小麥抗麥紅吸漿蟲基因標(biāo)記的開發(fā)與驗證

郝志明 耿妙苗 溫樹敏 閆桂軍 王睿輝,* 劉桂茹,*

小麥抗麥紅吸漿蟲基因標(biāo)記的開發(fā)與驗證

郝志明1耿妙苗1溫樹敏1閆桂軍2王睿輝1,*劉桂茹1,*

1河北農(nóng)業(yè)大學(xué) / 華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點實驗室, 河北保定 071000;2西澳大學(xué)農(nóng)業(yè)與環(huán)境學(xué)院, 澳大利亞尼德蘭茲 6009

麥紅吸漿蟲(Géhin)嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì), 選育和使用抗蟲品種是降低蟲害損失最安全有效的途徑, 利用抗蟲性連鎖或功能標(biāo)記對提高小麥抗蟲分子育種效率具有重要意義。在前期從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘到抗蟲性主效QTL () 6個相關(guān)差異基因的基礎(chǔ)上, 依據(jù)這些基因序列中存在的InDel和SNP, 分別開發(fā)了2個EST標(biāo)記和6個KASP標(biāo)記, 并在抗蟲性不同的一套重組近交系(RIL)和一套小麥品種中進(jìn)行了標(biāo)記的有效性驗證。所開發(fā)的8個標(biāo)記在抗、感蟲小麥親本間均表現(xiàn)出較好的多態(tài)性, 在RIL株系中的檢測有效率均達(dá)到90%左右; 除外, 這些標(biāo)記在供試高抗(56.3%~86.7%)和高感(85.7%~100.0%)小麥品種中的檢測有效率均較高, 可用于小麥種質(zhì)資源的抗蟲性篩選。同時發(fā)現(xiàn), 11個具備所有抗蟲標(biāo)記位點的抗蟲小麥品種, 多為審定時間較早或已停止使用的品種, 這使得結(jié)合標(biāo)記輔助選擇等手段鑒定和創(chuàng)新小麥抗蟲種質(zhì)資源的工作日益緊迫。

小麥; 麥紅吸漿蟲; 抗蟲相關(guān)基因; 功能標(biāo)記; SNP; EST; KASP

麥紅吸漿蟲(Géhin)是嚴(yán)重威脅小麥生產(chǎn)的重要害蟲, 吸漿蟲以幼蟲吸吮灌漿期小麥籽粒內(nèi)含物, 使籽粒秕瘦、粒重降低, 更易受病原菌侵染, 導(dǎo)致小麥籽粒品質(zhì)下降, 商品性受到嚴(yán)重影響。受害麥田產(chǎn)量損失在10%~60%之間, 嚴(yán)重時甚至顆粒無收[1-2]。在加拿大、美國、英國、波蘭、德國等小麥主產(chǎn)國, 均有吸漿蟲為害的報道[3-8]。在20世紀(jì)50年代和80年代, 我國小麥生產(chǎn)曾兩度遭遇吸漿蟲大面積為害, 損失巨大[9-10]。21世紀(jì)以來, 吸漿蟲的危害依然嚴(yán)重。2013—2018年, 小麥主產(chǎn)區(qū)年均蟲害發(fā)生面積超過2.0×106hm2(http://www. agri.gov.cn/), 成為影響華北、黃淮和西北等地小麥生產(chǎn)的重要蟲害(https://www.natesc.org.cn/)。生產(chǎn)上, 可通過藥物(農(nóng)藥)、農(nóng)藝措施(深翻、輪作等)、生物(性引誘劑、天敵等)和抗蟲品種防治麥紅吸漿蟲[4,11-12], 而以抗蟲品種的選育和利用最為經(jīng)濟(jì)有效[13]。在20世紀(jì), 西農(nóng)6028等抗蟲品種的使用對抑制蟲害起到了關(guān)鍵作用, 而抗蟲品種的缺乏也是當(dāng)前我國麥田吸漿蟲為害面積居高不下的重要原因[9]。但吸漿蟲危害的隱蔽性、毀滅性以及小麥對吸漿蟲抗性遺傳的復(fù)雜性, 使得小麥抗蟲育種進(jìn)展緩慢[14-15]。傳統(tǒng)的抗性育種單純依賴于表型鑒定結(jié)果, 極易受環(huán)境和人為因素的影響, 而且費時費力, 抗蟲品種的選育效率十分低下。分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection, MAS)技術(shù)在小麥等主要作物抗性育種中的應(yīng)用, 能夠顯著降低外界因素對抗蟲鑒定結(jié)果的干擾, 也有利于實現(xiàn)作物抗蟲性與農(nóng)藝性狀的同步改良, 進(jìn)而提高育種效率[16-17]。開發(fā)與抗麥紅吸漿蟲基因/QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記, 尤其是根據(jù)抗蟲候選基因或抗蟲基因序列上的突變位點開發(fā)成的目的基因標(biāo)記(gene-targeted markers, GTMs)和功能標(biāo)記(functional markers, FMs)[18-22], 不僅能夠提高抗蟲品種篩選及抗蟲性選擇的效率, 而且也有利于輔助實現(xiàn)不同來源抗蟲基因的聚合, 使小麥的抗蟲性更持久和穩(wěn)定[23]。

