mm; G: 兩小維管束之間的泡狀細胞數(shù)量; H: 兩小維管束之間的泡狀細胞面積。BC: 泡狀細胞, *: 在0.01 ≤< 0.05區(qū)間差異顯著。

A, B: cross cutting diagrams of top 1 of WT andat the heading stage, respectively, Bar = 1 mm; C, D: magnified diagrams of a red box in picture A and B, respectively; E, F: magnified diagrams of a yellow box in picture A and B, respectively, Bar = 0.1 mm; G: number of bulliform cells between two small vein; H:area of bulliform cells between two small vein. BC: bulliform cell. * means significant difference at 0.01 ≤< 0.05 by-test.

2.4 遺傳分析

以縉恢10號為父本,為母本, 雜交后F1代表型正常; F2單株則出現(xiàn)正常表型和半外卷表型。在調(diào)查的4251個F2單株中, 正常表型3226株, 突變表型1025株。χ2檢驗結(jié)果顯示, 該F2群體中正常株與突變株分離比為3.25, 符合3﹕1的理論比例(χ2= 1.74＜χ20.05, 1= 3.84), 因此可以推斷出的目標(biāo)性狀受1對隱性核基因控制。

2.5 基因定位

利用本實驗室篩選的、均勻分布在水稻12條染色體上的400多個SSR標(biāo)記和98個InDel標(biāo)記, 篩選西農(nóng)1B和縉恢10號的多態(tài)性。篩選出96個多態(tài)性標(biāo)記用于擴增親本及正常表型基因池和突變表型基因池, 發(fā)現(xiàn)6號染色體短臂上的RM204標(biāo)記在這2個基因池之間存在穩(wěn)定差異, 預(yù)測該標(biāo)記可能與基因連鎖。進一步利用F2單株驗證, 確定了RM204與的連鎖。在RM204附近查找并開發(fā)新標(biāo)記, 最終將基因初步定位在RM204和ZTQ54之間, 遺傳距離分別為13.07 cM和19.28 cM (圖5)。

進一步開發(fā)初步定位區(qū)間的InDel標(biāo)記, 篩選出ZZC6-6、JY6-7、JY6-4、JY6-3、JY6-10等標(biāo)記(表1)在與縉恢10號之間存在多態(tài)性。利用這些新開發(fā)的多態(tài)性標(biāo)記對F2突變單株進行基因型鑒定, 結(jié)果顯示ZZC6-6、JY6-7、JY6-4、JY6-3、JY6-10這5個標(biāo)記在490個隨機選取的F2單株中, 前4個標(biāo)記分別檢測到9、5、3、2個交換單株, 后1個標(biāo)記檢測到4個交換單株, 且兩側(cè)的交換單株不同, 從而最終將基因定位在JY6-3和JY6-10之間165 kb的物理距離內(nèi)(圖5)。

圖5 SOL1候選基因定位

表1 第6號染色體上新開發(fā)的連鎖標(biāo)記引物

檢索結(jié)果顯示, 精細定位區(qū)間內(nèi)共含有15個注釋基因。其中7個編碼表達蛋白, 其余8個編碼反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白、葉片衰老相關(guān)蛋白、環(huán)核苷酸門控離子通道、同源異型結(jié)構(gòu)域和START結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄延伸因子復(fù)合物SPT5、LysM-GPI錨定蛋白前體、天冬氨酸蛋白酶的豬籠草蛋白前體(表2)。

表2 定位區(qū)間內(nèi)的候選基因注解

2.6 相關(guān)基因表達量分析

突變體葉片的細胞學(xué)結(jié)果表明, 葉片外卷表型主要由泡狀細胞的變化引起, 因此選取了水稻中與泡狀細胞相關(guān)的內(nèi)卷基因和外卷相關(guān)基因進行qRT-PCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 與WT相比, 在突變體中的表達量呈不同程度的上調(diào), 而、、、、則呈不同程度的下調(diào)(圖6), 表明泡狀細胞相關(guān)的內(nèi)卷基因和外卷相關(guān)基因可能共同參與調(diào)控基因的外卷表型。

圖6 葉片卷曲相關(guān)基因的qRT-PCR

A: 泡狀細胞發(fā)育相關(guān)的卷葉基因; B: 遠軸面卷曲的相關(guān)基因。

A: some genes in bulliform cell development-related rolling leaf; B: genes about some abaxially curled leaf.

