基于QTL定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選甘藍型油菜株高和一次有效分枝高度的候選基因

霍 強 楊 鴻 陳志友 薦紅舉 曲存民 盧 坤 李加納,*

基于QTL定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選甘藍型油菜株高和一次有效分枝高度的候選基因

霍 強1,2,**楊 鴻1,2,**陳志友1,2薦紅舉1,2曲存民1,2盧 坤1,2李加納1,2,*

1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/ 油菜工程研究中心, 重慶 400715;2西南大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 重慶 400715

株高和一次有效分枝高度是與甘藍型油菜結(jié)莢層厚度、收獲指數(shù)緊密關(guān)聯(lián)的重要農(nóng)藝性狀, 有關(guān)株高的數(shù)量性狀位點(quantitative trait locus, QTL)和全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)已有很多報道, 但對一次有效分枝高度的QTL和GWAS定位以及候選基因篩選的研究報道較少。本研究利用已構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖對2016和2017年2個環(huán)境的186個株系組成的重組自交系群體株高和一次有效分枝高度及其最佳線性無偏預(yù)測(best linear unbiased prediction, BLUP)值進行QTL定位共檢測到8個株高的QTL, 分別位于A03、A04和A09染色體, 單個QTL解釋4.60%~13.29%的表型變異, 其中位于A04染色體上的QTL (q-2017PH-A04-2和q-BLUP-PH-A04-2)在2017年和BLUP中均被檢測到; 檢測到9個一次有效分枝高度QTL, 分別位于A01、A02、A05、A09、C01和C05染色體上, 單個QTL解釋5.12%~19.10%的表型變異, 其中q-2017BH-A09-1、q-BLUP-BH-A09-2和q-BLUP-BH-A09-3有重疊區(qū)段。同時, 利用課題組前期完成的588份重測序自然群體進行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 2年共檢測到與株高顯著關(guān)聯(lián)的50個SNP位點和與一次有效分枝高度顯著關(guān)聯(lián)的12個SNP位點; 根據(jù)SNP的物理位置, 篩選出參與細胞增殖、細胞擴增、細胞周期和細胞壁活動的13個株高候選基因, 以及參與赤霉素、亞精胺等合成代謝途徑、核糖體組成和在光合、萌發(fā)等過程中有一定作用的一次分枝高度的11個候選基因, 并利用熒光定量PCR技術(shù)驗證候選基因在極端材料中的表達情況。本研究結(jié)果將為油菜株型改良及后續(xù)基因的功能研究提供理論依據(jù)。

甘藍型油菜; 株高; 一次有效分枝高度; 基因定位; 候選基因篩選

甘藍型油菜是四大油料作物之一, 且在飼料、綠肥、蔬菜、能源、旅游、蜜源等方面都有重要價值。作物的株型結(jié)構(gòu)在作物從幼苗到成熟的生長期間以及作物對環(huán)境條件的響應(yīng)中發(fā)生變化, 這種可塑性是由作物發(fā)育的靈活變化帶來的[1], 同時作物株型的變化對作物的適應(yīng)性和產(chǎn)量具有顯著影響[2-3]。

株高是作物株型最突出的決定因素, 在作物中常被馴化或選擇。其中矮稈基因已廣泛應(yīng)用于提高谷類作物的抗倒伏能力和收獲指數(shù)[4]。第一次“綠色革命”, 將半矮化基因引入水稻()和矮化基因引入小麥()來降低作物株高[5], 使2種作物增加其種植密度, 通過提高收獲指數(shù)而大幅增產(chǎn)。擬南芥中,()、()、()、、是5個DELLA蛋白基因, 突變體和在DELLA蛋白結(jié)構(gòu)域的序列缺失導(dǎo)致植株嚴重矮化[6-7]。和基因突變植株也表現(xiàn)出矮化現(xiàn)象[8]。作物的分枝同樣是影響株型的重要因素。玉米的基因可抑制側(cè)生器官生長[9], 在小麥中過表達此基因可抑制小麥分蘗發(fā)育[10]。番茄()基因[11]、擬南芥基因[12]和水稻()基因[13]是同源基因, 以及番茄中()基因[14], 它們的突變可顯著減少營養(yǎng)分枝和生殖分枝的數(shù)量; 此外, 擬南芥()、豌豆()、矮牽牛()等基因也對分枝生長發(fā)育有著重要作用[15]。截至目前, 株高候選基因在模式植物中雖已經(jīng)得到大量的克隆和鑒定, 但在甘藍型油菜中僅有幾例報道[16], 且一次有效分枝高度基因在甘藍型油菜中尚無定位和克隆的報道。