是最早發(fā)現(xiàn)的小麥抗麥紅吸漿蟲基因[24], 位于2BS上SSR標(biāo)記和與SCAR標(biāo)記之間2.5 cM的遺傳區(qū)間內(nèi)[3]。和已在北美和英國的小麥抗蟲性MAS育種中得以應(yīng)用[25]。Kassa等[26]利用含有基因的小麥親本組合構(gòu)建的DH群體, 又發(fā)現(xiàn)了7個由單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點開發(fā)的KASP標(biāo)記與抗蟲性緊密連鎖, 可用于鑒定抗/感蟲單倍型。也是當(dāng)前加拿大、英國和美國的抗蟲小麥品種中唯一被廣泛利用的抗蟲基因[27](http://midgetolerantwheat.ca/; http://www. bcpc.org/; https://www.usda.gov/)。過度依賴單一抗蟲基因, 大大增加了新毒性吸漿蟲生物型出現(xiàn)的風(fēng)險, 也促使人們尋找新的抗蟲基因資源[28]。

中國小麥品種可能攜帶了不同的麥紅吸漿蟲抗性基因。我國抗吸漿蟲小麥品種多具有南大2419、西農(nóng)6028和洛夫林10號等的血緣[9,14,29-32], 晉麥31、咸農(nóng)151、武農(nóng)99、鄭州8號、冀麥23、冀麥24、河農(nóng)215、荊麥66等抗蟲品種的系譜中都或多或少攜帶有上述品種的血緣[9,14,30-31], 與國外抗蟲小麥品種的系譜不同[3,24,27-28,33-34]。北美等地小麥的抗蟲基因或QTL被定位于2B ()[24]和1A ()[28]染色體上, 以為主要抗源。我們發(fā)現(xiàn), 來自我國小麥品種的抗蟲性主要被定位于4A染色體()[14,35]。基因的連鎖標(biāo)記(、和)雖已被應(yīng)用于當(dāng)?shù)匦←溈瓜x品種的培育, 但這些標(biāo)記在我國小麥品種中要么不具多態(tài)性, 要么檢測結(jié)果與抗蟲性不吻合。阿魏酸等多酚類物質(zhì)曾被認(rèn)為是小麥籽粒中主要的抗蟲成分[36-37], 與基因的抗性有關(guān)[3,26]。然而, 我們測定了4A主效QTL近等基因系的阿魏酸含量, 未能發(fā)現(xiàn)這種差異的存在?？Х人?-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)是阿魏酸合成途徑中的關(guān)鍵酶[38](https://www.kegg.jp/)。我們從吸漿蟲脅迫下的小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出3個COMT同源基因, 但在抗、感小麥親本間均不存在SNP。上述研究表明, 我國小麥品種可能存在新的吸漿蟲抗性遺傳機(jī)制。鑒于此, 開發(fā)我國小麥種質(zhì)中與抗蟲位點緊密連鎖甚至共分離的分子標(biāo)記和功能標(biāo)記, 不但能更好地滿足我國抗蟲性MAS育種的需要, 也有助于對我國小麥種質(zhì)資源抗蟲性的準(zhǔn)確鑒定。

隨著測序技術(shù)的改進(jìn)、成本的降低, 以及多個物種參考基因組序列(包括中國春小麥參考基因組序列)的公開, 對基因組中大量序列變異和結(jié)構(gòu)變異的挖掘成為可能, 對直接利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)或結(jié)合集群分離分析法(bulked segregant analysis, BSA)的思路進(jìn)行標(biāo)記開發(fā)變得更加便利[39]。王智蘭等[40]對抗旱相關(guān)基因進(jìn)行序列檢測和分析, 根據(jù)該基因在不同小麥品種中存在的多態(tài)性位點開發(fā)了功能標(biāo)記。Wu等[41]從轉(zhuǎn)錄組和芯片測序數(shù)據(jù)中挖掘到235個染色體特異性SNP位點, 并開發(fā)成KASP標(biāo)記, 成功用于基因的精細(xì)定位。徐曉丹[42]利用BSR-Seq方法開發(fā)了SNP標(biāo)記, 其中2個SNP標(biāo)記對和D檢測的有效率達(dá)97%和100%。

在前期研究中, 我們采用BSR-Seq[43]方法和QTL-Seq分析[44]的思路, 結(jié)合基因功能注釋信息及qRT-PCR表達(dá)譜分析, 從抗、感蟲小麥樣本(含雙親、極端混池、重組近交系、近等基因系)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中, 獲得了位于4AL主效QTL[14,35]區(qū)間的6個抗蟲性相關(guān)差異基因, 其中基因和不僅在全部抗、感RIL株系及NIL株系間的表達(dá)水平差異顯著, 而且顯著富集于與抗蟲性相關(guān)的異黃酮生物合成代謝通路(isoflavonoid biosynthesis pathway)中[45-46]。因此, 本研究以上述6個抗蟲相關(guān)基因及其SNP和插入缺失位點(InDel)為基礎(chǔ), 設(shè)計和開發(fā)目的基因標(biāo)記, 并利用抗、感蟲小麥RIL系和小麥品種驗證了這些標(biāo)記在小麥吸漿蟲抗性鑒定中的可用性。