3 討論

葉片是水稻進行光合作用以及氣體和水分交換的重要器官, 是塑造理想株型的重要性狀之一。水稻葉片的適度卷曲, 有利于保持葉片挺立狀態(tài), 改善植株上層葉片的光合速率, 整體提升其光合產(chǎn)物總量的積累[2]。利用突變體研究水稻葉片的形態(tài)發(fā)育機制, 有助于豐富水稻卷葉基因的遺傳資源, 對理想高產(chǎn)株型的改良有重要意義[19]。

在水稻葉片的近軸面一般含有4~5個左右泡狀細胞, 并呈中間大兩頭小類似扇形的結(jié)構(gòu)。泡狀細胞是一種特化的表皮細胞, 也是調(diào)節(jié)水分的高度液泡化的薄壁細胞[20]。一般而言, 泡狀細胞失水時葉片易向近軸面卷曲, 吸水后易向遠軸面卷曲[21]。研究發(fā)現(xiàn), 泡狀細胞數(shù)量或體積是水稻葉片形態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控因素之一, 如等。編碼類纖維素合成蛋白酶, 其突變體的葉片近軸面泡狀細胞變小, 導(dǎo)致葉片卷曲[7-8]與過表達時葉片內(nèi)卷并變窄, 其泡狀細胞數(shù)量減少[9,13]。定位在2號染色體上, 其突變體葉片遠軸面表皮細胞近軸化, 即在遠軸面出現(xiàn)泡狀細胞[10]。突變體葉片因泡狀細胞數(shù)目增加及排列異常而造成外卷并下垂[11], 其蛋白OsZHD1能結(jié)合啟動子[22]?；蛲蛔兒蟊憩F(xiàn)葉片外卷, 是由其泡狀細胞變大和數(shù)目增加及表皮細胞擴大所引起[23]。負向調(diào)控泡狀細胞的發(fā)育, 過表達時, 泡狀細胞數(shù)量和大小都減少, 造成葉片內(nèi)卷[24]。編碼2OG-Fe(II)氧化酶, 其突變體次生細胞壁組分減少, 從導(dǎo)管到葉片的水分運輸速率降低, 導(dǎo)致泡狀細胞失水, 表現(xiàn)出內(nèi)卷[25]?；虺绊懪轄罴毎臄?shù)量外, 還影響葉片的其他細胞結(jié)構(gòu), 導(dǎo)致其突變體植株矮化且葉片嚴重卷曲[26]。通過油菜素內(nèi)酯信號的傳導(dǎo), 使葉片泡狀細胞數(shù)目和大小改變, 進而調(diào)控葉片形態(tài)[27]。編碼糖基磷脂酰肌醇蛋白, 能夠特異性調(diào)控液泡H+-焦磷酸酶和H+-ATPase亞基編碼基因的表達, 抑制液泡形成, 使泡狀細胞數(shù)量減少; 其突變體泡狀細胞數(shù)目增加, 致使葉片半卷[28]。前人報道結(jié)果與RT-PCR中基因表達量趨勢一致,葉片的泡狀細胞體積略微減小, 數(shù)量顯著增加, 泡狀細胞下的葉肉細胞厚度略微變薄, 同時葉片氣孔導(dǎo)度增大, 蒸騰速率升高, 這可能是葉片卷曲的主要因素之一。