利用QTL和GWAS相結(jié)合是定位數(shù)量性狀候選基因的有效方法[17]。王嘉等[18]利用RIL (recombinant inbred lines)群體檢測到分布于A01、A06、A07、A08、A10和C06染色體上的11個株高相關(guān)QTL, 單個QTL可解釋的表型變異為5.00%~15.26%; 并檢測到7個一次有效分枝高度相關(guān)QTL, 分別位于A06、C05和C06染色體上, 單個QTL解釋5.04%~12.99%的表型變異。Zhao等[19]利用1個DH (doubled haploid)群體, 檢測到18個位于A02、A03、A07、A10、C01、C03、C04、C06和C09染色體上的株高相關(guān)QTL和27個位于A01、A02、A03、A06、A07、A09、A10、C03、C05、C06和C09染色體上的一次有效分枝高度相關(guān)QTL。Cai等[2]利用DH群體, 檢測20個株高相關(guān)QTL和16個一次有效分枝高度相關(guān)QTL。Luo等[20]對(a doubled-haploid population)進行基因分型, 并對該群體之前的表型重新分析, 檢測到80個株高相關(guān)QTL, 分布在除C01外的各個染色體上; 同時檢測到35個與一次有效分枝高度相關(guān)QTL, 分布在A01、A02、A03、A05、A06、A09、A10、C05、C06、C07、C08、C09上, QTL的貢獻率為3.19%~22.91%。賀亞軍等[21]利用1個DH群體和1個永久性F2群體, 檢測到9個株高相關(guān)QTL, 分布于A02、A09、C01、C02和C06連鎖群上; 同時檢測到11個一次有效分枝高度相關(guān)QTL, 分布于A01、A03、A09、C01和C03連鎖群上, 單個QTL可解釋4.01%~16.54%的表型變異。Shen等[22]利用DH群體檢測到5個株高相關(guān)QTL和5個一次有效分枝高度相關(guān)QTL, 位于A02和A07染色體上。但以上報道均以單個方法篩選候選基因, 而使用QTL定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)篩選和鑒定候選基因具有重要意義。

雖然株高和一次有效分枝高度的相關(guān)基因挖掘已經(jīng)有較多的報道[23-25], 但是本文利用不同的作圖群體和具有物理位置的SNP標記, 篩選QTL和顯著關(guān)聯(lián)的SNP, 并利用其物理位置信息篩選候選基因, 結(jié)合qRT-PCR結(jié)果進一步驗證篩選的候選基因, 這將為基因功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于QTL定位的群體是以GH06為母本、中油821 (ZY821)為父本雜交獲得F1, 自交的F2代通過“一粒傳法”連續(xù)自交10代以上構(gòu)建形成含186個株系的高世代重組自交系群體。該群體材料于2015—2016年度、2016—2017年度連續(xù)2年種植于重慶市北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn)油菜基地(29oN, 106oE, 海拔238.6 m), 以育苗移栽方式, 隨機區(qū)組設(shè)計, 2個重復(fù), 每小區(qū)種植3行, 每行15株, 行距40 cm, 株距20 cm。按照常規(guī)生產(chǎn)方式進行田間管理。

用于全基因組關(guān)聯(lián)分析的自然群體是由全球油菜主要生產(chǎn)地征集的588份油菜品系組成[26], 其中大部分來自國內(nèi)重慶、湖北、湖南、江蘇、陜西等地, 部分來自加拿大、德國、瑞典、丹麥、澳大利亞等國家。該群體所有種植及田間管理同重組自交系群體。

1.2 性狀考察

成熟期, 在每個小區(qū)中部選擇5株長勢一致的油菜植株統(tǒng)計調(diào)查表型性狀, 分別測定其株高(plant height, PH)、一次有效分枝高度(the first branch height, BH)、結(jié)莢厚度(thickness of pod canopy, TPC)、經(jīng)濟產(chǎn)量(economic yield, EY)和收獲指數(shù)(harvest index, HI)。株高指從子葉節(jié)到整株油菜主莖最高點的長度, 單位為cm; 一次有效分枝高度是指子葉節(jié)與主莖上最下部第一個有效分枝著生點之間的距離, 單位為cm; 結(jié)莢厚度是指整株油菜最高一個有效角果著生點與最低一個有效角果著生點的高度差, 單位為cm; 經(jīng)濟產(chǎn)量是指5株植株所有自然風(fēng)干種子總重量的平均值, 以“g”為單位; 收獲指數(shù)是指5株油菜單株經(jīng)濟產(chǎn)量之和與其生物產(chǎn)量之和的百分比。