1 材料與方法

1.1 植物材料及DNA提取

用于標(biāo)記驗證的植物材料包括小麥親本6218 (感蟲)、冀麥24 (抗蟲), 從6218/冀麥24重組近交系(RIL)群體中選擇的92個抗、感吸漿蟲株系以及具有不同抗性水平的95個小麥品種。其中, RIL株系來自小麥親本6218與冀麥24的F2代群體的單粒傳自交后代, 經(jīng)多年抗蟲鑒定, 表型穩(wěn)定。供試小麥材料分別在2014—2015年度、2015—2016年度和2016—2017年度種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)育種中心蟲圃。每個材料種植1行, 每行40粒, 行長20 cm, 行距20 cm[14]。完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計, 3次重復(fù)。供試材料的名稱及表型見表1。采用CTAB法[47]提取各供試材料的基因組DNA。

1.2 供試小麥材料的抗蟲性鑒定

利用抗性指數(shù)(resistance index, RI)評價供試小麥材料的抗蟲性[14]。在小麥灌漿至乳熟期, 取每重復(fù)、每株系10~15個穗子, 密封于紙袋中, 帶回室內(nèi)計數(shù)籽粒上的蟲子。根據(jù)存在的吸漿蟲數(shù)目, 將待鑒定小麥籽粒抗性分為5級。0級為籽粒上無蟲; 1級為籽粒上有蟲1頭; 2級為籽粒上有蟲2頭; 3級為籽粒上有蟲3頭; 4級為籽粒上的蟲數(shù)≥4頭。根據(jù)以下公式計算每個株系的估計損失率()[2]。

(%) = Σ() / 4Σ× 100%

式中,為相應(yīng)籽粒的抗性級別,為各級別的籽粒數(shù)目。

用每個株系的估計損失率(L)除以全部參試株系(品種)的平均估計損失率(ML), 計算出抗性指數(shù)(RI)來確定株系的抗性分級。當(dāng)同一株系在不同重復(fù)間的鑒定結(jié)果存在較大差異時, 以最重重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行L、RI值的估算[2]。基于RI值將供試小麥材料的抗性分為免疫(RI=0) (immune, I)、高抗(0.01≤RI<0.19) (highly resistant, HR)、中抗(0.20≤RI<0.49)(moderately resistant, MR)、低抗(0.50≤RI<0.99) (lowly resistant, LR)、感蟲(1.00≤RI<1.50) (susceptible, S)和高感(RI≥1.50)(highly susceptible, HS)。

1.3 抗蟲差異基因序列檢測

以前期研究中獲得的6個抗蟲相關(guān)基因、、、、和進(jìn)行抗蟲標(biāo)記的開發(fā)。根據(jù)與中國春參考序列(IWGSC RefSeq v1.0, https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)的比對結(jié)果, 提取上述基因的側(cè)翼序列。用Primer5軟件設(shè)計引物。用高保真酶在小麥親本冀麥24和6218中擴(kuò)增目的基因。10 μL PCR體系包括模板DNA 50 ng、正反引物各0.4 μmol L–1、1× Pfu PCR MasterMix (天根生化科技(北京)有限公司)。PCR條件為: (1) 94℃, 預(yù)變性3 min; (2) 94℃, 30 s; 55℃, 30 s; 72℃, 2 min; 共35個循環(huán); (3) 72℃終延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離, 回收目的條帶, 送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序。將測序結(jié)果與中國春(IWGSCv1.0)和百農(nóng)AK58 (v4.24)的基因組序列進(jìn)行比對。

1.4 抗蟲標(biāo)記的開發(fā)

1.4.1 EST (expressed sequence tag, 表達(dá)序列標(biāo)簽)標(biāo)記 根據(jù)測序結(jié)果, 分析目標(biāo)基因在小麥親本間的InDel, 并根據(jù)InDel兩側(cè)翼各200 bp的序列設(shè)計引物。采用普通DNA聚合酶(2× EsMasterMix)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。10 μL PCR體系包括模板DNA 50 ng、正反引物各0.4 μmol L–1、1× EsMasterMix (北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。反應(yīng)程序為: (1) 94℃, 預(yù)變性5 min; (2) 94℃, 30 s; 57℃, 30 s; 72℃, 1 min; 共35個循環(huán); (3) 72℃終延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在30%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳, 銀染顯色。

1.4.2 KASP (kompetitive allele-specific PCR, 競爭性等位特異PCR)標(biāo)記 以抗蟲相關(guān)基因在冀麥24 (高抗吸漿蟲)與6218 (高感吸漿蟲)、百農(nóng)AK58 (高感吸漿蟲)間均表現(xiàn)出多態(tài)性的SNP位點及其側(cè)翼序列與小麥參考序列(IWGSCv1.0)進(jìn)行比對, 挑選出在基因組中具有特異序列或其中一種SNP等位型(突變類型)在參考基因組中不存在的SNP, 進(jìn)行KASP標(biāo)記的設(shè)計與開發(fā)。提取選定SNP在參考基因組中的側(cè)翼序列(>200 bp), 由艾吉析科技(上海)有限公司(LGC Science Shanghai Ltd.)進(jìn)行引物的設(shè)計與合成, 在兩條KASP正向引物序列的5′端加上FAM (6-carboxy-fluorescein)或HEX (Hexachlorofluorescein)熒光基團(tuán)的接頭序列。參照公司提供的程序進(jìn)行KASP標(biāo)記的分型試驗。反應(yīng)體系總體積為3 μL, 含KASP (V4.0) 2× Mastermix 1.5 μL, 引物mix (72×) 0.0417 μL, DNA模板50~100 ng左右。PCR為Touchdown反應(yīng)程序, 94℃變性15 min; 94℃變性20 s, 68℃退火60 s, 每循環(huán)一次下降0.6℃, 10個循環(huán); 94℃變性20 s, 62℃退火60 s, 26個循環(huán)。PCR擴(kuò)增完畢后, 利用LGC系統(tǒng)的SNPline平臺進(jìn)行SNP分型檢測, 利用Kraken (v16.3.16.16288)軟件分析掃描數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列分析