基因被定位于6號染色體標(biāo)記JY6-3和JY6-10之間165 kb的區(qū)間內(nèi)。此前在6號染色體上已經(jīng)報道了2個與水稻卷葉相關(guān)的基因與, 其中調(diào)控的突變體是由輻射誘變粳稻9522所獲得, 其主要表型為植株矮化, 其次還伴隨葉片短且微卷。目標(biāo)基因位于水稻6號染色體PAC克隆AP003490與AP005619上118 kb的物理范圍內(nèi)[29]。與相似,同樣位于水稻6號染色體短臂SSR標(biāo)記RM276附近。研究結(jié)果表明,突變體葉綠素含量顯著高于野生型, 葉肉細胞層數(shù)變薄; 并且在野生型細胞內(nèi)的一個較大的泡狀細胞, 在細胞內(nèi)有2個大小相近的泡狀細胞, 而該突變有可能是導(dǎo)致葉片筒狀卷曲的主要原因[30]。從的表型鑒定結(jié)果來看, 與表現(xiàn)出一定的相似性, 葉肉細胞厚度變薄、泡狀細胞變小等。但是與也存在顯著不同, 即的突出表型為葉片外卷(圖1-H, 圖4-B), 而則表現(xiàn)為內(nèi)卷; 此外,細胞內(nèi)較大的泡狀細胞與WT相似(圖4-C~F), 其外卷的原因有可能是因為表皮泡狀細胞的顯著增多, 也明顯不同于。從比較結(jié)果來看,明顯不同于與, 且其定位結(jié)果與這2個已經(jīng)報道的卷葉相關(guān)基因不一致, 是一個新的調(diào)控水稻葉片卷曲的基因。對該基因的后續(xù)深入研究, 包括目標(biāo)基因分離、功能驗證、機制解析等, 有可能為水稻葉片發(fā)育等相關(guān)研究提供新的參考。

4 結(jié)論

通過EMS誘變秈稻西農(nóng)1B獲得半外卷突變體從十葉期開始功能葉片呈現(xiàn)出輕微的卷曲, 且隨生育進程卷曲程度加深, 葉片半外卷和披垂, 莖稈半矮化, 葉夾角顯著大于野生型。葉片的泡狀細胞略微減小但數(shù)量較野生型顯著增加。的蒸騰速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度顯著或極顯著高于野生型。該性狀受1對隱性核基因控制,為一新的基因, 被定位在6號染色體短臂165 kb區(qū)間內(nèi)。

[1] Wang B, Smith S M, Li J. Genetic regulation of shoot architecture., 2018, 69: 437–468.

[2] Zhang G H, Xu Q, Zhu X D, Qian Q, Xue H W. SHALLOT-LIKE1 is atranscription factor that modulates rice leaf rolling by regulating leaf abaxial cell development., 2009, 21: 719–735.

[3] Ma L, Sang X C, Zhang T, Yu Z Y, Li Y F, Zhao F M, Wang Z W, Wang Y T, Yu P, Wang N, Zhang C W, Ling Y H, Yang Z L, He G H.regulates cell proliferation and procambium cell establishment during aerial organ development in rice., 2017, 213: 275–286.

[4] Itoh J I, Hibara K I, Sato Y, Nagato Y. Developmental role and auxin responsiveness ofgene family members in rice., 2008, 147: 1960–1975.

[5] Izhaki A, Bowman J L.andgenefamilies regulate embryo patterning and modulate auxin flow during embryogenesis in., 2007, 19: 495–508.

[6] Shi Z Y, Wang J, Wan X, Shen G, Wang X, Zhang J. Over-expression of ricegene induces upward curling of the leaf blade that enhanced erect-leaf habit., 2007, 226: 99–108.

[7] Hu J, Zhu L, Zeng D L, Gao Z Y, Guo L B, Fang Y X, Zhang G H, Dong G J, Yan M X, Liu J, Qian Q. Identification and characterization of, a novel gene regulating leaf morphology and plant architecture in rice., 2010, 73: 283–292.

[8] Wu C, Fu Y, Hu G, Si H, Cheng S, Liu W. Isolation and characterization of a rice mutant with narrow and rolled leaves., 2010, 232: 313–324.

[9] Li Y Y, Shen A, Xiong W, Sun Q L, Luo Q, Song T, Li Z L, Luan W J. Over-expression ofresults in pleiotropic effects on plant type architecture and leaf development in Rice., 2016, 9: 46.

[10] Hibara K, Obara M, Hayashida E, Abe M, Ishimaru T, Satoh H, Itoh J, Nagato Y. Thegene functions in leaf and embryonic pattern formation in rice., 2009, 334: 345–354.

[11] Xu Y, Wang Y H, Long Q Z, Huang J X, Wang Y L, Zhou K N, Zheng M, Sun J, Chen H, Chen S H, Jiang L, Wang C M, Wan J M. Overexpression of, a zinc finger homeodomain class homeobox transcription factor, induces abaxially curled and drooping leaf in rice., 2014, 239: 803–816.