1.3 表型數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2007對高世代重組自交系群體和自然群體的表型數(shù)據(jù)進行整理和簡單的統(tǒng)計分析; 利用IBM SPSS Statistics 19統(tǒng)計分析軟件進行描述性統(tǒng)計分析并制作正態(tài)分布圖、進行相關(guān)分析; 變異系數(shù): CV =/, 其中為標準差,為平均值; 廣義遺傳力:2=2G/(2G+2GE/+2e/), 其中2G表示基因型方差,2GE表示基因型與環(huán)境互作方差,2e為誤差,代表環(huán)境數(shù)目,代表每個環(huán)境的重復(fù)數(shù); 利用R軟件對兩年兩群體的表型數(shù)據(jù)進行最佳線性無偏預(yù)測(best linear unbiased prediction, BLUP)。

1.4 遺傳圖譜定位方法

取每個株系的5個幼嫩葉片混合, 提取DNA用于SNP標記分析。按照Illumina公司的Infinium HD Assay Ultra的說明進行DNA樣品的預(yù)處理、與芯片雜交、洗脫、單堿基延伸、染色及包埋, 芯片準備好后利用Illumina HiSCAN掃描, 并利用GenomeStudio genotyping software v2011對掃描結(jié)果進行分析獲得每個株系的基因型, SNP遺傳圖譜包括8575個SNP標記, 1201個bin, 覆蓋甘藍型油菜基因組6140.2 cM。采用WinQTL Cart2.5軟件[27]的復(fù)合區(qū)間作圖程序進行株高和一次有效分枝高度的QTL定位和效應(yīng)檢測。進行CIM分析時, 設(shè)置1 cM的步長(walking speed), 1000次回歸, 顯著水平0.01。遵照McCouch等[28]的方法命名QTL, 斜寫的小寫字母“q”加上性狀的名字, 后面跟染色體, 最后一個數(shù)字表示QTL的序號。如q-2016PH-A01-1表示2016年株高在A01染色體上的第1個QTL。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法

1.5.1 基因型數(shù)據(jù)測定與分析 對588份甘藍型油菜進行重測序, 數(shù)據(jù)包含134.3億個150 bp的雙末端片段, 過濾后大約有530萬個SNP。通過基因型分析, 最終獲得385,692個可利用的SNP標記數(shù)據(jù)[26], 這些標記數(shù)據(jù)的最小基因型頻率(minor allele frequency, MAF)大于0.05, 利用這些覆蓋甘藍型油菜全基因組的高密度標記, 對甘藍型油菜自然群體進行群體結(jié)構(gòu)(Q)、親緣關(guān)系(K)和連鎖不平衡(LD)分析, 并用這些標記結(jié)合重慶2年的株高和一次有效分枝高度的表型數(shù)據(jù)進行全基因組關(guān)聯(lián)分析。

1.5.2 群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系分析與連鎖不平衡分析

利用Structure 2.3.4軟件把每份甘藍型油菜材料歸類到特定的2個亞群里, 以此確定總?cè)后w的群體結(jié)構(gòu)。運用TASSEL 5.0軟件對自然群體中任意的2份材料進行親緣關(guān)系的評估, 計算兩特定材料間的遺傳相似度與任意材料間的遺傳相似度的相對值, 用0替代系數(shù)小于0的相對值。本群體中約2/3的材料間親緣關(guān)系值小于0.05, 群體材料間親緣關(guān)系越弱, 對進一步關(guān)聯(lián)分析的影響越小[29]。運用TASSEL 5.0軟件對群體內(nèi)連鎖不平衡(LD)進行分析計算。利用染色體上非等位基因位點間的2值來估算甘藍型油菜染色體中A和C染色體組LD的衰減, A和C染色體組的LD隨著物理距離的增加而下降, 但A和C染色體組的衰減程度不同, 在同一物理位置A染色體組比C染色體組衰減快[26]。