6個抗蟲相關(guān)基因在抗、感小麥親本冀麥24和6218中均能擴(kuò)增到目的片段。除外, 其他5個基因在抗、感小麥親本中的序列與參考基因組序列(中國春和百農(nóng)AK58)相符;在抗蟲親本冀麥24的序列與參考基因組序列相符, 而在感蟲親本6218的序列與參考基因組序列差異較大。

上述基因在抗、感小麥親本間均存在SNP, 且都包含使氨基酸發(fā)生改變的非同義突變位點(圖1)。由于6218和百農(nóng)AK58均高感麥紅吸漿蟲, 因此那些同時存在于冀麥24與6218之間、冀麥24與百農(nóng)AK58之間的多態(tài)性SNP, 被視為高可信度SNP?；蛑写嬖?個非同義突變SNP, 其中3個為可信度較高的SNP。基因中存在6個非同義突變SNP, 其中4個為可信度較高的SNP。存在1個高可信度的非同義突變的SNP。存在SNP和插入/缺失(InDel)各1個, 其中抗蟲品種(冀麥24)中存在一個12 bp的插入, 而感蟲品種(系)(6218和百農(nóng)AK58)則缺失了這12 bp。由于未能獲得在感蟲親本(6218)中的擴(kuò)增序列, 故根據(jù)該基因在抗蟲親本冀麥24與感蟲品種百農(nóng)AK58間存在的2個SNP位點進(jìn)行標(biāo)記開發(fā)。在抗、感小麥親本中分別存在1個4 bp和1 bp的插入, 由于這種插入可能導(dǎo)致其后的讀碼框發(fā)生改變(移碼突變), 因此重新預(yù)測了該基因在抗、感蟲小麥親本中的所有開放閱讀框(https://web.expasy.org/), 分別獲得在抗、感小麥親本中使編碼蛋白仍具有絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)結(jié)構(gòu)域的編碼序列, 發(fā)現(xiàn)在編碼區(qū)序列上存在11個非同義突變位點, 其中1個為可信度較高的SNP; 此外, 該基因在冀麥24的基因下游處存在一個29 bp的插入, 而在感蟲親本則缺失了這29 bp的序列。

以這些高可信度的SNP位點及其側(cè)翼序列與小麥參考基因組序列(IWGSCv1.0)的比對結(jié)果, 對基因組特異性或突變等位型特異性(即僅在目的基因序列中的特定堿基位置上具有抗蟲親本的突變類型, 而在參考基因組中全部同源序列對應(yīng)的堿基位點上均不存在該突變類型)的SNP, 進(jìn)行KASP標(biāo)記開發(fā)。根據(jù)比對結(jié)果, 選擇基因上存在的2個特異性位點,、、和上存在的各1個特異性位點, 共6個可信度較高的特異性SNP用于KASP標(biāo)記的開發(fā), 選擇基因和序列中存在的InDel, 用于EST標(biāo)記的開發(fā)。

2.2 抗蟲標(biāo)記的開發(fā)及多態(tài)性檢測

根據(jù)上述基因中存在的SNP和InDel, 分別設(shè)計出6個KASP標(biāo)記(、、、、和)和2個EST標(biāo)記(和), 用這些標(biāo)記檢測了抗、感蟲小麥親本、RIL株系和小麥品種。2個EST標(biāo)記在小麥親本間均表現(xiàn)出多態(tài)性, 其中在抗、感蟲親本中分別擴(kuò)增出173 bp和161 bp的片段,分別擴(kuò)增出211 bp和182 bp的片段(圖2)。6個KASP標(biāo)記在抗、感蟲小麥親本間亦具有多態(tài)性(圖3)。標(biāo)記、、和在小麥親本中均為純合分型, 在抗蟲親本中分別為A:A、T:T、T:T和G:G, 在感蟲親本中分別為C:C、G:G、A:A和A:A。和在抗蟲小麥親本中為雜合分型(分別為T:G和C:G), 在感蟲親本中表現(xiàn)純合分型(均為G:G)。將和的2條正向引物序列與小麥參考基因組序列(IWGSCv1.0)比對后發(fā)現(xiàn), 感蟲位點對應(yīng)序列在參考基因組中均存在多個匹配(數(shù)據(jù)未列出)。因此, 在抗、感蟲小麥親本中, 這2個標(biāo)記均能檢測出感蟲等位型; 而抗蟲位點對應(yīng)序列與參考基因組間不存在3′末端匹配, 即存在于抗蟲小麥品種冀麥24中的突變型位點在參考基因組中不存在, 因此在不具有該突變的材料中無法檢測到抗蟲標(biāo)記位點。綜上, 這些標(biāo)記可用于檢測小麥品種或株系中4A染色體抗蟲QTL。

圖1 6個差異基因在抗(冀麥24)、感(6218)小麥親本及中國春參考序列之間的比對結(jié)果

藍(lán)色或紅色堿基代表非同義突變的SNP位點或插入缺失, 其中藍(lán)色堿基為可信度較高的SNPs, 并以箭頭標(biāo)注。

Red or blue font letters represent non-synonymous SNPs and InDels present in the genes. Blue letters with arrowheads represent the SNPs with high confidence.