[12] Wang L, Xu J, Nian J Q, Shen N W, Lai K K, Hu J, Zeng D L, Ge C W, Fang Y X, Zhu L, Qian Q, Zhang G H. Characterization and fine mapping of the rice generegulating leaf morpho-logy and leaf vein development., 2016, 78: 345–356.

[13] Li C, Zou X H, Zhang C Y, Shao Q H, Liu J, Liu B, Li H Y, Zhao T.overexpression induced adaxially rolled leaves in rice., 2016, 11: e0156413.

[14] Yan S, Yan C J, Zeng X H, Yang Y C, Fang Y W, Tian C Y, Sun Y W, Cheng Z K, Gu M H, encoding a GARP protein, regulates the leaf abaxial cell fate in rice., 2008, 68: 239–250.

[15] Wu R, Li S, He S, Wassmann F, Yu C, Qin G, Schreiber L, Qu L J, Gu H., a WW domain protein, regulates cuticle development by modulating the function of HDG1, a class IV homeodomain transcription factor, in rice and., 2011, 23: 3392–3411.

[16] 高艷紅, 呂川根, 王茂青, 王彭, 閆曉燕, 謝坤, 萬建民. 水稻卷葉性狀QTL的初步定位. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2007, 23: 5–10. Gao Y H, Lyu C G, Wang M Q, Wang P, Yan X Y, Xie K, Wan J M. QTL mapping for rolled leaf gene in rice., 2007, 23: 5–10 (in Chinese with English abstract).

[17] Sang X C, Li Y F, Luo Z K, Wang N, Ling Y H, Zhao F M, Yang Z L, Luo H F, Liu Y S, He G H., encoding a monocot-specific MADS box protein, regulates floral organ identity in rice., 2012, 160: 788–807.

[18] Michelmore R W, Paran I, Kesseli R V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregantion analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations., 1991, 88: 9828–9832.

[19] Mori M, Nomura T, Ooka H, Ishizaka M, Yokota T, Sugimoto K, Okabe K, Kajiwara H, Satoh K, Yamamoto K, Hirochika H, Kikuchi S. Isolation and characterization of a rice dwarf mutant with a defect in brassinosteroid biosynthesis., 2002, 130: 1152–1161.

[20] Martin C, Glover B J. Functional aspects of cell patterning in aerial epidermis., 2007, 10: 70–82.

[21] 徐靜, 王莉, 錢前, 張光恒. 水稻葉片形態(tài)建成分子調(diào)控機制研究進展. 作物學(xué)報, 2013, 39: 767–774. Xu J, Wang L, Qian Q, Zhang G H. Research advance in molecule regulation mechanism of leaf morphogenesisin rice (L.)., 2013, 39: 767–774 (in Chinese with English abstract).

[22] Figueiredo D D, Barros P M, Cordeiro A M, Serra T S, Louren?o T, Chander S, Oliveira M M, Saibo N J M. Seven zinc-finger transcription factors are novel regulators of the stress responsive gene., 2012, 63: 3643–3656.

[23] Li L, Shi Z Y, Li L, Shen G Z, Wang X Q, An L S, Zhang J L. Overexpression of() increased bulliform cells and induced abaxial curling of leaf blades in rice., 2010, 3: 807–817.

[24] Zou L P, Sun X H, Zhang Z G, Liu P, Wu J X, Tian C J, Qiu J L, Lu T G. Leaf rolling controlled by the homeodomain leucine zipper class IV gene, 2011, 156: 1589–1602.

[25] Fang L, Zhao F, Cong Y, Sang X, Du Q, Wang D, Li Y, Ling Y, Yang Z, He G.is a 2OG-Fe (II) oxygenase family protein that modulates rice leaf rolling by affecting secondary cell wall formation in leaves., 2012, 10: 524–532.

[26] Hong Z, Ueguchi-Tanaka M, Shimizu-Sato S, Inukai Y, Fujioka S, Shimada Y, Takatsuto S, Agetsuma M, Yoshida S, Watanabe Y, Uozu S, Kitano H, Ashikari M, Matsuoka M. Loss-of-function of a rice brassinosteroid biosynthetic enzyme, C-6 oxidase, prevents the organized arrangement and polar elongation of cells in the leaves and stem., 2002, 32: 495–508.