1.5.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析 采用naive、Q、PCA、K、Q+K和PCA+K六種統(tǒng)計模型來評估群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系的影響進行表型和SNP關(guān)聯(lián)分析(Q: 群體結(jié)構(gòu); PCA: 主成分; K: 親緣關(guān)系)。運用TASSEL 5.0軟件進行這6種模型的關(guān)聯(lián)分析, 其中使用一般線性模型(GLM)分析naive、Q和PCA模型, 使用混合線性模型(MLM)分析K、Q+K和PCA+K模型。利用SAS軟件對這6種模型的運算結(jié)果, 對其-lg ()的觀測值和-lg ()期望值繪制Quantile-quantile散點圖, 通過QQ圖比較后確定最佳模型, 在最佳模型下進行株高和一次有效分枝高度性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析, 利用R軟件作Manhattan圖。本試驗使用的SNP數(shù)據(jù)為385,692個,值小于閾值(1/385,692 = 2.593E-06)的位點為顯著關(guān)聯(lián)位點。對于GWAS結(jié)果, 定位區(qū)間為顯著關(guān)聯(lián)SNP位點左右延伸500 kb[30]。

1.6 候選基因的篩選

根據(jù)甘藍型油菜“Darmor-bzh”參考基因組[31], 提取株高和一次有效分枝高度性狀定位的QTL置信區(qū)間內(nèi)的基因; 根據(jù)分析得到的株高和一次有效分枝高度關(guān)聯(lián)SNP標記, 提取各位點500 kb內(nèi)的基因; 將需要功能分析的基因序列與擬南芥所有基因序列進行BLASTN比對, E-value閾值為1E-10, 并以同源性最高的擬南芥基因作為待分析基因的功能注釋來篩選與株高和一次有效分枝高度相關(guān)的候選基因。

1.7 候選基因的驗證

對株高和一次有效分枝高度極端材料在蕾薹期取3個生物學(xué)重復(fù)的莖尖并提取RNA。根據(jù)前期所取材料的莖尖提取的RNA, 使用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 將得到的cDNA產(chǎn)物稀釋10倍后作為模板, 用于qRT-PCR驗證。以油菜內(nèi)參基因作為對照, 使用TaKaRa公司的SYBR Premix ExII試劑盒進行qRT-PCR驗證候選基因的相對表達量。設(shè)置每個樣品3次技術(shù)重復(fù)。在Bio-Rad定量PCR儀上進行qRT-PCR擴增。在網(wǎng)站http://biodb. swu.edu.cn/qprimerdb上查找設(shè)計候選基因的qRT-PCR引物(表1), 由上海生工生物工程有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組自交系群體與自然群體的表型變異

重組自交系群體中, 親本GH06和ZY821的株高分別為198.1 cm和186.6 cm, 一次有效分枝高度分別為90.7 cm和67.8 cm,檢驗株高在親本間未達到顯著差異(>0.05), 但一次有效分枝高度達到顯著差異(<0.01)。株高在2016年和2017年的變異系數(shù)分別為5.24%和5.75%, 一次有效分枝高度的變異系數(shù)為18.58%和17.73%; 自然群體中, 株高在2016年和2017年的變異系數(shù)分別為8.57%和10.16%, 一次有效分枝高度的變異系數(shù)分別為26.65%和27.86% (表2)。2年間兩性狀的變異系數(shù)較為穩(wěn)定, 株高的變異系數(shù)相對于一次有效分枝高度較小。株高在重組自交系和自然群體中的廣義遺傳力分別為75.45%和87.42%, 一次有效分枝高度分別為68.77%和82.21%; 在同一群體中, 株高較一次有效分枝高度的遺傳力高。自然群體中, 測量株高和一次有效分枝高度極端材料YC4、YC15、YC11的表型數(shù)據(jù), YC4和YC15株高分別為213.9 cm和185.7 cm; YC11和YC4的一次有效分枝高度分別為100.8 cm和70.3 cm, 2年極端材料的株高及一次有效分枝高度都達到顯著差異(<0.01)。

重組自交系群體和自然群體2年株高和一次有效分枝高度均表現(xiàn)出連續(xù)正態(tài)分布(圖1), 說明這2個性狀都符合由多基因控制的數(shù)量性狀特點, 滿足QTL作圖的基本要求, 適合全基因組關(guān)聯(lián)分析。