2.3 EST、KASP標(biāo)記在小麥抗、感蟲RIL系中的檢測結(jié)果

用這些標(biāo)記檢測了47個抗蟲(RI= 0.0330~ 0.4673)、45個感蟲(RI= 1.2325~6.3697) RIL系(表1)。所有KASP標(biāo)記和EST標(biāo)記在抗、感蟲RIL株系中的檢測結(jié)果(帶型或分型)與相應(yīng)抗、感小麥親本的吻合度較高。KASP標(biāo)記能夠在85%以上的抗蟲株系中檢測出抗蟲標(biāo)記位點(其中標(biāo)記和為雜合分型), 在95%以上的感蟲株系中檢測出感蟲標(biāo)記位點(表2)。兩個EST標(biāo)記, 均能夠在85%以上的抗蟲株系中擴(kuò)增出與抗蟲親本一致的帶型, 在超過90%的感蟲株系中擴(kuò)增出與感蟲親本一致的帶型(表2)。如果忽略個別標(biāo)記在個別株系中的缺失情況(標(biāo)記、、和均分別在2個RIL株系中缺失, 標(biāo)記在4個RIL株系中存在缺失), KASP標(biāo)記在所檢測RIL株系間的抗、感分型結(jié)果完全一致, 說明這些標(biāo)記均應(yīng)位于同一個染色體交換區(qū)段內(nèi), 并且可能與抗蟲基因緊密連鎖或共分離。

圖2 EST標(biāo)記E1-2 (A)和E10-10 (B)在抗、感蟲小麥親本及部分RIL系中的擴(kuò)增結(jié)果

M: 分子量marker (pBR322/I酶切片段); 1: 感蟲小麥親本6218; 2: 抗蟲小麥親本冀麥24; 3~14: 感蟲株系(RIL-16、RIL-19、RIL-20、RIL-21、RIL-25、RIL-29、RIL-45、RIL-102、RIL-113、RIL-119、RIL-125和RIL-139); 15~26: 抗蟲株系(RIL-7、RIL-12、RIL-18、RIL-23、RIL-64、RIL-73、RIL-91、RIL-115、RIL-134、RIL-156、RIL-169和RIL-170)。

M: Molecular marker (restriction fragments of plasmiddigested withI endonuclease); 1: Susceptible wheat parent ‘6218’; 2: Resistant parent ‘Jimai 24’; 3–14: Susceptible lines (RIL-16, RIL-19, RIL-20, RIL-21, RIL-25, RIL-29, RIL-45, RIL-102, RIL-113, RIL-119, RIL-125, and RIL-139); 15–26: Resistant lines (RIL-7, RIL-12, RIL-18, RIL-23, RIL-64, RIL-73, RIL-91, RIL-115, RIL-134, RIL-156, RIL-169, and RIL-170).

圖3 KASP標(biāo)記在抗、感蟲小麥親本、92個RIL系和95個小麥品種中的分型結(jié)果

紅色點, HEX基因型; 藍(lán)色點, FAM基因型; 綠色點, 雜合基因型; 粉色點, 缺失; 黑色點, 對照. 圖中A~F分別為KASP標(biāo)記、、、、和的分型結(jié)果。

Red dots represent the HEX-type allele; blue dots, the FAM-type allele; green dots, the heterozygous-type allele; pink dots, undetected; black dots, the NTC (non-template control); A to F refer to genotypes for,,,,, and, respectively.

表1 供試小麥親本與RIL株系的表型

表2 EST標(biāo)記和KASP標(biāo)記在供試RIL株系中的標(biāo)記基因型及比例

a: 物理位置為標(biāo)記在4A染色體上的物理位置; A: 與抗蟲親本冀麥24一致的基因型; B: 與感蟲親本6218一致的基因型; H: 雜合基因型。

a: Physical position refers to the physical position of EST or KASP markers on chromosome 4A; A: genotype identical to the resistant wheat parent ‘Jimai 24’; B: genotype identical to the susceptible wheat parent ‘6218’; H: heterozygous genotype.

2.4 EST、KASP標(biāo)記在不同抗性小麥品種中的檢測結(jié)果

利用95個不同抗性的小麥品種為材料(表3), 對上述標(biāo)記的適用性進(jìn)行了檢測。標(biāo)記能夠在37.2%的抗蟲小麥品種中擴(kuò)增出純合抗蟲帶型, 在80%的感蟲品種中擴(kuò)增出純合感蟲帶型(表4)。由于在感蟲小麥品種中的檢測有效率較高(為80.0%), 因此該標(biāo)記對具有抗蟲標(biāo)記位點小麥品種的鑒定準(zhǔn)確率為80%左右。在對小麥品種進(jìn)行檢測時, 則只要在測試品種中檢測出抗蟲帶型, 那么該品種為抗蟲品種(即具有抗蟲位點)的可能性在80%左右, 可作為篩選抗蟲種質(zhì)資源的標(biāo)記。而標(biāo)記在抗、感蟲小麥品種中所檢測出的抗、感基因型所占比例相近(表4), 不能區(qū)分抗、感蟲小麥品種, 因此該標(biāo)記不能用于鑒定供試小麥品種的抗蟲性。