[27] Chen Q L, Xie Q J, Gao J, Wang W Y, Sun B, Liu B H, Zhu H T, Peng H F, Zhao H B, Liu C H, Wang J, Zhang J L, Zhang G Q, Zhang Z M. Characterization of, 2015, 66: 6047–6058.

[28] Xiang J J, Zhang G H, Qian Q, Xue H W.encodes a putative glycosyl phosphatidylinositol-anchored proteinand modulates rice leaf rolling by regulating the formation ofbulliform cells., 2012, 159: 1488–1500.

[29] 夏令, 陳亮, 郭遲鳴, 張紅心, 趙政, 沈明山, 陳亮. 一個新的水稻矮稈突變體的遺傳與基因定位研究. 廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2007, 46: 847–851. Xia L, Chen L, Guo C M, Zhang H X, Zhao Z, Shen M S, Chen L. Heredity and gene mapping of a new dwarf mutantin rice., 2007, 46: 847–851 (in Chinese with English abstract).

[30] 田曉慶, 桑賢春, 趙芳明, 李云峰, 凌英華, 楊正林, 何光華. 水稻卷葉基的遺傳分析和分子定位. 作物學(xué)報, 2012, 38: 423–428.Tian X Q, Sang X C, Zhao F M, Li Y F, Ling Y H, Yang Z L, He G H. Genetic analysis and molecular mapping of a rolled leaf genein rice (L.)., 2012, 38: 423–428(in Chinese with English abstract).

Phenotype characterization and gene mapping of the semi-outcurved leaf mutantL.)

XIE Yuan-Hua**, LI Feng-Fei**, MA Xiao-Hui, TAN Jia, XIA Sai-Sai, SANG Xian-Chun, YANG Zheng-Lin, and LING Ying-Hua*

Rice Research Institute of Southwest University / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Chongqing 400715, China

Moderate curling of leaves helps to improve the photosynthetic efficiency, and increase the overall effective accumulation of photosynthate. We identified a stable mutant from the library constructed by treatingmaintainer line Xinong 1B with ethyl methane sulfonate (EMS). Leaves of the mutant gradually curled outwards into a semi-coiled shape, accompanied by semi-dwarfing of the culm and leaf drooping from the 10-leaf stage, the mutant was temporarily named as(). The calculated leaf curl index ofwas 30%, statistically higher than that of wild type (WT,< 0.01). Panicle length and internode length of Top 1 (the 1st leaf from top), Top 2 (the 2nd leaf from top), Top 3 (the 3rd leaf from top), and Top 4 (the 4th leaf from top) were very significantly decreased. The leaf angles of Top 1, Top 2, and Top 3 were significantly or very significantly increased. The number of effective panicles, 1000-grain weight, filled grain number per panicle, and seed setting rate of the mutantwere significantly or very significantly decreased, while primary branch number increased by 11.3%, statistically higher than that of WT (< 0.05). The transpiration rate, intercellular CO2concentration and stomatal conductance ofwere significantly higher than those of wild type. The results of paraffin section showed that the bulliform cells of the Top1 ofexhibited smaller, but their number increased significantly, and the volume of epidermal cells increased slightly. Genetic analysis indicated thatwas controlled by a recessive nuclear gene.was precisely located in the physical distance of 165 kb between the markers of JY6-3 and JY6-10 on the short arm of chromosome 6, with 15 annotated genes. The results of qRT-PCR showed that,,andrelated to bulliform cells were up- regulated in mutant, while,,,,down-regulated. The results of the present study provide a basis forcloning, and functional dissection as well.

rice (L.); semi-outcurvedleaf mutant; phenotype characterization; gene mapping; bulliform cell

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0100201), 重慶市社會事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項項目(cstc2016shms-ztcx80012)和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項(XDJK2016A013)資助。

This study was supported by the National Key R&D Program of China (2017YFD0100201), the Special Project on Science and Technology Innovation for Social Undertakings and Livelihood Security in Chongqing (cstc2016shms-ztcx80012), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2016A013).

10.3724/SP.J.1006.2020.92020

凌英華, E-mail: lingyh003@126.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

謝園華, E-mail:402307420@qq.com; 李鳳菲, E-mail: 1071655475@qq.com

2019-04-09;

2019-08-09;

2019-09-03.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190903.0934.002.html