2.2 重組自交系群體QTL定位分析

利用WinQTL2.5對株高和一次有效分枝高度共檢測到19個QTL, 分布在8條染色體上, 其中在A09染色體上檢測到的QTL數(shù)量最多(圖2)。位于A01和A09上的QTL加性效應(yīng)為負值, 表明這些QTL的增效基因來自父本, 其余的QTL則來自母本(表3)。

對于株高, 2016年檢測到2個QTL, 2017年檢測到6個QTL, 基于2年數(shù)據(jù)的BLUP值檢測到3個QTL, 其中(A04: 13,373,664–13,531,885)和(A04: 13,373,664–13,531,885)重合,(22,590,345–23,259,990)(23,517,031–23,521,212)(23,603,951– 23,642,701)有交叉重疊區(qū)段, 因此共檢測到8個QTL。這些QTL主要分布于A03、A04、A09染色體, LOD值介于2.60~5.20, 表型變異貢獻率為4.60%~13.29%。

表1 候選基因引物及其擴增產(chǎn)物

表2 兩群體株高和一次有效分枝高度的表型數(shù)據(jù)

RIL: 重組自交系; N: 自然群體。

PH: plant height; BH: the first branch height; SD: standard deviation; CV: coefficient of variation;2: broad sense heritability; RIL: recombinant inbred lines; N: natural population;♂: male parent;♀: female parent.

圖1 兩群體株高和一次有效分枝高度的頻次分布

PH: 株高; BH: 一次有效分枝高度; RIL: 重組自交系; N: 自然群體。

PH: plant height; BH: the first branch height; RIL: recombinant inbred lines; N: natural population.

圖2 株高和一次有效分枝高度QTL在SNP連鎖群上分布情況

對于一次有效分枝高度, 在2016年和2017年分別檢測到2個和4個QTL, 基于2年數(shù)據(jù)的BLUP值檢測到5個QTL, 其中(32,375,997? 32,618,214)(32,435,925?32,608,817)(32,514,368?32,619,386)有交叉重疊的區(qū)段, 因此共檢測到9個QTL。這些QTL主要分布于A01、A02、A05、A09、C01和C05染色體, LOD值介于2.76~6.52, 表型變異貢獻率為5.12%~19.10%。

2.3 自然群體的全基因組關(guān)聯(lián)分析

對株高和一次有效分枝高度關(guān)聯(lián)分析6種模型下的結(jié)果繪制Quantile-Quantile散點圖(QQ plot), 將各模型下的曲線與期望曲線擬合度最高的模型作為最佳模型。由圖3可知, 各性狀的最佳模型如下, 株高(PH)都為P+K模型, 一次有效分枝高度(BH)除2016年為K模型外, 其余也為P+K模型。在最佳模型下, 利用385,692個SNP, 以值小于閾值(1/385,692 = 2.593E-06)確定顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(附表1), 并繪制Manhattan圖(圖3)。

對于株高, 2016年在A03染色體上檢測到1個SNP; 2017年檢測到49個SNP, 分別位于A02 (1個)、A07 (45個)和C06 (3個)染色體; 2年BLUP也檢測到67個SNP, 分別位于A02 (2個)、A07 (59個)、C02 (1個)和C06 (5個)染色體。在這些位點中, 有42個SNP在2017年和基于BIUP都被檢測到, 因此對于株高共檢測到75個SNP, 它們的貢獻率為6.01%~20.05%, 其中2016年A03染色體上的S3_24415510位點貢獻率最大。

表3 在兩年中檢測到的株高和一次有效分枝高度QTL

BLUP: 最佳線性無偏預(yù)測。

PH: plant height; BH: the first branch height;BLUP: best linear unbiased prediction.

對于一次有效分枝高度, 2016年在C03(2個)、C04(1個)和C09(1個)染色體上檢測到4個SNP; 2017年檢測到8個SNP, 分別位于A02(6個)、C02(1個)和C05(1個)染色體; 基于2年BLUP檢測到7個SNP, 分別位于A02(5個)、C02(1個)和C05(1個)染色體。其中有5個SNP在2017年和BIUP中都被檢測到, 因此共檢測到14個一次有效分枝高度SNP。這些SNP的貢獻率為6.23%~18.36%, 其中2016年C04染色體上的S14_36535069位點貢獻率最大。株高和一次有效分枝高度在GWAS和遺傳連鎖定位結(jié)果中均沒有重合位點。