KASP標(biāo)記、和在超過30% (分別為30.8%、31.6%和37.5%)的抗蟲小麥品種中檢測到純合抗蟲標(biāo)記位點, 在85%以上(分別為92.3%、92.3%和87.2%)的感蟲小麥品種中檢測到純合感蟲標(biāo)記位點(表4)。這說明, 如果能在品種中檢測到這些抗蟲標(biāo)記位點, 則該供試品種為抗蟲品種(即具有抗蟲位點)的可能性高于85%、為感蟲品種(基因型與表型不相符)的概率低于15%, 因此這3個標(biāo)記可以較好地篩選具有位點的抗蟲小麥種質(zhì)。

標(biāo)記, 能夠在62.5%的抗蟲品種中檢測出純合抗蟲標(biāo)記位點, 在76.9%的感蟲品種中檢測出純合感蟲標(biāo)記位點(表4), 檢測有效率為70.4%, 因此該標(biāo)記亦可作為品種抗蟲性的篩選標(biāo)記。

標(biāo)記和在抗蟲小麥親本中為雜合分型。分型結(jié)果表明, 2個標(biāo)記能夠在超過30% (分別為35.0%和38.5%)的抗蟲小麥品種中檢測到抗蟲標(biāo)記位點, 在超過75% (分別為92.3%和79.2%)的感蟲品種中檢測到純合感蟲標(biāo)記位點(表4), 即, 如果和檢測到抗蟲標(biāo)記位點, 則該供試品種為抗蟲品種(即具有抗蟲位點)的可能性在75%以上, 而為感蟲品種(基因型與表型不相符)的概率不到10%和25%。因此標(biāo)記比能更好地檢測出具有位點的抗蟲小麥種質(zhì)。

進(jìn)一步分析7個標(biāo)記、、、、、和在各不同抗性小麥品種的分型結(jié)果(不計檢測缺失的品種)表明, 這些標(biāo)記在高抗小麥品種中的平均檢測有效率為64.7% (56.3%~86.7%), 在中抗品種中的平均檢測有效率為19.1% (13.0%~41.2%), 在感蟲品種中為66.7% (50.0%~75.0%), 在高感品種中為94.1% (85.7%~100.0%) (圖4)。同樣, 如果只考慮高抗和高感兩類極端類型品種, 則這7個標(biāo)記對抗性品種的平均檢測有效率為64.7% (56.3%~86.7%), 低于對抗蟲RIL系的檢測有效率(平均86.8%, 范圍85.1%~ 88.6%); 對感蟲品種的平均檢測有效率為94.1% (85.7%~100.0%), 與對感蟲RIL系的檢測有效率接近(平均95.5%, 范圍95.5%~95.6%)(圖4)。標(biāo)記在RIL系間檢測率較高, 與RIL系具有較為一致的遺傳背景密不可分, 而標(biāo)記在高抗RIL系間、高抗品種間的檢測有效率低于對應(yīng)高感RIL系和高感品種的事實, 再次說明小麥對麥紅吸漿蟲抗性的數(shù)量遺傳特征。

表3 供試小麥品種的表型

根據(jù)3個檢測率較高的標(biāo)記、和在95個小麥品種中的分型結(jié)果可以看出, 這3個標(biāo)記在11個抗蟲小麥品種(RI = 0.0235~0.4798)中的分型與抗蟲親本冀麥24的分型完全一致(表5), 這11個品種分別是中農(nóng)28 (1932年引進(jìn)種質(zhì))、西農(nóng)6028 (1956年審定, 下同)、豐產(chǎn)2號(1968)、晉麥33 (1985)、冀麥23 (1986)、河農(nóng)215 (與冀麥23、冀麥24互為姊妹系)、邯麥9號(2003)、石家莊11號(2003)、石麥12號(2004)、河農(nóng)4198(2005)和河農(nóng)6049 (2008)。

綜合EST和KASP標(biāo)記的檢測結(jié)果, 共有20個小麥品種[包括14個抗蟲品種, 5個感蟲或中間型(低抗)品種, 1個無表型鑒定結(jié)果的品種(咸農(nóng)39)]都被檢測出具有較多的抗蟲標(biāo)記位點(分型與帶型同抗蟲親本冀麥24), 且這20份品種在任何標(biāo)記位點上均未被檢測出感蟲標(biāo)記位點, 因此說明這些材料在4AL抗蟲標(biāo)記位點附近的基因組區(qū)段可能是相同的。而在一些感蟲小麥品種被檢測出具有文中所有抗蟲位點的現(xiàn)象, 也間接說明了基因組內(nèi)可能有與4AL抗蟲主效位點互作的基因(如抑制效應(yīng)的上位基因等)存在。

表4 EST標(biāo)記和KASP標(biāo)記在供試小麥品種中的標(biāo)記基因型及比例

A: 與抗蟲親本冀麥24一致的基因型; B: 與感蟲親本6218一致的基因型; H: 雜合基因型。

A: genotype identical to the resistant wheat parent ‘Jimai 24’; B: genotype identical to the susceptible wheat parent ‘6218’; H: heterozygous genotype.

