Survivin和EphA2蛋白在腦膜瘤組織中的表達(dá)及預(yù)后關(guān)系

蘇 輝，程宏偉，洪文明

在原發(fā)性腦部腫瘤中，約1/5～1/4為腦膜瘤，有部分腦膜瘤表現(xiàn)為惡性腫瘤特點(diǎn)，具有復(fù)發(fā)性、侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)存活素(Survivin)可阻斷執(zhí)行凋亡的蛋白裂解酶Caspases-3等，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和發(fā)展[2]，Survivin的表達(dá)與腦膜瘤的級(jí)別和復(fù)發(fā)是否相關(guān)，能否作為預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和臨床預(yù)后的指標(biāo)目前仍存在爭(zhēng)議[3]。上皮細(xì)胞激酶(epithelial cell kinase，EphA2)是血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)相關(guān)的信號(hào)通路重要蛋白，有研究證實(shí)，抑制消化系統(tǒng)腫瘤[4]、黑色素瘤[5]細(xì)胞中Survivin、EphA2蛋白的表達(dá)可抑制VM形成。Survivin蛋白表達(dá)與腦膜瘤[6]、EphA2蛋白表達(dá)與腦膜瘤[7]的關(guān)系已有文獻(xiàn)報(bào)道，但有關(guān)聯(lián)合檢測(cè)凋亡抑制蛋白Survivin和VM形成中EphA2蛋白在腦膜瘤中的表達(dá)及意義文獻(xiàn)報(bào)道較少。該研究檢測(cè)最近4年里62例不同級(jí)別腦膜瘤患者中Survivin、EphA2蛋白的表達(dá)特點(diǎn)，分析其腦膜瘤預(yù)后中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料62例患者為2014年2月～2018年7月均因進(jìn)行性加重的頭痛等癥狀入住安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，且結(jié)合腦部磁共振診斷為腦膜瘤，手術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。按照WHO腦膜瘤病理分級(jí)，其中34例為Ⅰ級(jí)，17例為Ⅱ級(jí)，11例為Ⅲ級(jí)；患者性別：27例為男性，35例為女性；患者年齡40～77(52.9±13.2)歲?；颊呔鶠槭装l(fā)病例，無(wú)其他較為嚴(yán)重的合并癥?；颊邔?duì)研究均知情同意，并簽署協(xié)議書(shū)。

1.2 主要試劑一抗：羊抗人Survivin多克隆抗體、羊抗人EphA2多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司；免疫組織化學(xué)SP和DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 免疫組化染色及結(jié)果判斷采取免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶法(streptavidin-peroxidase method,SP法)檢測(cè)Survivin、EphA2蛋白表達(dá)，步驟如下。手術(shù)切除腦膜瘤組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，厚4 μm切片，二甲苯脫蠟，微波抗原修復(fù)，3%H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，羊血清封閉抗原。滴加羊抗人多克隆一抗(Survivin，1 ∶200稀釋；EphA2，1 ∶300稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，滴加兔抗羊二抗50 μl；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封固后鏡檢。Survivin、EphA2免疫組化結(jié)果由2名病理科醫(yī)生獨(dú)立判定，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色判定為陽(yáng)性細(xì)胞。按照文獻(xiàn)[8]方法：① 陽(yáng)性染色程度計(jì)分，陰性“-”： 染色較淺，0分；弱陽(yáng)性“+”：呈淺黃色，1分；陽(yáng)性“”：呈黃色，2分；強(qiáng)陽(yáng)性“”：呈棕褐色，3分。② ×200倍顯微鏡下隨機(jī)記錄500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性染色細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比，0～10%，0分；11%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。將Survivin、EphA2蛋白的兩組數(shù)值相加以表示濃度分布評(píng)分( intensity distribution score，IDS)，IDS為0時(shí)，為陰性，將患者以IDS積分分為兩組，低表達(dá)組：0～3分；高表達(dá)組：4～7分。