2.4 候選基因篩選

本文將所得的QTL置信區(qū)間內(nèi)的基因與關(guān)聯(lián)分析SNP位點上下游500 kb區(qū)間內(nèi)的基因比對[30], 初步篩選出24個與油菜株高和一次有效分枝高度相關(guān)的基因。并將其基因序列與擬南芥基因序列進行BLAST比對, 結(jié)合前人已報道的擬南芥同源基因功能, 篩選可能在本研究中發(fā)揮作用的候選基因(表4)。這些基因在擬南芥同源基因中參與植物生長發(fā)育, 影響細胞增殖、細胞擴增, 調(diào)節(jié)細胞周期、細胞壁形成, 參與赤霉素、亞精胺等合成代謝途徑、核糖體組成等。

表4 株高和一次有效分枝高度候選基因

PH: plant height; BH: the first branch height.

2.5 候選基因的驗證

挑選了其中5個株高候選基因進行驗證(圖4), 其中基因的相對表達量在株高較高的材料(YC4)中較高, 在株高較低的材料(YC15)中較低;基因的相對表達量在株高較低的材料中較高, 在株高較高的材料中較低。

從一次有效分枝高度的候選基因中, 挑選了7個進行驗證(圖5), 其中基因的相對表達量在一次有效分枝高度較高的材料(YC11)中較高, 在一次有效分枝高度較低的材料(YC4)中較低;基因的相對表達量在一次有效分枝高度較低的材料中較高, 在一次有效分枝高度較高的材料中較低。

圖4 株高候選基因在莖尖中的相對表達量

誤差線表示3次生物學(xué)重復(fù)的標準差。*和**分別表示基因在不同材料莖尖中的表達水平有顯著(< 0.05)和極顯著(< 0.01)差異。

The error bar shows the standard deviation of three biological replicates. * and ** indicate significantly different expression in stem apex to the control at< 0.05 and< 0.01, respectively.

圖5 一次有效分枝高度候選基因在莖尖中的相對表達量

誤差線表示3次生物學(xué)重復(fù)的標準差。*和**分別表示基因在不同材料莖尖中的表達水平有顯著(< 0.05)和極顯著(< 0.01)差異。

The error bar shows the standard deviation of three biological replicates. * and ** indicate significantly different expression in stem apex to the control at< 0.05 and< 0.01, respectively.

3 討論

株高和一次有效分枝高度是甘藍型油菜的2個重要株型性狀。株高是作物根頸部到頂部之間的距離, 也是影響作物倒伏的重要的因素。一次有效分枝高度是油菜下部第一個有效分枝生長著生點與子葉節(jié)之間的距離, 而分枝則作為角果生長的載體。適宜的株高和一次有效分枝高度, 有利于增強植株的抗倒伏性和提高機械化利用率, 進而提高產(chǎn)量并促進油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展。結(jié)莢厚度包含了所有產(chǎn)量構(gòu)成因素, 經(jīng)濟產(chǎn)量和收獲指數(shù)又是衡量產(chǎn)量的2個重要指標。

在試驗過程中, 對株高和一次有效分枝高度的2016年表型值、2017年表型值和2年的BLUP值都進行了QTL定位和GWAS分析。BLUP能較為有效地利用親緣表型信息、考慮不同世代的遺傳差異并矯正環(huán)境效應(yīng), 但由于實際中數(shù)據(jù)的不完整、模型的真實度及其方差組分等的真值未知等問題, 通過BLUP得到的校正值并不一定是最佳的無偏預(yù)測, 因此本試驗同時將3個值都進行了分析。兩性狀在2016年和2017年都未檢測到重復(fù)位點, 利用BLUP值檢測到的位點中, 發(fā)現(xiàn)與2017年有重復(fù)或交叉重疊, 沒有與2016年重疊。一方面可能是性狀本身受環(huán)境的影響較大, 另一方面可能是2016年材料缺失較為嚴重。