表5 在7個抗性標(biāo)記位點上完全一致的11個小麥品種的抗蟲性及其標(biāo)記基因型

a: 與抗蟲親本冀麥24一致的基因型。

a: genotype identical to the resistant wheat parent ‘Jimai 24’.

圖4 抗(47個)、感(45個)蟲小麥RIL株系、高抗品種(19個)、中抗品種(24個)、低抗品種(12個)、感蟲品種(12個)和高感品種(28個)中的標(biāo)記基因型所占比例

3 討論

3.1 功能標(biāo)記的檢測有效性

功能標(biāo)記是一類可通過對個體基因型的間接檢測來反應(yīng)目標(biāo)性狀(表型)的分子標(biāo)記, 理論上對表型的檢測率應(yīng)達(dá)到或接近100%, 能夠準(zhǔn)確檢測作物種質(zhì)資源是否含有目的基因[18,20,22]。但由于影響表型變異的基因或功能位點可能不止一個, 實際開發(fā)出的功能標(biāo)記不一定均能在全部參試材料中獲得基因型與相應(yīng)的表型完全一致的結(jié)果, 這對復(fù)雜性狀尤為明顯。伍玲等用//位點的功能標(biāo)記[48]和、、、、[49], 在273份CIMMYT來源的小麥材料中獲得高達(dá)96.7%的標(biāo)記檢測有效率; 但將這些標(biāo)記用于檢測中國小麥地方品種時卻發(fā)現(xiàn), 25.8%的標(biāo)記陽性品種卻表現(xiàn)完全感病[50]。張帆等以抗旱相關(guān)基因開發(fā)出的4個顯性互補(bǔ)標(biāo)記, 雖然能夠?qū)ξ覈?50份小麥品種的種子萌發(fā)期抗旱性進(jìn)行檢測, 但仍有6%的弱抗旱性材料被檢測為抗旱基因型, 2%的抗旱性較強(qiáng)材料被檢測為弱抗旱基因型[51]。在用功能標(biāo)記檢測小麥多酚氧化酶(PPO)、面粉黃色素含量時, 也發(fā)現(xiàn)功能標(biāo)記檢測與表型不完全一致的現(xiàn)象[52-55]。這些現(xiàn)象可歸因于目的位點上其他變異的存在(包括互作位點)影響到目的基因的表達(dá)[50-51], 同時也不能排除品種遺傳背景差異和環(huán)境因素的影響[56]。本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘到的抗吸漿蟲差異基因, 開發(fā)出8個抗蟲性基因標(biāo)記(2個EST和6個KASP標(biāo)記)。這些標(biāo)記在遺傳背景較近的RIL系中能夠達(dá)到很高的檢測有效率(~90%), 在遺傳背景差異較大的小麥品種中, 這些標(biāo)記(不包括)在感蟲品種中的檢測有效率(76.9%~92.3%)遠(yuǎn)高于在抗蟲品種中的檢測有效率(30.8%~62.5%), 這說明抗蟲位點()之外的其他抗蟲基因、互作因子[50-51]和遺傳背景的差異均可能對標(biāo)記的檢測效率產(chǎn)生影響。因此, 本研究開發(fā)的這7個標(biāo)記可應(yīng)用于選擇小麥種質(zhì)資源位點的抗蟲等位基因型, 為提高小麥吸漿蟲抗性的重要手段。同時, 鑒定、開發(fā)小麥基因組中存在的其他遺傳因子及標(biāo)記, 對于揭示小麥抗吸漿蟲分子機(jī)制和提高小麥抗蟲分子標(biāo)記的檢測效率也將十分重要。

3.2 抗蟲相關(guān)標(biāo)記的應(yīng)用前景及展望

本研究將RNA-Seq技術(shù)和BSA分析思路應(yīng)用于小麥抗吸漿蟲差異基因發(fā)掘及標(biāo)記開發(fā)工作, 從多組抗、感吸漿蟲小麥材料轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)掘的差異基因, 經(jīng)qRT-PCR、KEGG Pathway及基因功能注釋等分析過程, 初步證實了6個差異基因可能與抗蟲性相關(guān); 并根據(jù)這些基因在小麥抗、感親本之間存在的序列差異, 開發(fā)出8個標(biāo)記, 能夠較好地分辨抗/感RIL株系。其中7個標(biāo)記、、、、、和在供試感蟲小麥品種中的檢測有效率較高(76.9%~92.3%, 表4), 如果只考慮高感品種, 檢測有效率則更高(85.7%~ 100.0%, 圖4)。理論上說, 感蟲品種不應(yīng)攜帶任何抗蟲等位基因, 如果在某些感蟲品種中存在抗性位點, 那么該位點就不能完全準(zhǔn)確預(yù)測品種的抗蟲性。因此, 能夠準(zhǔn)確預(yù)測小麥品種抗蟲性、并可應(yīng)用于MAS育種中的標(biāo)記, 應(yīng)在感蟲品種中的檢測有效率高(盡可能達(dá)到100%)。本研究中, 標(biāo)記、和在供試抗蟲小麥品種中的檢測有效率為30%左右(30.8%~35.0%), 在供試感蟲小麥品種中的檢測有效率超過90% (為92.3%), 如果用這3個標(biāo)記從小麥品種中檢測出全部抗蟲標(biāo)記位點, 則該品種為抗蟲品種(具有)的可能性應(yīng)超過90%, 因此這3個標(biāo)記可較好地作為篩選具有抗蟲位點小麥種質(zhì)的標(biāo)記。同時, 從圖4也可看出, 小麥品種的吸漿蟲抗性越好, 所用標(biāo)記的抗蟲等位型(resistant alleles)所占比例相對越高, 因此這3個標(biāo)記可以很好地用于品種是否具有抗蟲位點的檢測, 這對我們鑒別抗蟲種質(zhì)以及早代育種材料的抗蟲性具有重要意義。本研究中, 供試小麥品種中有11個抗蟲品種被檢測到攜帶了這3個標(biāo)記的全部抗蟲等位基因(表5), 這些品種多為生產(chǎn)上已經(jīng)停止推廣的老品種, 比較近的品種其審定時間也在10年以上, 因此如何更有效地使用比較老的小麥種質(zhì)創(chuàng)新小麥抗蟲資源, 任務(wù)十分迫切。