1.4 Western blot檢測(cè)腦膜瘤組織中Survivin、EphA2蛋白表達(dá)隨機(jī)取手術(shù)切除腦膜瘤組織，每組5例，超低溫冰箱凍存。行蛋白免疫印跡檢查時(shí)，加入蛋白裂解液，將腦膜瘤組織研磨呈粉狀，超聲細(xì)胞破碎儀反復(fù)破碎，離心，BCA 法測(cè)定樣品蛋白濃度。行SDS-PAGE電泳，上樣量為20 μg總蛋白，加入羊抗人多克隆抗體(Survivin，1 ∶2 000稀釋；EphA2，1 ∶2 500稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，次日，二抗孵育，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，曝光，灰度分析采用Image J軟件，以GAPDH為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平采用Survivin、EphA2蛋白和GAPDH比值表示。

2 結(jié)果

2.1 Survivin、EphA2蛋白表達(dá)與腦膜瘤一般情況比較應(yīng)用濃度分布評(píng)分(IDS)比較兩種蛋白表達(dá)與腦膜瘤一般資料情況，低表達(dá)組(0～3分)與高表達(dá)組(4～7分)與患者性別、年齡、飲酒、吸煙、腫瘤部位等差異無(wú)顯著性(表1)。

2.2 Survivin和EphA2蛋白在不同病理分期腦膜瘤組織中的表達(dá)腦膜瘤臨床中主要分為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)，Survivin、EphA2蛋白在不同級(jí)別腦膜瘤組織中的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)圖1、2。隨著病理分級(jí)水平的升高，非參數(shù)秩和檢驗(yàn)相關(guān)分析顯示，Survivin和EphA2蛋白在腦膜瘤組織中升高，兩組呈正相關(guān)(F=3.627，P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 腦膜瘤患者預(yù)后與Survivin與EphA2蛋白表達(dá)的關(guān)系術(shù)后62例腦膜瘤患者均獲得隨訪，時(shí)間為6～36(12.8±4.6)個(gè)月，統(tǒng)計(jì)不良預(yù)后(復(fù)發(fā)+死亡)患者病例數(shù)；本組不良預(yù)后9例(7例復(fù)發(fā)，2例死亡)，與未復(fù)發(fā)病例的Survivin IDS值(2.09±1.05)、EphA2 IDS值(2.52±1.21)比較，復(fù)發(fā)患者的Survivin IDS值(5.62±1.83)、EphA2 IDS值(5.35±1.72)，兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.361、7.264，P<0.01)，見(jiàn)圖3。提示Survivin IDS值與EphA2 IDS值升高，腦膜瘤患者可能預(yù)后不良。

表1 比較Survivin和EphA2表達(dá)IDS值與腦膜瘤患者一般情況(n)

圖1 腦膜瘤組織中Survivin蛋白表達(dá) ×400

A：腦膜瘤旁正常腦組織(-)表達(dá)；B：Ⅰ級(jí)腦膜瘤組織中(+)表達(dá)；C：Ⅱ級(jí)腦膜瘤組織中()表達(dá)；D：Ⅲ級(jí)腦膜瘤組織中()表達(dá)

圖2 腦膜瘤組織中EphA2蛋白表達(dá) ×400

A：腦膜瘤旁正常腦組織(-)表達(dá)；B：Ⅰ級(jí)腦膜瘤組織中(+)表達(dá)；C：Ⅱ級(jí)腦膜瘤組織中()表達(dá)；D：Ⅲ級(jí)腦膜瘤組織中()表達(dá)

表2 Survivin與EphA2蛋白在不同分期腦膜瘤組織中表達(dá)

圖3 腦膜瘤患者復(fù)發(fā)情況與Survivin與EphA2蛋白表達(dá)IDS值的關(guān)系與未復(fù)發(fā)組比較：**P<0.01

2.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)Survivin和EphA2蛋白在不同分期腦膜瘤中的表達(dá)隨機(jī)選擇5例不同病理分級(jí)腦膜瘤組織，Western blot結(jié)果表明，Ⅰ級(jí)腦膜瘤組織中Survivin和EphA2蛋白的表達(dá)較弱，隨著病理分期升高，Survivin和EphA2蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，見(jiàn)圖4A。由圖像分析可知，與Ⅰ級(jí)腦膜瘤組織比較，高分期的Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)腦膜瘤組織中Survivin /GAPDH和EphA2/GAPDH比值明顯升高，見(jiàn)圖4B。