在重組自交系群體中檢測到的10個株高性狀QTL分別位于A03、A04和A09染色體上, 其中在2016年、2017年和BLIP值中檢測到的位于A09染色體上的QTL加性效應(yīng)均為負值, 說明A09染色體上的QTL增效作用均來自父本的等位基因位點, 且A09上的QTL數(shù)量最多, 各位點的貢獻率相對較大; 另外, 在2017年和基于BLUP值檢測中, A04染色體上有一個重復(fù)QTL (q-BLUP-PH-A04-2)。本研究中的q-2016PH-A03-1、q-2017PH-A09-1、q-2017PH- A09-2、q-2017PH-A09-3所在的區(qū)段在其他研究中也被重復(fù)檢測到[21,32-33]。在重組自交系群體中檢測到9個一次有效分枝高度性狀QTL, 分別位于A01、A02、A05、A09、C01和C05染色體, 其中q-BLUP- BH-C05-1所在區(qū)段與王嘉等[18]研究中被檢測到的區(qū)段有重疊區(qū)域。

在自然群體中, 株高性狀檢測到的A02染色體上的S2_4664084位點和A07染色體上的S7_20033861、S7_20050137等位點與Sun等[24]研究中的位點相近, 最近距離只有7.5 kb; A02染色體上有3個重復(fù)SNP, C02和C05染色體上各有1個重復(fù)SNP; 一次有效分枝高度性狀檢測到的A02染色體上的S2_6130942位點與Zheng等[23]研究中的位點相近。

在株高候選基因的擬南芥同源基因中, 檢測到的與細胞增殖、細胞擴增、細胞周期和細胞壁相關(guān)的基因有。編碼的阿拉伯半乳聚糖蛋白是參與植物生長發(fā)育的細胞外蛋白多糖[34]。與植物細胞壁形成和重建相關(guān), 在擬南芥的莖生長速率最快階段,表達增加[35], 由此推測其可能在控制油菜株高性狀過程中起關(guān)鍵作用。另外,是一個IAA特異調(diào)控的基因, 它在一定濃度IAA處理后表現(xiàn)下調(diào)[36-38]; 在一個細胞大小和數(shù)量嚴重減少的矮小擬南芥突變體中,下調(diào)[39]。是內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶(EGase)基因, 參與細胞伸長, 且與細胞壁的重組和生長有關(guān)[40], 由此推測在油菜主莖伸長過程中細胞伸長發(fā)揮作用。CEL1蛋白存在于正在發(fā)育伸長的幼嫩組織細胞壁中, 特別是在增厚的細胞壁中。CEL1在細胞擴增及增強內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶活性與纖維素生物合成方面具有重要作用[41]。編碼一個假定的絲氨酸/蘇氨酸激酶, 類似Hippo/STE20激酶, SIK1與MOB1相互作用, 調(diào)控擬南芥細胞生長和增值, 在突變體中, 細胞數(shù)量、細胞大小呈倍性水平降低[42]。編碼與CDC2A發(fā)生物理作用的d型細胞周期蛋白在種子萌發(fā)早期有關(guān)鍵作用并影響細胞分裂。受AUX1和SNLs調(diào)控, 在生長中發(fā)揮重要作用[43]; 其中在細胞分裂素受體突變體()的全基因組分析中發(fā)現(xiàn)下調(diào)表達[44], 因此該基因可能通過調(diào)控植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來控制油菜株高。

在一次有效分枝高度候選基因的擬南芥同源基因中,編碼一種新的亞精胺合成酶, 它是亞精胺合酶和的旁系同源物。和轉(zhuǎn)錄水平在根系中高于其他器官, 但在莖節(jié)間和胚芽以及根系中的表達都高; 另外發(fā)現(xiàn)可能參與ABA介導(dǎo)的脅迫反應(yīng)[45]。參與了擬南芥GA的生物合成和種子萌發(fā), 在AtTudor2 T-DNA插入突變體和AtTudor2 RNAi轉(zhuǎn)基因株系中, 用于GA生物合成的關(guān)鍵酶AtGA20ox3的表達明顯下調(diào)[46], 由此推測在油菜GA生物合成過程中起調(diào)控作用進而影響一次有效分枝高度。對L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯(L-GalL)表現(xiàn)特異性應(yīng)答, 其突變體表現(xiàn)根短且蓮座小,也對細胞壁的合成和延伸有影響[47]。編碼衰老相關(guān)的枯草蛋白酶,突變體的花序分枝和角果數(shù)量增多?？赡軈⑴c細胞外膜或質(zhì)膜的靶向定位或釋放質(zhì)外體信號, 并且在生殖發(fā)育和衰老的進程中抑制花序分枝和角果的產(chǎn)生, 從而最大限度地減少分枝和果實間對資源的競爭[48], 同時, 在生長后期的擬南芥莖中它被鑒定出是一種細胞壁蛋白, 而且是蛋白酶抑制劑[49]。編碼一種富含亮氨酸的重復(fù)蛋白, 該蛋白直接與MADS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子相互作用[50]。在誘導(dǎo)開花時, 莖尖分生組織轉(zhuǎn)化為花序分生組織, 其表達增加并調(diào)控開花時間[51]; 從誘導(dǎo)花到心皮和雄蕊成熟的過程中,也在特定的細胞中發(fā)揮重要作用, 它可能成為聯(lián)合MADS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子在生長發(fā)育調(diào)控和信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[52]。本研究探究了株高和一次有效分枝高度對產(chǎn)量的影響并且挖掘出可能與油菜株高和一次有效分枝高度相關(guān)的候選基因, 為油菜株型改良以及后續(xù)基因的研究提供理論依據(jù), 為下一步的功能驗證奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