這種基于混池轉(zhuǎn)錄組測序(BSR-Seq)并結(jié)合生物信息學(xué)工具、qRT-PCR、基因測序和遺傳定位信息等的方法, 不但可快速挖掘用于開發(fā)標(biāo)記的候選基因及功能位點, 提升潛在功能標(biāo)記開發(fā)速度, 還能縮小差異基因范圍、提升標(biāo)記與目標(biāo)性狀緊密相關(guān)的幾率。雖然我們目前的工作尚未實現(xiàn)對小麥抗蟲主效QTL的圖位克隆, 但利用該方法所獲得潛在候選基因的抗蟲相關(guān)標(biāo)記, 在不同作圖群體中被證明是有用的, 不僅能被用于對小麥種質(zhì)資源抗蟲性的輔助鑒定, 同時可對小麥抗吸漿蟲主效QTL的精細(xì)定位和圖位克隆提供重要幫助。

4 結(jié)論

基于6個小麥抗吸漿蟲相關(guān)基因序列中存在的差異位點, 成功設(shè)計并開發(fā)了8個基因標(biāo)記, 這些標(biāo)記在抗、感小麥RIL株系間的分型結(jié)果與對應(yīng)株系的抗蟲性水平相符度在90%左右, 在不同小麥品種中的檢測有效率變異較大。標(biāo)記、和能夠從超過30% (30.8%~35.0%)抗蟲小麥品種中檢測到抗蟲等位型, 從90% (92.3%)以上的感蟲品種中檢測到感蟲等位型, 對于那些均能檢測到抗蟲標(biāo)記等位型的小麥品種, 其具有4AL抗蟲主效位點的可能性超過90% (為92.3%), 可用于小麥抗蟲性種質(zhì)資源篩選和分子標(biāo)記輔助育種。此外, 包含全部抗蟲等位標(biāo)記的11個抗蟲小麥品種, 多已或即將停止推廣, 這為如何有效利用老品種的抗蟲性創(chuàng)新小麥新種質(zhì)提出了十分迫切的要求。

致謝: 感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊欣明研究員提供了部分小麥種質(zhì), 感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所賈繼增研究員、趙光耀研究員提供了百農(nóng)AK58 (v4.24)參考基因組序列并進(jìn)行的相關(guān)分析, 感謝本課題組張力菁、章悅等在抗蟲鑒定等方面的大力幫助。

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Development and validation of markers linked to genes resistant toin wheat

HAO Zhi-Ming1, GENG Miao-Miao1, WEN Shu-Min1, YAN Gui-Jun2, WANG Rui-Hui1,*, and LIU Gui-Ru1,*

1Hebei Agricultural University / North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Education Ministry, Baoding 071000, Hebei, China;2School of Agriculture and Environment, the University of Western Australia, Nedlands 6009, Australia

Orange wheat blossom midge (OWBM) (Géhin) has seriously reduced wheat production and processing quality. Breeding midge-resistant wheat has been considered the most effective way to reduce kernel losses caused by OWBM, and marker-assisted selection (MAS) strategy in crop breeding using linked or functional markers of target trait of interest is of great importance in improving breeding efficiency. Based on the InDels and SNPs within the sequences of six midge resistance-related genes discovered from transcriptome data in the previously mapped major QTL () region, we developed and validated two EST and six KASP markers in a panel of recombinant inbred lines (RILs) and a panel of wheat cultivars with different OWBM resistance levels. These markers were polymorphic between the resistant and susceptible wheat parents, and approximately 90% of RIL lines showed the corresponding marker-based genotypes with their phenotypes. Except for, the other seven markers had higher detection efficiency in highly resistant (56.3%?86.7%) and in highly susceptible (85.7%?100.0%) wheat cultivars, thus making them applicable for screening midge-resistant wheat germplasm with locus. Among the eleven midge-resistant wheat cultivars with all resistance alleles for the seven markers developed, most were historical wheat cultivars, and rarely used in the present production, which suggests how to use old cultivars in wheat germplasm identification and enhancement on midge-resistance through MAS is urgent.

bread wheat (L.);; resistance-related genes; functional markers; SNP; EST; KASP

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31371617)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31371617).

10.3724/SP.J.1006.2020.91029

王睿輝, E-mail:wangrh@hebau.edu.cn, Tel: 0312-7528408; 劉桂茹, E-mail: nxlgr@hebau.edu.cn

E-mail: haozhiming0730@hotmail.com

2019-04-08;

2019-09-26;

2019-10-16.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20191015.1444.004.html