圖4 蛋白免疫印跡檢測(cè)Survivin和EphA2蛋白在不同分期腦膜瘤組織中的表達(dá)

A：Western blot結(jié)果；B：蛋白半定量統(tǒng)計(jì)圖；1：Ⅰ級(jí)腦膜瘤組織；2：Ⅱ級(jí)腦膜瘤組織；3：Ⅲ級(jí)腦膜瘤組織；與Ⅰ級(jí)腦膜瘤比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

腦膜瘤早期，腫瘤往往生長(zhǎng)緩慢，患者病情隱匿，若有典型的頭疼、癲癇等癥狀時(shí)，病情已為晚期。雖然腦膜瘤惡性程度不高，但其具有侵襲性、異常增殖、術(shù)后患者易復(fù)發(fā)的特征，且腦膜瘤組織中富含血管，常呈結(jié)節(jié)狀嵌入大腦半球中[9]。Caspases-3系具有激活半胱氨酸和裂解底物位點(diǎn)的蛋白裂解酶，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，Survivin 屬于凋亡抑制蛋白家族，功能多樣，參與細(xì)胞凋亡、分裂和老化，Survivin可阻斷Caspases-3蛋白裂解酶，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。研究[11]表明，高表達(dá)Survivin提示腫瘤患者預(yù)后不良或藥物抵抗，而抑制腫瘤細(xì)胞中Survivin表達(dá)可抑制腫瘤增殖，誘導(dǎo)腫瘤凋亡。由此提示Survivin在腦膜瘤細(xì)胞增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮功能。

近年來(lái)的研究[12]表明，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)中常出現(xiàn)VM，中胚層的血管間葉組織代替內(nèi)胚層起源的上皮細(xì)胞，形成腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。腫瘤細(xì)胞的血管生成擬態(tài)是指腫瘤細(xì)胞圍成條管道樣結(jié)構(gòu)，可以模擬血管作用，但沒(méi)有血管內(nèi)皮細(xì)胞形成，在這些無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞管道樣結(jié)構(gòu)中，血液可以在其中流動(dòng)，從而供給腫瘤組織營(yíng)養(yǎng)，故抗新生血管的分子靶向治療成為近年來(lái)抗腫瘤藥物研發(fā)的一個(gè)重要課題。實(shí)體瘤腦膜瘤的生長(zhǎng)過(guò)程需要豐富的血供，血管為其生長(zhǎng)和侵襲提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧，對(duì)腦膜瘤血管新生機(jī)制的研究有望成為有效的減少腦膜瘤復(fù)發(fā)和分子靶向治療的依據(jù)。研究[13]表明，上皮細(xì)胞激酶(EphA2)是VM相關(guān)的信號(hào)通路蛋白，作為受體蛋白酪氨酸激酶，EphA2在血管生成方面起重要的調(diào)節(jié)作用，抑制EphA2的表達(dá)，在臨床治療胰腺癌中已取得一定的療效。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)和蛋白免疫印跡法均證實(shí)EphA2在高級(jí)別的腦膜瘤中表達(dá)更為明顯，與腦膜瘤的復(fù)發(fā)呈正相關(guān)。

該研究由于病例數(shù)，尤其是Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)腦膜瘤較少，在分析中可能會(huì)存在偏倚；同時(shí)，隨訪時(shí)間不夠，有待進(jìn)一步收集病例和延長(zhǎng)隨訪時(shí)間?？傊?，調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)鍵蛋白Survivin以及VM相關(guān)蛋白EphA2在惡性程度較高的Ⅲ級(jí)腦膜瘤中高表達(dá)，兩者聯(lián)合檢測(cè)可作為腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。同時(shí)，該研究發(fā)現(xiàn)Survivin和EphA2蛋白的表達(dá)水平與腦膜瘤患者的預(yù)后有關(guān)，故兩者的深入研究為精準(zhǔn)治療腦膜瘤的提供新的可能，值得進(jìn)一步研究。