結(jié)合遺傳連鎖定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析, 在A02、A03、A04、A07、C02、C06鑒定出與株高相關(guān)的位點, 并篩選出、等候選基因; 在A01、A02、A09、C02找到與一次有效分枝高度相關(guān)的位點, 篩選出、等候選基因, 并驗證了部分基因在極端材料中的表達情況。

附表 請見網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb. chinacrops. org/; 2) 中國知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuo wxb.aspx。

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Candidate genes screening for plant height and the first branch height based on QTL mapping and genome-wide association study in rapessed (L.)

HUO Qiang1,2,**, YANG Hong1,2,**, CHEN Zhi-You1,2, JIAN Hong-Ju1,2, QU Cun-Min1,2, LU Kun1,2, and LI Jia-Na1,2,*

1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University / Chongqing Engineering Research Center for Rapeseed, Chongqing 400715, China;2Academy of Agricultural Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China

Plant height (PH) and the first branch height (BH) are important agronomic traits closely related to thickness of pod canopy and harvest index of. There are many reports on quantitative trait locus (QTL) and genome-wide association study (GWAS) for PH, but few reports on QTL and GWAS localization and candidate gene screening for BH. In this study, QTLs for PH and BH using the 186 recombinant inbred lines (RIL) in the two environments of 2016 and 2017 were detected based on the high-density genetic linkage map. A total of eight PH QTLs located on chromosomes A03, A04, and A09 were detected in the two environments of 2016 and 2019, with the explained phenotypic variation of individual QTL range from 4.60% to 13.29%, among which overlapped QTLs (q-2017PH-A04-2 and q-BLUP-PH-A04-2) were detected both in 2017 and based on Best Linear Unbiased Prediction (BLUP). Nine BH QTLs located on chromosomes A01, A02, A05, A09, C01, and C05 were detected, in which a single QTL explained 5.12% to 19.10% of phenotypic variation. Among them, q-2017BH-A09-1, q-BLUP-BH-A09-2, and q-BLUP-BH-A09-3 were overlapped. GWAS for PH and BH was performed using 588 resequencing natural populations established by our previous study. A total of 50 SNPs associated with PH and 12 SNPs associated with BH were detected in two years. Thirteen PH candidate genes involved in cell proliferation, cell multiplication, cell cycle and cell wall activity and eleven BH candidate genes involved in the synthesis and metabolism of gibberellin and spermidine, ribosome composition, photosynthesis and germination were screened based on the physical locations of SNPs, and their expressions in extreme phenotypes by qRT-PCR. This result will provide a theoretical basis for improving plant architecture and subsequent functional studies of genes.

; plant height; first branch height; gene localization; candidate gene screening

本研究由重慶市民生工程主題專項(cstc2016shms-ztzx80020), 國家自然科學(xué)基金-云南聯(lián)合基金項目(U1302266)和國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD0100504-05)資助。

This study was supported by the Special Project of Chongqing People’s Livelihood (cstc2016shms-ztzx80020), the National-Yunnan United Natural Science Foundation of China (U1302266), and the National Key Research and Development Plan (2018YFD0100504-05).

10.3724/SP.J.1006.2020.94067

李加納, E-mail: ljn1950@swu.edu.cn, Tel: 023-68250701

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

霍強, E-mail: 354011524@qq.com; 楊鴻, E-mail: 583791495 @qq.com

2019-04-28;

2019-08-09;

2019-09-02.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190902.1554.006.html